Реассортантный штамм вируса гриппа а/17/ньюкасл/2018/22 (h3n2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей

Изобретение относится к медицинской вирусологии. Предложен вакцинный штамм А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) - реассортант, полученный путем скрещивания эпидемического вируса А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2) (А/Южная Австралия/34/2019-подобный) с холодоадаптированным температурочувствительным вирусом А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) -донором аттенуации, безвредным для людей. Предложенный штамм может быть использован для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. 1 ил., 5 табл.

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано в здравоохранении для профилактики заболеваемости гриппом среди взрослых и детей с помощью живой гриппозной интраназальной вакцины из штамма А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) вируса гриппа А, семейства Orthomyxoviridae, рода Influenzavirus А.

В сентябре 2019 Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) рекомендовала заменить А (H3N2)-компонент в составе противогриппозных вакцин для Южного полушария на 2020 гг.эпидемический сезон на А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2)-подобные вирусы [WHO. Recommended composition of influenza virus vaccines for use in the 2020 southern hemisphere influenza season. 27 September 2019. https://www.who.int/influenza/vaccines/virus/recommendations/2020_south/en/]. Выбранный для подготовки гриппозных вакцин штамм А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2) является антигенно родственным рекомендованному ВОЗ вирусу гриппа А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2).

В результате появления в циркуляции нового эпидемического штамма вируса гриппа А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2), известный вакцинный штамм А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) - прототип [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Баженова Е.А., Ларионова Н.В., Киселева И.В., Котомина Т.С., Исакова-Сивак И.Н., Руденко Л.Г. Вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Канзас/2017/631 (H3N2) для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей. Патент РФ №2732610 от 20.09.2020 - Опубл. БИ 2020. - №27] - утратил антигенную актуальность и вследствие этого не может вызвать защитную реакцию во время эпидемии, вызванной А/Южная Австралия/34/2019-подобными штаммами вируса гриппа.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение антигенно актуального вакцинного штамма для взрослых и для детей на основе холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и нового эпидемического А/Южная Австралия/34/2019-подобного вируса А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2).

Применяемые в настоящее время штаммы для живых гриппозных вакцин получают методом генетической реассортации эпидемически актуальных вирусов с холодоадаптированными штаммами - донорами аттенуации [Shcherbik, S.; Pearce, N.; Kiseleva, L; Larionova, N.; Rudenko, L.; Xu, X.; Wentworth, D.E.; Bousse, T. Implementation of new approaches for generating conventional reassortants for live attenuated influenza vaccine based on Russian master donor viruses. J Virol Methods 2016, 227, 33-39, doi: 10.1016/j.jviromet.2015.10.009].

Донор аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) - холодоадаптированный (са) и температурочувствительный (ts) штамм вируса гриппа - разрешен для получения безвредных живых интраназальных вакцин для взрослых и детей [Александрова Г.И. Новое в эпидемиологии и профилактике вирусных инфекций. Л. Д968. - С. 66-83].

Цель реассортации - получить штамм с вакцинной формулой генома 6:2. Гены, кодирующие поверхностные белки вируса гриппа гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA), наследуются от антигенно актуального циркулирующего эпидемического штамма, а шесть генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), от безвредного донора аттенуации.

Получение вакцинного штамма.

Вакцинный штамм А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) получен методом генетической реассортации эпидемического вируса А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2) с донором аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) путем одновременного инфицирования развивающихся куриных эмбрионов (РКЭ) смесью родительских вирусов в эквивалентных инфекционных дозах, с последующей селекцией клонов с заданными свойствами при пониженной до 26°С температуре инкубации в присутствии кроличьей антисыворотки к донору аттенуации. Клоны дополнительно очищены тремя последовательными клонированием методом предельных разведений в присутствии антисыворотки к донору при пониженной (26°С) и оптимальной (32°С) температурах инкубации. Чистый клон проверен по фенотипическим характеристикам (ts- и ca-фенотип) и по формуле генома на соответствие вакцинному штамму.

Антигенная характеристика вакцинного штамма.

Изучение антигенных свойств вакцинного штамма А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) показало, что:

- ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - гемагглютинин (НА) - в перекрестной постановке РТГА с гомологичными сыворотками антигенно идентичен эпидемическому вирусу А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2), поскольку показатели взаимодействия реассортанта А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) и родительского штамма А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2) с крысиными антисыворотками, полученными к вирусу А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2) и вакцинному штамму А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) полностью совпадали (табл. 1). Кроме того, перекрестная постановка РТГА с вирусами А/Южная Австралия/34/2019 (H3N2), А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2) и А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) в качестве антигенов с соответствующими гипериммунными крысиными сыворотками подтвердила близкое антигенное родство этих вирусов (табл. 1).

- второй ответственный за антигенную специфичность поверхностный белок вакцинного штамма - нейраминидаза (NA) - проверен методом секвенирования последовательности сегмента генома. Сегмент генома идентичен соответствующему сегменту вируса А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2), из чего следует антигенная идентичность белков.

Для анализа состава генома полученных реассортантов использовали метод пиросеквенирования ДНК копий генов, аналогичный описанному [Степанова Е.А., Крутикова Е.В., Киселева И.В., Руденко Л.Г. Разработка протокола пиросеквенирования для анализа происхождения генов реассортантов при подготовке штаммов живой гриппозной вакцины // «Молекулярная генетика, микробиология и вирусология» - №2. - 2018. - с. 101-107] с использованием комплекта высокоспецифичных олигонуклео-тидов, разработанных в программе PSQ Assay Design для анализа генома современных штаммов подтипа H3N2 и донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2).

Формула генома 6:2 соответствует требованиям, предъявляемым к штаммам живой гриппозной вакцины: гены, кодирующие поверхностные белки гемагглютинин (НА) и нейраминидазу (NA) принадлежат эпидемическому родительскому вирусу А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2), гены, кодирующие внутренние белки (РВ2, РВ1, PA, NP, М, NS), принадлежат донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты анализа всех генов вакцинного штамма А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) представлены в табл. 2.

Данные, полученные при первичном отборе вакцинного кандидата, были подтверждены полным секвенированием его генома и показали, что вакцинный штамм А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) унаследовал все 6 генов, кодирующих внутренние и неструктурные белки, от донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) (табл. 2).

Полное секвенирование генома вакцинного штамма А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) показало соответствие последовательности всех сегментов генома последовательности соответствующих сегментов вирусов-родителей (табл. 2). Все кодирующие нуклеотидные замены, охарактеризованные для донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) как ответственные за его аттенуацию (табл.3), присутствуют во внутренних генах реассортантного штамма А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2).

Генетическую стабильность кодирующих мутаций вакцинного штамма А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) изучали сравнением сохранности кодирующих мутаций до и после пятикратного пассирования вакцинного штамма, подготовленного на основе донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57, в куриных эмбрионах. Определение последовательности производили с использованием метода пиросеквенирования. Для данного анализа были разработаны специфические праймеры, позволяющие оценивать наличие данных мутаций с использованием пиросеквенатора PyroMark Q24. Праймеры разработаны с использованием компьютерной программы PSQ Assay Design.

На фиг. 1 приведен пример результата пиросеквенирования фрагмента гена РВ1, содержащего аттенуирующую замену G-1795-A, приводящую к замене Val-591-Ile. Чтение нуклеотидов происходит с комплементарной цепи. Присутствие замены характеризуется наличием пика в первой позиции. Фрагмент А - пиросеквенирование гена РВ1 «дикого» варианта вируса, не содержащего замены. Фрагмент Б - пиросеквенирование гена РВ1 донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57. Фрагмент В -пиросеквенирование гена РВ1 вакцинного штамма А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2).

Оценку фенотипических свойств вакцинного штамма А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2), проводили путем его параллельного титрования в РКЭ при разных температурах. Вакцинный штамм А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2), в развивающихся куриных эмбрионах обладает выраженным температурочувствительным и холодоадапти-рованным фенотипом, идентичным фенотипу донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Установлено, что вакцинный вирус является температурочувствительным (ts фенотип) - его инфекционная активность при температуре 40°С составила ≤1.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, и холодоадаптированным (са фенотип) - инфекционная активность при пониженной до 26°С температуре инкубации достигала 5.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл, что свидетельствует о его безвредности для человека, поскольку по этим показателям он идентичен донору аттенуации А/Ленинград/134/17/57 (H2N2). Результаты фенотипического анализа представлены в таблице 4.

Безвредность для мышей. Доклинические исследования острой токсичности вакцинного штамма А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) проводили на белых беспородных мышах в соответствии с Методическими рекомендациями по доклиническим испытаниям новых иммунобиологических препаратов [Методические рекомендации «Доклинические испытания эффективности и безопасности новых иммунобиологических лекарственных препаратов». М.:2010. 39 с.] и с «Правилами надлежащей лабораторной практики» [Правила надлежащей лабораторной практики. Приказ Минздрава РФ №199н от 01.04. 2016. https://cdnimg.rg.ru/pril/130/25/64/43232.pdf]

Мышам вводили однократно одну человеческую дозу, соответствующую 0.5 мл, вакцинного вируса внутрибрюшинно в дозе 7.0 lg ЭИД₅₀/мл. Животным контрольной группы вводили внутрибрюшинно физиологический раствор. Ежедневно в течение всего исследования (7 дней) проводился контроль общего состояния каждого животного.

Данные физиологического исследования (подвижность, поведенческие реакции, кинетика массы тела) показали, что внутрибрюшинное введение вакцинного штамма не вызывало гибели экспериментальных животных (табл. 4) и не приводило к изменению их внешнего вида, поведения, не отражалось на потреблении ими пищи и воды, что свидетельствует о безвредности вакцинного препарата.

В результате проведенных доклинических исследований установлено, что заявляемый вакцинный штамм живой гриппозной вакцины А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) характеризуется сочетанием полезных признаков, необходимых вакцинному штамму: антигенной специфичностью эпидемического вируса А/Ньюкасл/82/2018 (H3N2), структурой генома 6:2, оптимальной для реассортантных вакцинных штаммов, а также характерной для донора аттенуации температурочувствительностью и холодоадаптированностью и безвредностью для лабораторных животных, что коррелирует с аттенуацией для человека.

Таким образом, вакцинный штамм А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) по основным биологическим свойствам, изученным в доклинических экспериментах in vitro и in vivo, соответствует требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам Фармакопейной статьей (ФСП: Р N003224/01-270313) на Ультравак®, вакцину гриппозную аллантоисную живую для интраназального применения для взрослых и для детей.

Полученный штамм А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) депонирован 11.11.2020 года в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздрава России Институт вирусологии им. Д.И. Ивановского (Россия RU, 123098, город Москва, улица Гамалеи, 16) под №2963 и имеет характеристики, представленные в образце паспорте штамма.

Образец паспорта на вакцинный штамм А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) прилагается.

ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА

Инфекционная активность штамма А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) при репродукции в развивающихся куриных эмбрионах при 32°С в течение 48 часов - 8.2 log₁₀ ЭИД₅₀/мл. Гемагглютинирующая активность - 1:1024

Штамм проявляет генетическую стабильность фенотипических признаков после 5 пассажей на куриных эмбрионах (при использовании больших заражающих доз).

Полезным свойством вакцинного штамма вируса гриппа А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) является его пригодность для наработки живой гриппозной вакцины. Предлагаемый по изобретению вакцинный штамм вируса гриппа А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2) может быть использован для профилактики гриппа как у взрослых, так и у детей с трехлетнего возраста.

Реассортантный штамм вируса гриппа А/17/Ньюкасл/2018/22 (H3N2), депонированный в Государственную коллекцию вирусов Института вирусологии им. Д.И. Ивановского ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2963, для производства живой гриппозной интраназальной вакцины для взрослых и для детей.