Способ экспансии nk-клеток человека с помощью фидерных клеток

Изобретение относится к клеточной биологии и медицине, в частности к способу экспансии NK-клеток, полученных из периферической крови человека. Для осуществления способа сначала выделяют мононуклеарные клетки (МНК) из периферической крови человека методом градиентного центрифугирования. МНК доводят до концентрации 5 млн/мл, засеивают в чашку Петри или культуральный флакон в чистую среду RPMI и инкубируют 60 мин в СО₂-инкубаторе при 37°С и 5% СО₂. После чего неприкрепленные NK-клетки собирают, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин и доводят до нужной концентрации, далее в условиях СО₂-инкубатора в питательной среде RPMI - 1640 с IL-2 - 300 Ед/мл и 10% FBS. Затем осуществляют стимуляцию пролиферации NK-клеток с помощью фидерных клеток, предварительно полученных облучением клеточной линии К562 дозой 100 Гр, в полной ростовой среде RPMI-1640, содержащей IL-2, в условиях СО₂-инкубатора при 37°С и 5% СО₂. Причем фидерные клетки добавляют к NK-клеткам трижды: на 0 сутки культивирования в пропорции 1:1, на 7 сутки - 2:1 и 14 сутки 5-10:1. Каждые 48 ч обновляют питательную среду с добавлением IL-2 - 300 Ед/мл. Фидерные клетки используют сразу после получения или хранения в жидком азоте с криопротектором, состоящим из 10% диметилсульфоксида (DMSO) и 90% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Продолжительность экспансии составляет 21 сутки. Настоящее изобретение позволяет увеличить пролиферативный потенциал NK-клеток in vitro. 7 ил., 3 табл., 6 пр.

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к клеточной биологии и может применяться для экспансии NK-клеток, полученных из периферической крови донора или онкологического больного.

За последнее десятилетие появился огромный интерес к применению адоптивной иммунотерапии NK-клетками для лечения различных видов онкологических заболеваний. В отличие от других иммунных клеток, NK-клетки способны распознавать опухолевые клетки без участия главного комплекса гистосовместимости (MHC) на их мембране, а также антител. Благодаря этому ответ, опосредуемый NK-клетками, очень быстрый. В настоящее время для адоптивной иммунотерапии рака используются различные источники NK-клеток. Они включают аутологичные NK-клетки, аллогенные NK, линии NK-клеток, стволовые клетки, а также генно-инженерные NK. В нескольких клинических исследованиях сообщается, что иммунотерапия на основе NK-клеток является многообещающим методом лечения онкологических заболеваний. Однако прогресс в иммунотерапии рака NK-клетками был незначительным, из-за того, что не удавалось получить достаточное количество NK для адекватной оценки эффективности в доклинических и клинических испытаниях. В связи с разработкой различных методов иммунотерапии, представляется сложным сопоставить различные протоколы культивирования NK-клеток, поскольку они чрезвычайно гетерогенны. Продолжительность культивирования NK-клеток ex vivo колеблется от нескольких часов при быстрой активации NK-клеток до нескольких недель при долгосрочном культивировании. Используются многочисленные исходные компоненты сред с различной долей NK-клеток, комбинации нескольких цитокинов в разных концентрациях, существует проблема старения клеток и апоптоза, связанная с пролиферацией, изучаются методы культивирования NK-клеток в комбинации фидерными клетками, полученными различными способами.

Известна супрессия опухолей с использованием полученных из плаценты человека промежуточных естественных киллерных клеток и иммуномодулирующих соединений (RU 2642988 С2, RU 2742171 С2). Способы предусматривают использования естественных киллерных клеток из перфузата плаценты, естественных киллерных клеток, полученных расщеплением ткани плаценты, или естественных киллерных клеток из другой ткани-источника, для супрессии пролиферации клеток опухоли, лечения вирусной инфекции или лечения злокачественных опухолей, например, злокачественных опухолей клеток крови и/или солидных опухолей. В конкретных вариантах осуществления клетки используют в сочетании с иммуномодулирующим соединением (IMiDs, Celgene Corporation) или талидомидом. NK-клетки можно выделять или обогащать посредством окрашивания клеток из ткани-источника, использовать коммерческие наборы для выделения NK-клеток (Miltenyi Biotec), или использовать антитела против клеток, не относящихся к NK-клеткам (н-р, CD3, CD14, CD36, CDw123, HLA класса II DR,DP и CD235a (гликофорин A). В качестве фидерных клеток добавляли клетки K562 и обработанные митомицином C аллогенные PBMC, что является токсичным для клеток. NK-клетки культивировали в течение 5-6 суток при 37°C в 5% CO-₂, через 5-6 суток и затем каждые 3-4 суток в культуру добавляли равный объем поддерживающей среды (IMDM с 10% FCS, 2% сывороткой AB человека, антибиотиками, L-глутамином и IL-2 - 400 Ед/мл), NK-клетки собирали на 21 сутки.

Однако метод предусматривает необходимость использования токсичного для клеток компонента: митомицина C и антител или дорогостоящих коммерческих наборов для выделения NK-клеток, что делает данный способ материальнозатратным.

Известен способ инактивации опухолевых клеток (Исмаил-заде Р.С. и др. «Ингибирующее действие гипертермии на опухолевые клетки in vitro», Медицинский журнал, 2005, № 3, с. 61-63). В публикации описано изучение влияния гипертермии на пролиферативную активность опухолевых клеток, в том числе К562, а также их чувствительность к цитотоксическому действию МНК периферической крови доноров. Показано, что гипертермическая обработка (+42°С, 120 мин) повышает чувствительность клеток линии К562 к цитотоксичности МНК.

Однако в данном методе показано, что гипертермическая обработка не приводит к снижению пролиферативной активности клеток линии К562, что является недопустимым для получения фидерных клеток.

Известен способ стимуляции и активации лимфоцитов (CN 1556854 A), в котором описывается увеличение их количества. Настоящее изобретение в целом относится к способам стимуляции пролиферации и активации Т-клеток.

Однако метод направлен именно на получение и активацию CD8+ Т-клеток, с помощью IL-2 и антител к CD3 и/или CD23, что существенно отличается от предлагаемого нами способа.

Известен способ стимуляции и активации лимфоцитов с фидерными клетками (генномодифицированные К562 или, предварительно обработанные митомицином С или облученные гамма-излучением в дозе 100Гр, нормальные К562 или фибробласты) с целью увеличения их количества (CN 105624107 A). В нем изучается культивирование мононуклеарных клеток, которые могут содержать NK-клетки (не более 5%).

Однако, метод направлен именно на получение и активацию Т- и NKT-клеток. Клетки активируют с помощью добавления ИФН-гамма, золедроновой кислоты, антител CD3, IL-2, IL-15, IL-18, что делает данный способ существенно материально затратным.

Известен способ увеличения пролиферативного уровня лимфоцитов (CN 107502589 A).

Однако данный патент отличается от предлагаемого нами способа тем, что NK-клетки предварительно не выделяли и мононуклеарные клетки культивировали с клетками инфильтрирующие опухоль, которые предварительно экстрагировали из плевральной и асцитной жидкости или опухолевых тканей пациента. Клетки культивировали в бессывороточной среде, содержащей комбинацию цитокинов IL-2, IL-12, анти-CD28 и анти-CTLA-4, в соотношении инфильтрирующих клеток к мононуклеарам от 1:1 до 1:20.

Известен способ облучения замороженных фидерных клеток с помощью гамма-излучения (US 200622183 A1). Главным отличием данного способа является то, что в качестве фидера - клеточную линию К562 не изучали, а питающие клетки облучали дозой не более 60Гр. В известном способе подвергают облучению клетки именно в замороженном виде (т.е. с помощью криопротектора в жидком азоте), что делает исследуемые клетки митотически некомпетентными. Недостатком способа на наш взгляд, является то, что замороженные клетки требуют дополнительной упаковки в измельченный сухой лед, и должны быть доставлены аккуратно, не допустив оттаивания для последующего облучения. Криопротектор - является токсичным раствором для клеток, требующий немедленной отмывки после оттаивания, поэтому существует риск гибели клеток при незапланированном оттаивании при транспортировке клеток и облучении.

Известен способ, в котором обработка фидерных клеток проводится с помощью митомицина С (CN 111424012 A).

Однако, митомицин С - является токсичным веществом для клеток.

Известны способы, в которых культивируют мононуклеарные клетки совместно с фидерными клетками, экспрессирующими OX40L (лиганд CD134) предварительно облученные дозой 50-300 Гр в среде содержащей IL-2, IL-15, IL-21, Flt3-L, IL-7, IL-12 или IL-18 (KR 20190135912 A, KR 2019231243 A).

Недостатком известных способов является сложность получения питающих клеток, экспрессирующих OX40L, т.е. они трансформируются вектором экспрессии, в который вставлен ген OX40L, а высокие дозы облучения (более 100 Гр) могут привести к 100% клеточной гибели. Метод является материальнозатратным, так как для культивирования клеток использовали среду, содержащую дорогостоящие цитокины.

Известен способ получения фидерных клеток, где питающие клетки K562, предварительно замораживают с криопротектором и выдержаны в течение ночи при -80°C, затем вымораживают в предварительно охлажденной сублимационной сушилке до полного испарения раствора для криоконсервации (CN 109628398 A).

Главным недостатком данного метода - является влияние токсического действия криопротектора на клетки в процессе сушки.

Известна публикация Вашкевича Е.П. и др. «Экспансия и активация естественных киллерных клеток человека ex vivo в присутствии трансгенных фидерных клеточных линий», журн. Цитология, 2020, Т. 62(4), с. 258-265. Преимуществом данного способа является: отсутствие применения дорогостоящих наборов для селекции NK-клеток, дорогостоящих питательных сред и добавок.

Однако данный способ усложнен получением генетически-модифицированных фидерных клеток, на основе К562, т.к. их получают методом трансдукции лентивирусными частицами.

Известен способ стимуляции экспансии NK-клеток посредством комбинации инактивированных питающих клеток и клеточных факторов (CN 109576220 A). Мононуклеарные клетки периферической крови культивировали с фидерными клетками в соотношении 1:1 в среде, содержащей 10% аутологичной плазмы, IL-2-800 Ед/мл, CD16mAb-600 нг/мл, CD3mAb-20 нг/мл. Главным отличием данного способа является способ получения фидерных клеток путем инкубации клеток К562 в хлорноватистой кислоте, что вызывает окислительную гибель питающих клеток и приводит к инактивации клеток. Преимуществом данного метода инактивационной обработки имеет низкие требования к оборудованию и простой процесс эксплуатации.

Однако недостатком известного способа является применение токсичного вещества для клеток, которые предполагается использовать в протоколах культивирования NK-клеток для лечения больных.

Самым близким (прототипом) является способ получения высокоэффективного реагента для пролиферации NK-клеток периферической крови (естественных киллеров) in vitro (CN 109486758 A). Мононуклеарные клетки культивируют совместно с K562 (предварительно инактивированные гамма-излучением в дозе 100 Гр), в среде содержащей антитела: CD52, CD16, CD3, CD56 и IL-2. Преимущество данного способа заключается в том, что чистота полученных NK-клеток может достигать более 90%. При определении цитотоксической активности была показана эффективность до 80% при соотношении 10:1 (NK-клетки:K562).

Однако существует необходимость применения ряда антител, способствующих пролиферации NK-клеток и подавляющих рост других клеток, содержащихся в культуре мононуклеарных клеток ( Т-, В-лимфоциты, моноциты и гранулоциты), что делает данный способ дорогостоящим.

Техническим решением является увеличение пролиферативного потенциала NK-клеток in vitro с использованием фидерных клеток, не прибегая к методу трансдукции и использованию наборов для магнитной селекции NK-клеток, без использования дорогостоящих цитокинов и антител, а также токсичных веществ для получения фидерных клеток, и дорогостоящих криопротекторов для заморозки клеток.

Указанные технические и лечебные результаты при осуществлении изобретения достигаются за счет того, что также как в известном способе мононуклеарные клетки (МНК), выделяют из периферической крови человека методом градиентного центрифугирования, стимуляцию пролиферации NK-клеток осуществляют с помощью фидерных клеток, предварительно полученных облучением клеточной линии К562 дозой 100 Гр, в полной ростовой среде RPMI-1640, содержащей IL-2, в условиях СО₂-инкубатора при 37°С и 5% СО₂, продолжительность экспансии составляет 21 сутки.

Особенность заявляемого способа заключается в том, что МНК доводят до концентрации 5 млн/мл, засеивают в чашку Петри или культуральный флакон в чистую среду RPMI и инкубируют 60 минут в СО₂-инкубаторе при 37°С и 5% СО₂, после чего неприкрепленные NK-клетки собирают, центрифугируют при 1000 оборотов/мин в течение 5 минут и доводят до нужной концентрации, далее в условиях СО₂-инкубатора в питательной среде RPMI - 1640 с IL-2 - 300 Ед/мл и 10% FBS полученные NK-клетки культивируют совместно с фидерными клетками, причем фидерные клетки добавляют к NK-клеткам трижды: на 0 сутки культивирования в пропорции 1:1, на 7 сутки - 2:1 и 14 сутки 5-10:1, каждые 48 часов обновляют питательную среду с добавлением IL-2 - 300 Ед/мл, фидерные клетки использовать сразу после получения или хранения в жидком азоте с криопротектором, состоящим из 10% Диметилсульфоксида (DMSO) и 90% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).

Изобретение поясняется подробным описание, примерами выполнения, таблицами и иллюстрациями, на которых изображено:

Фиг. 1 - Инкубация МНК в чашке Петри.

Фиг. 2 - Инкубация МНК в культуральном флаконе.

Фиг. 3 - График зависимости жизнеспособности К562 по дням наблюдения после облучения.

Фиг. 4 - Культивирование NK-клеток с фидером в СО₂-инкубаторе.

Фиг. 5 - NK-клетки донора в сочетании с фидерными, 17 сутки культивирования. Увеличение х 400 раз.

Фиг. 6 - Проточная цитометрия, NK-клетки после выделения из МНК (Q4-1): а)dotplot CD56/CD16; б) dot plot CD3/CD56; в) иерархия гейтированных популяций.

Фиг. 7. Проточная цитометрия, мертвые фидерные клетки (P5) после культивирования с NK-клетками на 21 сутки: а) dotplot SSC/CD45; б)К562 с инициированным апоптозом ; в) иерархия гейтированных популяций.

Способ экспансии NK-клеток человека с помощью фидерных клеток осуществляют в несколько этапов.

I. Выделение NK-клеток.

Из периферической крови (гепаринизированной венозной крови) онкологического больного или донора в стерильных условиях выделяют мононуклеарные клетки (МНК) на градиенте плотности фиколла (ρ=1,077) путем центрифугирования при 400 G, далее дважды отмывают фосфатно-солевым буфером (pH=7,4). Полученные МНК доводят до концентрации 5 млн/мл и засеивают в чашку Петри или культуральный флакон в чистую среду RPMI без дополнительных добавок и инкубируют 60 минут в СО₂-инкубаторе (37°С, 5% СО₂). Далее, неприкрепленные клетки (суспензионные) собирают, центрифугируют при 1000 оборотов/мин в течение 5 минут и доводят до нужной концентрации.

II. Получение фидерных клеток.

Для экспансии суспензионной клеточной линии K562 (после процедуры разморозки) клетки культивируют в концентрации 1 млн/мл в полной питательной среде RPMI-1640 с добавлением эмбриональной телячьей сыворотки 10% в 24 луночном планшете или в культуральном флаконе в условиях СО₂-инкубатора (37°C, 5% СО₂). Каждый день проводят морфологическую оценку культуры клеток, каждые 48 ч. - меняют питательную среду и подсчитывают количество клеток с определением уровня жизнеспособности. Облучение клеток К562 проводят электронами на установке Philips SL-20, энергия пучка 6 МэВ. Перед облучением клетки из культурального флакона переносят в пластиковую баночку (или флакон) с завинчивающейся крышкой в 10 мл ростовой среды в количестве 1-10 млн. и облучают однократно дозой 100 Гр в течение 25 минут. Далее клетки отмывают фосфатно-солевым буфером (pH=7,4) или средой RPMI, центрифугируют при 1000 оборотов/мин в течение 5 минут. Далее, для дальнейшего использования в качестве питающих клеток их замораживают.

III. Заморозка фидерных клеток в жидком азоте.

Для заморозки используют криопротектор, состоящий из 10% Диметилсульфоксида (DMSO) и 90% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Клетки замораживают в количестве 1-10 млн. клеток в 1 мл криопротектора. Сначала выдерживают аликвоту с клетками с криопротектором 30 мин в морозильной камере при -30°С и далее перекладывают в дюар с жидким азотом.

VI. Культивирование NK-клеток с фидерными-клетками.

Культивирование выделенных NK-клеток совместно с фидерными клетками проводят в течение 21 суток в пластиковых флаконах с вентилируемой крышкой или 6-луночных планшетах в условиях СО₂-инкубатора в питательной среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия) с IL-2 - 300 Ед/мл и 10% FBS. Через каждые 48 часов питательную среду обновляют, добавляют IL-2 - 300 Ед/мл и ежедневно оценивают морфологию клеток. Фидерные клетки добавляют к NK-клеткам на 0 сутки культивирования в пропорции 1:1, на 7 сутки - 2:1 и 14 сутки 5-10:1. Окончание культивирования на 21 сутки.

V. Подсчет клеток.

Жизнеспособность культивируемых клеток определяют методом подсчета в камере Горяева с помощью 0,1-0,4% раствора Трипанового синего, пересчитывают в процентном соотношении долю окрашенных (мертвых) к общему количеству клеток. Индекс пролиферации (ИП) клеток определяют по формуле:

ИП=Х_n+1/Х_n, где:

Х_n - это общее исходное число посеянных для каждой группы клеток,

Х _n+1 - это общее число выращенных для каждой группы клеток.

VI. Иммуноферментный анализ (ИФА).

Супернатанты собирают путем осаждения культивируемых клеток центрифугированием при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Полученные образцы хранят в морозильной камере при -30°С. Для определения функциональной активности клеток, измеряют концентрацию противоопухолевых цитокинов (TNFα и IFNγ). Инкубацию проводят с помощью наборов реагентов для ИФА (н-р, «Вектор Бест») по инструкции фирмы производителя.

Примеры исполнения способа.

Пример 1 - Выделение NK-клеток.

Из гепаринизированной венозной крови онкологического больного или донора в стерильных условиях выделяли мононуклеары на градиенте плотности фиколла (ρ=1,077) путем центрифугирования при 400 G, далее дважды отмывали фосфатно-солевым буфером (pH=7,4) и доводили до нужной концентрации. Полученные МНК доводили до концентрации 5 млн/мл, засеивали в чашку Петри (Фиг.1) или культуральный флакон (Фиг.2) в чистой среде RPMI и инкубировали 60 минут в СО₂-инкубаторе (37°С, 5% СО₂). Далее собирали неприкрепленные клетки, центрифугировали 1000 оборотов/мин в течение 5 минут и доводили до нужной концентрации. Часть клеток отдавали на фенотипирование, с целью определения чистоты выделения NK-клеток.

Пример 2 - Получение фидерных клеток.

После культивирования размороженных К562 получали необходимое количество клеток для экспериментов, уровень жизнеспособности достигал 99,7%, а уровень пролиферации за 2 недели культивирования до 30 раз. Для облучения использовали клетки К562 с жизнеспособностью не ниже 80%, которые помещали в стерильные флаконы с завинчивающейся крышкой в 10 мл ростовой среды в количестве до 10 млн. Клетки переносили в три флакона и делили на три группы. Первая - контроль, вторая - фракционированный способ облучения: два раза по 50 Гр с перерывом в 20 минут, третья - однократно в дозе 100 Гр в течение 25 минут. После облучения клетки отмывали и переносили в новую культуральную среду. Дальнейшие наблюдения за клетками в течение недели показали (Фиг.3), что через сутки после однократного облучения клеточной линии количество живых фидерных клеток снижалось до 64,8±14,8%, а при фракционированном способе облучения, т.е. двукратно дозой 50 Гр. с перерывом в - до 65,1±12,0%. На 3 сутки после однократного облучения количество живых фидерных клеток снижалось до 59,6±19,5%, а при фракционированном - до 52,9±10,3. На 7 сутки после однократного облучения количество живых фидерных клеток снижалось до 41,8±20,9; при фракционированном - до 46,1±13,9%. После однократного облучения дозой 100 Гр в течение следующих 7 суток культивирования фидерные клетки не пролиферировали. В группе с фракционированным облучением наблюдалась незначительная пролиферация клеток, относительно крупы контроля. На 7 сутки культивирования фидерных клеток уровень жизнеспособности был ниже, чем в группе контроля, при фракционированном облучении составил - 46,1%, при однократном - 41,8%, что было меньше на 11,8% и на 16,1% соответственно.

Пример 3 - Изучение криопротекторов для заморозки клеток в жидком азоте.

В качестве криопротекторов на клеточной линии К562 изучались следующие:

- готовая среда для заморозки клеток - bambanker (Lymphotec Inc., Japan);

- готовая среда для заморозки - Recovery cell culture Freezing Medium (gibco, USA);

- приготовленная среда, состоящая из 10% Диметилсульфоксида (DMSO) и 90% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS):

- приготовленная среда, состоящая из 10% DMSO и 90% ростовой среды RPMI, содержащей 40% FBS.

Клетки замораживали по 3 млн. в каждой аликвоте в 4 разных криопротекторах, размораживали одномоментно и определяли уровень жизнеспособности клеток в 4 группах с помощью красителя Трипанового синего. Проведен подсчет живых и мертвых клеток до заморозки (разными криопротекторами) и после разморозки (Табл. 1).

Таблица 1 Жизнеспособность клеток К562 при заморозке с криопротекторами
криопротектор	до заморозки, %	после разморозки, %	уровень снижения жизнеспособности клеток после разморозки, %
bambanker (Lymphotec Inc., Japan)	97,4±2,3	73,3±2,6	24,1±1,5
Recovery cell culture Freezing Medium (gibco, USA)	97,4±2,3	67,5±9,5	29,9±8,5
DMSO+FBS (10%+90%)	97,4±2,3	91,4±1,6	6,1±0,9
DMSO+RPMI+FBS (10%+90%(40%))	97,4±2,3	85,7±2,9	11,8±1,4

Наиболее оптимальным является приготовленный криопротектор: DMSO+FBS (10%+90%), так как после разморозки аликвот, был выявлен наиболее высокий процент живых клеток К562 - 91,4±1,6, т.е. он является менее токсичным.

Пример 4 - Культивирование NK-клеток с фидером.

Культивирование выделенных NK-клеток совместно с фидерными клетками проводили до 21 суток в пластиковых флаконах с вентилируемой крышкой или 6-луночных планшетах в условиях СО₂-инкубатора в питательной среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия) с IL-2 - 300 Ед/мл и 10% FBS (Фиг.4). Через каждые 48 часов обновляли питательную среду, добавляли IL-2 - 300 Ед/мл, ежедневно оценивали морфологию клеток (Фиг.5). Фидерные клетки добавляли к NK-клеткам на 0, 7 и 14 сутки культивирования, изучали соотношения: 1:1, 1:3, 1:5, 1:6, 1:8, 2:1, 5:1 (Фидер:NK). На 7, 14 и 21 дни культивирования отбирали собирали и замораживали супернатант для ИФА. В контрольной группе проводили культивирование NK-клеток в планшетах в условиях СО₂-инкубатора в такой же питательной среде RPMI 1640 (ПанЭко, Россия) с IL-2 - 300 Ед/мл и 10% FBS, но без добавления фидера. Через каждые 48 часов обновляли питательную среду, добавляли IL-2 - 300 Ед/мл, ежедневно оценивали морфологию клеток, перед пересадкой собирали супернатант для ИФА.

В контрольной группе без фидера на 3 сутки культивирования NK-клетки росли достаточно хорошо, пролиферировали. Однако далее они начинали уходить в апоптоз, уровень жизнеспособности клеток снижался уже на 7 сутки до 70%. Таким образом, NK-клетки без фидера удавалось культивировать не более 10-14 суток.

Экспериментальным путем выбрано следующее соотношение фидера к NK-клеткам: 1:1 (0 сутки), 2:1 (7 сутки); 5:1 (14 сутки). Данная схема культивирования позволяет нарастить наибольшее количество активированных NK-клеток на 21 сутки культивирования. Соотношения: 1:3, 1:5, 1:6, 1:8 (фидер:NK-клетки) не приводили к пролиферации NK-клеток, а соотношения: 2:1, 5:1 в начале первой недели культивирования приводили к апоптозу NK-клеток. Первые 7 суток культивирования NK-клетки нельзя пересаживать, можно только менять среду.

Ежедневное наблюдение за клетками показало, что после добавления фидерных клеток в подобранных концентрациях на 0, 7 и 14 сутки, NK-клетки начинали увеличиваться в размерах и пролиферировать уже на 3 сутки и постепенно уничтожать фидерные клетки. Фидерные клетки уничтожались NK-клетками, после чего в значительной степени погибали, на 7 сутки мертвые фидерные клетки составляли - 54,4%, на 14 сутки - 74,1%, на 21 сутки 81,3%.

Пример 5 - Имуноферментный анализ (ИФА).

В супернатантах, полученных на этапах совместного культивирования с фидерными клетками на 7, 14 и 21 сутки, для определения функциональной активности клеток, измеряли концентрации противоопухолевых цитокинов (TNFα и IFNγ). Инкубацию проводили с помощью наборов реагентов «Вектор Бест» по инструкции фирмы производителя. В контрольной группе, где NK-клетки культивировались без фидера, содержание TNFα и IFNγ в супернатантах выявлено в следовых количествах на 7 и 14 сутки (Табл. 2).

Таблица 2 Результаты ИФА после культивирования NK-клеток с фидером.
цитокин	супернатант	7 сутки	14 сутки	21 сутки
TNFα	Образцы (NK+фидер)	21	40	86
Контроль (NK без фидера)	4	2	-
IFNγ	Образцы (NK+фидер)	245	360	534
Контроль (NK без фидера)	10	2	-

При культивировании NK-клеток с фидером можно отметить увеличение концентраций TNFα и IFNγ в супернатантах уже на 7 сутки, относительно группы контроля, что указывает на активацию NK-клеток. На 21 суткам в образцах с фидерными клетками можно отметить увеличение концентрации TNFα в 4 раза и IFNγ в 2,2 раза относительно 7 суток.

Пример 6 - Проточная цитометрия.

Фенотипирование флуоресцентно меченых клеток проводили на цитофлуориметре FACScanto II (Becton Dickinson, США). Оценивали субпопуляционный состав лимфоцитов (Т-, NK-лимфоциты). В клеточной суспензии: NK+фидерные клетки, методом исключения CD45+ определять процентное содержание K562. Для оценки чистоты выделения NK-клеток из МНК проводили цитофлуориметрический анализ с использованием CD45(лимфоциты), CD14 (моноциты), CD3 (Т-лимфоциты), комбинации CD16 и CD56 (NK-клетки). Субпопуляционный состав клеточной суспензии после культивирования NK-клеток с фидером, определяли на 7, 14 и 21 сутки.

Для фенотипирования лимфоциты отмывали фосфатно-солевым буферным раствором (ФСБ) и окрашивали конъюгированными с РЕ или FITC антителами, которые связываются с антигенами клеточной поверхности, к CD3, CD4, CD14, CD16, CD45, CD56 (Beckman Coulter и Becton Dickinson, США) по инструкции. Обработку полученных результатов проводили с помощью программы «BD FacsDiva 6-0».

Для подсчета живых и мертвых клеток пользовались методом проточной цитометрии, основанного на двойном флуоресцентном окрашивании клеток аннексином V-AF488 (зеленая флюоресценция) - для оценки доли апоптотических клеток и пропидия иодидом (PI) (красная флуоресценция мертвых клеток). Окрашивание и инкубацию клеток с красителями, проводили по инструкции производителя.

Метод проточной цитометрии показал, что при выделении NK-клеток путем удаления адгезированных клеток, чистота выделения CD56⁺CD16⁺ составляла 62% (Фиг. 6а, б, в). Отмечено увеличение содержания NK-клеток на 7, 14 и 21 и снижение количества Т-лимфоцитов к 14 суткам в 2 раза (Таблица 3). Процент гибели фидерных клеток значительно снижался к 21 суткам культивирования и составлял 81,3±6,6% (Фиг. 7а, б, в).

Таблица 3 Результаты фенотипирования культуры
Показатель	0 сутки	7 сутки	14 сутки	21 сутки
CD45+ (лимфоциты), %	-	55,4±12,8	60,6±21,9	58,1±14
Т-лимфоциты (CD3+)	56,9±24,9	44,2±18,1	26,4±20,4	36,8±11,9
NK-клетки (CD16+CD56+CD3-)	22,6±19,2	49,9±17	60,8±13,8	52,8±9
Живые NK-клетки, %	99,5±0,6	88,5±2	71±28,9	59,4±37,2
К562, % (100%-CD45+)	-	37,7±10,8	39,4±21,9	42±14
Мертвые К562, %	-	54,4±18,3	74,1±1	81,3±6,6

Использование заявляемого способа позволяет:

- получить NK-клетки без использования наборов для магнитной селекции и антител для подавления роста Т-, В-лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов;

- увеличить количество NK-клеток за 21 сутки до 8 раз, при этом процент гибели фидерных клеток in vitro к 21 суткам составляет не менее 80%;

- длительное хранение фидерных клеток в жидком азоте, используемых для активации и пролиферации NK-клеток;

- сохранить уровень жизнеспособности клеток после разморозки более 90%, так как снижение жизнеспособности клеток не превышает 7% после разморозки.

Способ экспансии NK-клеток человека с помощью фидерных клеток, включающий выделение мононуклеарных клеток (МНК), из периферической крови человека методом градиентного центрифугирования, стимуляцию пролиферации NK-клеток осуществляют с помощью фидерных клеток, предварительно полученных облучением клеточной линии К562 дозой 100 Гр, в полной ростовой среде RPMI-1640, содержащей IL-2, в условиях СО₂-инкубатора при 37°С и 5% СО₂, продолжительность экспансии составляет 21 сутки, отличающийся тем, что МНК доводят до концентрации 5 млн/мл, засеивают в чашку Петри или культуральный флакон в чистую среду RPMI и инкубируют 60 мин в СО₂-инкубаторе при 37°С и 5% СО₂, после чего неприкрепленные NK-клетки собирают, центрифугируют при 1000 об/мин в течение 5 мин и доводят до нужной концентрации, далее в условиях СО₂-инкубатора в питательной среде RPMI - 1640 с IL-2 - 300 Ед/мл и 10% FBS полученные NK-клетки культивируют совместно с фидерными клетками, причем фидерные клетки добавляют к NK-клеткам трижды: на 0 сутки культивирования в пропорции 1:1, на 7 сутки - 2:1 и 14 сутки 5-10:1, каждые 48 ч обновляют питательную среду с добавлением IL-2 - 300 Ед/мл, фидерные клетки использовать сразу после получения или хранения в жидком азоте с криопротектором, состоящим из 10% диметилсульфоксида (DMSO) и 90% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS).