4-(3-((2-адамантил)амино)-3-оксопроп-1-ен-1-ил)-n-гидроксибензамид - новое средство для лечения болезни альцгеймера

Изобретение относится к 4-(3-((2-адамантил)амино)-3-оксопроп-1-ен-1-ил)-N-гидроксибензамиду формулы I в качестве нейропротекторного соединения, в том числе средства для терапии болезни Альцгеймера. 3 ил., 7 пр.

 

Изобретение относится к созданию и применению 4-(3-((2-адамантил)амино)-3-оксопроп-1-ен-1-ил)-N-гидроксибензамида формулы I в качестве нейропротекторного соединения, в том числе средства для терапии болезни Альцгеймера, проявляющего ингибирующую способность в отношении гистоновой деацетилазы 6 (HDAC6) и препятствующего агрегации патологических форм β-амилоидного пептида.

Повышение уровня жизни людей во всем мире, с одной стороны является положительным показателем, к которому стремится человечество, а с другой стороны также приводит к увеличению среднего возраста людей, а вместе с ним и количеству возраст-зависимых заболеваний. В настоящее время от нейродегенеративных заболеваний страдают около миллиарда человек, а число пациентов с болезнью Альцгеймера и близкими формами деменции оценивается в 30-35 млн. человек и удваивается каждые десять лет [1]. Общемировые затраты на лечение больных с нейропатологиями в 2015 г. составили 818 миллиардов долларов США и могут возрасти до 2 триллионов к 2030 г. [2]. Существующие на сегодняшний день подходы и методы лечения не могут предотвратить или остановить прогрессирование нейродегенеративных заболеваний. Современные нейропротекторные лекарственные препараты могут лишь на некоторое время улучшить состояние больного, оказывая симптоматическое воздействие, улучшая нарушения когнитивных и моторных функций пациента.

В связи с этим первостепенной задачей как современной медицинской химии и фармакологии, так и системе здравоохранения в целом является создание оригинальных лекарственных препаратов для лечения социально-значимых возраст-зависимых заболеваний, в частности нейродегенеративных расстройств.

При нейродегенеративных заболеваниях прогрессирование патологии начинается за много лет до появления первых детектируемых симптомов. Многочисленные исследования в этой области привели к выводу, что среди патологических событий этих заболеваний присутствуют некоторые схожие явления, которые могут объяснить, почему стареющий мозг настолько подвержен нейродегенерации. Изменения в окислительно-восстановительном балансе клетки, в частности, гиперактивация процесса перекисного окисления липидов мембран, нарушение работы эндогенных антиоксидантных механизмов, дисфункция митохондрий (подавление активности комплексов дыхательной цепи) и увеличение пула агрегированных белков с неправильной третичной структурой, главным образом β-амилоида, являются основными факторами развития болезни Альцгеймера [3-5].

В последнее время помимо основных признаков патогенеза данного нейрозаболевания все большее внимание уделяют механизмам эпигенетической регуляции [6]. Эпигенетические изменения обратимы, не затрагивают первичную структуру ДНК и могут успешно поддаваться фармакологической коррекции. Одним из ключевых процессов, играющих решающую роль в изменении структуры хроматина и, как следствие, регулирующих экспрессию генов, выживание клеток и их дифференцировку является деацетилирование белков гистонов, которые совместно с ДНК формируют генетический аппарат клетки [7]. Данный процесс регулируется активностью ферментов гистоновых деацетилаз (HDACs), аберрантная активность и сверхэкспрессия которых наблюдается при нейродегенеративных состояниях. Так, у пациентов с болезнью Альцгеймера выявляется чрезмерная экспрессия фермента HDAC6, что сопровождается аккумуляцией β-амилоида, дегенерацией холинэргических нейронов, и как следствие, тяжелыми когнитивными расстройствами [8]. И поскольку известно, что нейродегенеративные заболевания, в том числе болезнь Альцгеймера, сопровождаются нарушениями в регуляции транскрипции, приводящими к гибели нервных клеток, HDACs считаются весьма перспективными мишенями фармакологической коррекции при лечении нейродегенеративных заболеваний, в том числе и за счет того, что такие эпигенетические модификации являются потенциально обратимыми [9]. На сегодняшний день проведено много исследований по влиянию различных соединений на HDAC, результаты которых показывают, что ингибиторы гистоновых деацетилаз реализуют свой нейропротекторный эффект при лечении болезни Альцгеймера, блокируя продукцию β-амилоида [10, 11], тем самым ингибируя β-амилоид-индуцированное гиперфосфорилирование тау-протеина [12, 13].

Уже более трех десятков лет гидроксамовые кислоты, как ингибиторы гистоновых деацетилаз, являются одним из перспективных классов химических соединений, на основе которых создаются эффективные лекарственные средства, в частности нейропротекторной направленности. К примеру, для гидроксамовой кислоты Вориностат показано улучшение пространственной памяти 20-ти месячных мышей, приводящее одновременно к экспрессии ацетилированных белков-гистонов [14]. Подобная нейропротекторная активность была обнаружена и для пан-селективного ингибитора гистоновой деацетилазы панобиностата [15] и трихостатина А [16]. Применение субероиланилида гидроксамовой кислоты (SAHA) (Рис. 1) в экспериментах на 20-тимесячных мышах с возрастными нарушениями памяти показывает, что данный препарат улучшает пространственную память. При этом у пожилых мышей обнаруживается снижение уровня гистона H4K12ac в гиппокампальной области CA1, в то время как SAHA приводит одновременно к экспрессии ацетилированных гистонов, а также стимулирует активность NMDA-рецепторов в гиппокампе [14]. Особый интерес в лечении нейродегенеративных расстройств представляет селективный ингибитор HDAC6 - Тубастатин А (Рис. 1). Zhang и соавторы показали, что применение Тубастатина А для лечения трансгенных мышей PPswe/PS1 E9 восстанавливает когнитивные нарушения и в сравнении с SAHA является менее токсичным, что может быть объяснено избирательностью его действия только на HDAC6 [17]. Скриптаид, Трихостатин А, Вориностат и некоторые другие соединения на основе гидроксамовой кислоты обладают антиоксидатным потенциалом за счет способности восстанавливать уровень глутатиона [18-20], снижать содержание малонового диальдегида [21] и препятствовать избыточной продукции активных форм кислорода, защищая нейроны от гибели [22, 23]. В то же время, в настоящее время нет препаратов на основе ингибиторов HDAC для терапии болезни Альцгеймера.

Важно отметить, что для ряда гидроксамовых кислот показаны антиагрегационные свойства в отношении патологического β-амилоидного пептида, который считается одной из основных причин нейротоксичности при болезни Альцгеймера [24]. Так, предобработка клеток нейробластомы природным производным гидроксамовой кислоты Дефероксамином снижает нейрональную токсичность, вызванную β-амилоидом, а также уменьшает отложения Аβ и улучшает когнитивные функции трансгенных мышей APP/PS1 [25]. Ингибирование агрегации амилоидного пептида было показано и для Батимастата, что также может являться одним из возможных механизмов нейропротекторного действия гидроксамовых кислот [26]. Использование Энтиностата (Рис. 1) для лечения APP/PS1 трансгенных мышей, моделирующих болезнь Альцгеймера, приводит к усилению активации микроглии и уменьшению отложений β-амилоида [27].

На сегодняшний день перспективным направлением модификаций гидроксамовых кислот является объединение в одной молекуле фрагмента лекарственного средства и гидроксаматной группы, что делает теоретически возможным получение селективных препаратов, обладающих высокой аффинностью к целевому ферменту и способных одновременно воздействовать на ряд других важных молекулярных механизмов патогенеза болезни Альцгеймера [28]. Использование адамантана в качестве фармакофорного фрагмента уже нашло широкое практическое применение при создании лекарственных средств с различной биологической активностью, главным образом, в качестве нейропротекторных агентов. Еще в 2003 году в США и Европе было одобрено использование производного адамантана - мемантина, для симптоматической терапии пациентов с умеренной и тяжелой стадиями болезни Альцгеймера [29, 30]. Кроме того, имеются данные о наличии HDAC-ингибирующей активности для несущих гидроксаматную функцию соединений на основе адамантана [31].

Таким образом, ввиду того, что на сегодняшний день не существует низкомолекулярных лекарственных препаратов, которые могли бы остановить или замедлить прогрессирование болезни Альцгеймера, создание новых соединений, обладающих мультитаргетным действием на молекулярные мишени, участвующие в патогенезе заболевания, является крайне актуальной задачей современной медицинской химии.

Задачей изобретения является создание нового соединения, гидроксамовой кислоты на основе адамантана и ароматического линкера формулы I, проявляющего ингибирующую способность в отношении гистоновой деацетилазы 6 (HDAC6) и препятствующего агрегации патологических форм β-амилоидного пептида, для применения в терапии болезни Альцгеймера.

Технический результат: расширение круга соединений, воздействующих одновременно на несколько ключевых звеньев патогенеза болезни Альцгеймера (процессы, связанные с окислительным стрессом; эпигенетические модификации, в частности, аберрантная активность и экспрессия ферментов гистоновых деацетилаз; патологическую агрегацию β-амилоидных пептидов).

Поставленная задача решается при помощи соединения формулы I

Для получения данного соединения в качестве стартового реагента может быть использован коммерчески доступный 4-карбоксибензальдегид (II). Общий план синтеза соединения формулы I представлен на схеме 1.

На первом этапе может быть осуществлено превращение карбоксильной функции соединения II в соответствующую сложноэфирную под действием хлористого тионила в среде метанола с получением альдегида III. Полученное соединение может вовлекаться в реакцию с малоновой кислотой в присутствии пиридина и пиперидина в условиях кипячения с получением пара-карбоксиметилкоричной кислоты IV, реакция которой с 2-аминоадамантаном и конденсирующим агентом, например, циклоангидридом пропанфосфоновой кислоты (T3P) в среде этилацетата, может привести к образованию амида V. Дальнейшая функционализация сложноэфирной группы при помощи гидроксиламина может дать целевую гидроксамовую кислоту I.

В ходе in vitro испытаний показано, что соединение I проявляет ингибирующую активность в отношении HDAC6 в микромолярном диапазоне концентраций, обладает антиоксидантными свойствами и способностью препятствовать агрегации патологических форм β-амилоидного пептида.

В ходе in vivo серии экспериментов, проведенной на трансгенных мышах линии 5xFAD, моделирующих болезнь Альцгеймера, было показано, что соединение I обладает способностью восстанавливать утраченные когнитивные функции животных и улучшает процессы обучения и формирования долговременной гиппокамп-зависимой пространственной памяти.

Посмертный анализ образцов головного мозга генно-модифицированных мышей, получавших лечение соединением I, выявил способность гидроксамовой кислоты I стимулировать работу цитохромоксидазного комплекса дыхательной цепи, восстанавливая его активность до уровня клинически здоровых животных.

Таким образом, гидроксамовая кислота I является мультитаргетным соединением, воздействующим одновременно на несколько важных мишеней патогенеза болезни Альцгеймера, и может рассматриваться в качестве потенциального фармакологического средства нейропротекторной направленности для терапии болезни Альцгеймера, после проведения всестороннего изучения биологической активности и доклинических испытаний.

Изобретение иллюстрируется следующим примерами:

Пример 1. Метил-4-((E)-3-((2-адамантил)амино)-3-оксопроп-1-ен-1-ил)бензоат

Циклоангидрид пропанфосфоновой кислоты (50%-ный раствор в этилацетате, 10 ммоль) добавили к смеси (E)-3-(4-метоксикарбонилфенил)проп-2-еновой кислоты (4.85 ммоль), 2-аминоадамантана (5.3 ммоль) и пиридина (1.33 мл) в этилацетате (2.7 мл). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 12 часов, после чего была добавлена вода. Выпавший осадок отфильтровали, промыли водой и высушили. Продукт выделяется в виде белого порошка с выходом 88%. Температура плавления 170.9°C.

Спектральные исследования выполнены в Химическом Сервисном Центре коллективного пользования СО РАН. Спектры ЯМР ¹Н и ЯМР ¹³С регистрировали на спектрометре Bruker Avance 300 (¹Н: 300.13 МГц, ¹³С: 75.46 МГц, Bruker Corporation, Billerica, MA, USA), Bruker Avance - III 400 (¹Н: 400.13 МГц и ¹³С: 100.61 МГц, Bruker Corporation, Billerica, MA, USA). Масс-спектры высокого разрешения записывали на спектрометре DFS ThermoScientific в режиме полного сканирования в диапазоне m/z 0-500, ионизация электронным ударом 70 эВ при прямом вводе образца. Температуру плавления определяли на приборе Mettler Toledo FP900 Thermosystem apparatus (Mettler Toledo, Cornellà de Llobregat, Spain).

ЯМР ¹H (400 MHz, CDCl₃) δ 1.51-1.83 (м, 12H), 1.95-2.01 (м, 2H), 3.90 (с, 3H), 4.14-4.22 (м, 1H), 5.95 (д, J = 8.0 Hz, 1H), 6.50 (д, J = 15.5 Hz, 1H), 7.55 (д, J = 8.3 Hz, 2H), 7.62 (д, J = 15.6 Hz, 1H), 7.98-8.04 (м, 2H). ЯМР ¹³C (151 MHz, CDCl₃) δ 26.93, 27.06, 31.76, 31.80, 36.94, 37.33, 52.06, 53.50, 123.60, 127.42, 129.85, 130.49, 139.20, 164.38, 166.44. Найдено m/z 339.1826 (, вычислено m/z 339.1829 для C₂₁H₂₅N₁O₃ [M]⁺).

Пример 2. 4-((E)-3-((2-Адамантил)амино)-3-оксопроп-1-ен-1-ил)-N-гидроксибензамид (соединение I)

Гидроксид калия (11.71 г, 209.1 ммоль) добавили к смеси NH₂OH*HCl (9.8 г, 141 ммоль) в метаноле (50 мл). Полученную смесь перемешивали в течение 30 минут, после чего выпавший осадок отфильтровали, фильтрат добавили к раствору сложного эфира в метаноле (4.1 ммоль в 10 мл). Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов, после чего растворитель отогнали на ротационном испарителе. Остаток в колбе растворили в воде, раствор нейтрализовали концентрированной соляной кислотой до рН 6-7. Выпавший осадок собрали, промыли водой и высушили. Продукт выделяли методом колоночной хроматографии в виде белого порошка, выход составил 50%. Температура плавления 222.5-222.6°C.

ЯМР ¹H (300 МГц, DMSO-d₆) δ 1.53 (д, J = 12.6 Гц, 2H), 1.64 - 1.93 (м, 10H), 2.01 (д, J = 12.8 Гц, 2H), 3.99 (м, 1H), 6.98 (д, J = 15.8 Гц, 1H), 7.43 (д, J = 15.7 Гц, 1H), 7.62 (м, J = 8.0 Гц, 2H), 7.79 (д, J = 8.0 Гц, 2H), 8.01 (д, J = 7.8 Гц, 1H), 9.11 (s, 1H), 11.26 (s, 1H). ЯМР ¹³C (126 МГц, DMSO-d₆) δ 26.79, 26.74, 31.05, 31.65, 36.85, 37.15, 53.07, 124.48, 127.36, 127.47, 133.12, 137.31, 137.80, 163.62, 164.04. Найдено m/z 340.1777 (вычислено m/z 340.1781 для C₂₀H₂₄N₂O₃ [M+H]⁺).

Пример 3. Определение антиоксидантной активности соединения I

Основной мишенью свободных радикалов, гиперпродукция которых наблюдается при болезни Альцгеймера, являются липиды клеточных мембран и мембран органелл. В связи с этим важным свойством для потенциальных нейропротекторов является способность проявлять антиоксидантный потенциал, приводя к нейтрализации активных форм кислорода. Это может быть связано с их ингибирующим действием в отношении процесса перекисного окисления липидов, а также проявлением прямой антирадикальной активности.

В качестве модельной системы для исследования антиоксидантной активности соединения I использовали препарат гомогената головного мозга крысы, содержащий фрагменты клеточных мембран. Для получения гомогената мозга декапитацию заранее наркотизированных СО₂ крыс проводили с помощью гильотины. Мозг гомогенизировали в буфере, содержащем KCl (120 мМ) и HEPES (20 мМ), рН = 7,4 при 4°С и центрифугировали при 1500 об/мин для получения супернатанта. Белок определяли стандартным микробиуретовым методом [32].

Влияние соединения I на перекисное окисление липидов гомогената мозга крысы оценивали с помощью модифицированного ТБК-теста [33], основанного на реакции 2-тиобарбитуровой кислоты с конечным продуктом ПОЛ - малоновым диальдегидом. Для инициации процесса перекисного окисления липидов использовали трет-бутилгидроксипероксид как непосредственный источник свободных радикалов. Лунка планшета, согласно схеме эксперимента, содержала исследуемое соединение в концентрации 100 μМ, гомогенат мозга крысы (2 мг/мл), а также 1,6 мМ трет-бутилгидроксипероксид. После 30 минутной инкубации при 37°С к образцам добавляли ТБК-реактив, инкубировали 90 мин при 90°С и центрифугировали при 6000 об/мин в течение 15 мин. Оптическую плотность отобранного супернатанта измеряли на планшетном анализаторе Victor 3 (Perkin Elmer) при длине волны 540 нм.

Антирадикальную активность тестируемых соединений оценивали с помощью ДФПГ теста [34], основанного на способности антиоксидантов отдавать электрон стабильному хромогенному радикалу 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилу, переводя его в нерадикальную форму и нейтрализуя его активность. Количество восстановленного ДФПГ измеряли с помощью многофункционального планшетного анализатора Cytation™ 3 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) при длине волны 517 нм.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что соединение I обладает антиоксидантными свойствами, подавляя процесс перекисного окисления липидов, инициированный трет-бутилгидроксипероксидом, на 44.59 ± 1.73 %, и проявляет антирадикальные свойства, восстанавливая 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил на 43.34 ± 1.42 %, в концентрации 100 μM.

Пример 4. Исследование ингибирующей активности соединения I в отношении фермента HDAC6

Способность модулировать активность гистоновых деацетилаз является основным критерием, определяющим перспективность соединений класса гидроксамовых кислот в качестве терапевтических агентов [35-37]. При болезни Альцгеймера регистрируется повышенная активность и сверхэкспрессия, главным образом, гистоновой деацетилазы 6 (HDAC6), что сопровождается нарушениями регуляции транскрипции и коррелирует с накоплением β-амилоида, гиперфосфорилированием тау-белка и дегенерацией нейронов [38]. В связи с этим мы исследовали влияние соединения I на активность HDAC6.

Активность фермента HDAC6 определяли по степени деацетилирования субстрата в присутствии фермента флуоресцентным методом с использованием коммерчески доступного набора (Enzo Life Sciences-FLUOR DE LYS® HDAC6, Enzo Biochem, New York, NY, USA). Флуоресценцию измеряли на планшетном флуориметре EnVision (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA) при λ_ex = 350-380 нм, λ_em = 440-460 нм.

Для соединения I была обнаружена ингибирующая способность по отношению к HDAC6, о чем свидетельствует величина IC₅₀, представляющая собой значение концентрации, приводящей к 50% ингибированию активности фермента, равная 6.52 ± 0.40 μМ.

Пример 5. Изучение влияния соединения I на агрегацию патологических форм β-амилоида

Ряд нейродегенеративных заболеваний, различных по своей клинической картине, имеет сходный молекулярный механизм патогенеза, в основе которого лежит патологическая агрегация белков, приводящая к развитию протеинопатии [39, 40]. Нервные ткани пациентов с болезнью Альцгеймера содержат белковые агрегаты - β-амилоидные бляшки, образованные β-амилоидным пептидом, состоящим из 40-42 аминокислотных остатков. В связи с этим способность препятствовать процессу агрегации Аβ_1-40/1-42 перспективным свойством потенциальных нейропротекторных агентов.

Влияние соединения I на агрегацию патологических форм β-амилоидного пептида анализировали в течение 72 часовой инкубации при 37°С на двух модельных системах - фрагментах Аβ_1–40 и Аβ_1–42. В качестве индикатора продолжающегося процесса фибриллизации использовали флуорофор Тиофлавин Т (10 μM) [41], взаимодействие которого с белками в состоянии амилоидных фибрилл приводит к усилению сигнала флуоресценции [42]. Флуоресценцию измеряли с помощью многофункционального планшетного анализатора Cytation™ 3 (BioTek Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) при λ_ex = 450 нм, λ_em = 480 нм.

Как следует из Фиг 1 А, В флуоресценция тиофлавина Т, свидетельствующая об активном образовании β-амилоидных фибрилл, быстро возрастает в первые шесть часов, а затем постепенно прогрессирует в течение 72-часового инкубационного периода. Предварительная обработка β-амилоидных препаратов 1-40 и 1-42 соединением I в концентрации 100 μM приводит к заметному торможению процесса агрегации данных пептидов, подавляя процесс на 55.78 ± 5.69 % и 56.49 ± 2.45 %, соответственно (72 ч). Более того, было обнаружено, что такое действие соединения I носит концентрационно-зависимый характер. Для этого были использованы концентрации соединения I 1, 10, 30 и 100 μМ. Как видно из Фиг.1 Б, Г, как на модели Аβ_1–40, так и на модели Аβ_1–42 с увеличением концентрации возрастает Аβ-антиагрегационная способность.

Фиг.1. Влияние соединения I на агрегацию β-амилоида 1-40 (А-Б) и 1-42 (В-Г). A, В - концентрация соединения I составляет 100 μM. Б, Г - концентрационные зависимости ингибирования агрегации Αβ_1–40 и Αβ_1–42 соединением I., диапазон концентраций которого составляет от 1 до 100 μM. Данные представлены в виде % агрегации β-амилоида относительно максимального значения флуоресценции тиофлавина T.

Пример 6. In vivo исследование влияния соединения I на обучение и формирование пространственной памяти трансгенных мышей 5xFAD, моделирующих болезнь Альцгеймера

Все процедуры с животными были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных ИФАВ РАН (разрешение ИФАВ РАН № 61 от 18.04.2021).

Начальным этапом in vivo исследования было изучение токсического действия соединения I на клинически здоровых животных мышах-самцах линии C57BL6/j. Исследования токсичности показали, что внутрибрюшинное введение соединения I в максимальной концентрации 300 мг/кг не вызывало патологических изменений в физиологическом состоянии и поведенческих характеристиках, что позволяет отнести данное соединение к классу малотоксичных веществ. Введение эквивалентного объема растворителя (физиологический раствор + 10% диметилсульфоксид) также не приводило к каким-либо нарушениям.

In vivo исследования нейропротекторного потенциала соединения I проводили на 11-месячных мышах-самцах линии 5xFAD (Tg(APPSwFlLon, PSEN1*M146L*L286V) 6799Vas/J). Патологический фенотип данной линии мышей включает отложения патологического β-амилоидного пептида, глиоз, внутриклеточное накопление Aβ, выраженную гибель нейронов, нейродегенерацию и нарушения памяти, обнаруживаемые при болезни Альцгеймера [43]. В качестве контрольной группы использовали животных дикого типа того же возраста - мышей-самцов линии C57Bl6/j. Животных содержали в клетках со свободным доступом к воде и пище в помещении с циклом свет-темнота 12ч/12ч, при температуре 23±1°С и влажности 50±5%. Перед началом серии экспериментов животных случайным образом разделили на три группы по восемь мышей в каждой: 1) группа C57BL6/j; 2) группа 5xFAD; 3) группа 5xFAD + I.

Непосредственно перед использованием соединение I растворяли в физиологическом растворе и ДМСО (10%) и внутрибрюшинно вводили животным экспериментальной группы в течение 20 дней в дозе 15 мг/кг. Группа C57BL6/j получала эквивалентный объем растворителя (физиологический раствор + 10% диметилсульфоксид) по той же схеме.

Когнитивно-стимулирующее действие соединения I определяли по его влиянию на пространственную память мышей в тесте «Водный лабиринт Морриса».

Тест Водный Лабиринт Морриса был выполнен на основе парадигмы Морриса [44, 45] и является основным тестом для изучения пространственного обучения и формирования памяти у мышей. Экспериментальная установка состояла из круглого бассейна (диаметр 150 см, высота 60 см, OpenScience, Россия), разделенного на четыре равных квадранта и наполненного водой (22 ± 1°С) с освещением 50 и 75 люкс (темная и светлая стороны, соответственно). В одном из квадрантов лабиринта была расположена платформа (диаметром 10 см) на 1 см ниже поверхности воды. Платформа и бассейн были белого цвета с антибликовым покрытием, что вместе с бестеневым ламповым освещением создавало эффект невидимой платформы, скрытой под водой. В качестве визуальных ориентиров использовались четыре фигуры (OpenScience, Москва, Россия), закрепленные на стойках и расположенные у бортов бассейна с четырех разных сторон.

Тест Водный Лабиринт Морриса включает в себя две фазы: фазу обучения (тренировочные дни с погруженной под воду платформой) и фазу тестирования (заплыв без платформы) (Фиг 2 А). Во время фазы обучения в течение четырех дней мышей помещали в воду, предъявляя им по четыре 60 секундных попытки с разных позиций для поиска скрытой под водой платформы (суммарно 16 испытаний за весь эксперимент). Все четыре стартовые позиции для каждого дня (Север, Юг, Восток, Запад) были преднамеренно рандомизированы. Если животному не удавалось определить местонахождение платформы в течение отведенного времени, его аккуратно направляли к платформе и оставляли на ней на 30 секунд. По окончании фазы обучения в последний пятый день эксперимента проводили 90 секундную тест-сессию без платформы. Критерием успешного обучения и формирования памяти служила продолжительность нахождения животных в противоположном верному квадранте лабиринта.

Как следует из Фиг. 2 Б во время фазы обучения мыши во всех группах, за исключением 5xFAD, показали значительное улучшение показателя латентного периода, необходимого для поиска скрытой под водой платформы. В свою очередь, как для животных дикого типа, так и для мышей, получавших соединение I, разница между первым и четвертым днями обучения была достоверной, что подтверждает наличие способности у соединения I восстанавливать нарушения обучения у животных 5xFAD.

Еще одним важным подходом при изучении поведения животных в водном лабиринте Морриса во время фазы обучения является анализ стратегий, используемых при поиске скрытой платформы. Данный анализ заключается в постепенном переключении гиппокамп-независимой эгоцентрической навигации к гиппокамп-зависимой аллоцентрической.

Независимая от гиппокампа эгоцентрическая навигация включает несколько типов стратегий поиска платформы (Фиг. 2 Г): (1) тигмотаксис - животное перемещается только по периферии бассейна; 2) случайный поиск - животное начинает удаляться от периферии бассейна с видимыми движениями внутрь; (3) сканирование - поведение, связанное со случайным поиском, но более сосредоточенным на центральной части бассейна. Такое поведение часто наблюдается в первые дни помещения животного в экспериментальную установку, когда мышь демонстрирует стереотипную последовательность паттернов при поиске скрытой платформы, ориентируясь только на проксимальные и внутренние сигналы. Затем, по мере обучения, начинает включаться зависящая от гиппокампа аллоцентрическая навигация с добавлением различных векторов движения и использованием дистальных сигналов (визуальные подсказки, расположенные возле бортиков бассейна) (Фиг 2 Д). Эта стратегия включает: (1) направленный поиск - плавание с небольшими круговыми или извилистыми движениями для поиска платформы; 2) фокусный поиск - это поведение также связано со случайным поиском, но здесь животное активно ищет определенный небольшой целевой участок бассейна; 3) прямое плавание - животное целенаправленно движется к платформе.

Таким образом, поведение животного в водном лабиринте Морриса зависит как от эгоцентрической, так и от аллоцентрической стратегий поиска, причем вклад последней возрастает при помещении животных в экспериментальную установку из разных начальных точек и повторении сессий, и характеризует успешность гиппокамп-зависимого пространственного обучения.

При анализе стратегий, используемых животными для поиска платформы, было обнаружено, что трансгенные мыши 5xFAD, не получавшие лечения, сохраняли преимущество в использовании независимой от гиппокампа эгоцентрической навигации вплоть до последнего четвертого дня обучения (Фиг. 2 Е), в отличие от клинически здоровых животных C57BL6/j (Фиг. 2 Ж). Это подтверждает известные данные о том, что патологический фенотип данной генно-модифицированной линии мышей характеризуется нарушением функционирования нейронов в области гиппокампа и свидетельствует об отсутствии эффективного обучения. В свою очередь, соединение I привело к нормализации данной ситуации и успешному формированию аллоцентрической когнитивной карты (Фиг. 2 З).

Более того, введение трансгенным мышам соединения I достоверно снижало продолжительность нахождения животных в противоположном верному квадранте лабиринта (Фиг. 2 В) во время фазы тестирования на пятый день эксперимента. Данный показатель свидетельствует об успешном обучении и формировании пространственной памяти мышей в тесте Водный лабиринт Морриса.

Фиг. 2. Влияние соединения I на обучение и формирование пространственной памяти трансгенных животных 5xFAD в тесте Водный лабиринт Морриса. А - экспериментальный дизайн теста Водный лабиринт Морриса. Б - время, необходимое мыши для поиска скрытой под водой платформы во время периода обучения; данные представлены в виде среднее ± SEM (количество животных в каждой группе, n = 8). *, **, p < 0,05 и p < 0,01 соответственно по сравнению с 1-м днем. Статистический анализ проводился с использованием one-way ANOVA. B - продолжительность нахождения мыши в противоположном верному квадранте лабиринта во время фазы тестирования; данные представлены в виде среднее ± SEM (количество животных в каждой группе, n = 8). * р < 0,05 по сравнению с группой 5xFAD. Статистический анализ проводился с использованием one-way ANOVA, критерий Бонферрони. Г - типы шаблонов поиска скрытой платформы при использовании гиппокамп-независимой эгоцентрической навигации. Д - типы шаблонов поиска скрытой платформы при использовании гиппокамп-зависимой аллоцентрической навигации; Е-З - анализ стратегий поиска скрытой платформы в течение всего периода обучения животными из групп C57BL6/j, 5xFAD и 5xFAD + I, соответственно.

Пример 7. Ex vivo анализ влияния соединения I на работу комплексов дыхательной цепи митохондрий в посмертных образцах головного мозга мышей

Для оценки функционирования митохондрий в посмертных образцах головного мозга мышей исследовали влияние соединения I на работу комплексов электрон-транспортной цепи в препарате синаптосомальной р2 фракции головного мозга мышей с использованием анализатора клеточного метаболизма Agilent Seahorse XF96e (Seahorse Bioscience, Santa Clara, CA, USA) посредством измерения скорости поглощения кислорода органеллами под действием модуляторов. Для этого были использованы активаторы комплекса I цепи переноса электронов - глутамат/малат, ингибитор комплекса I - ротенон, субстрат комплекса II - сукцинат калия, ингибитор комплекса III - антимицин А, и субстраты комплекса IV - аскорбат/TMPD.

Как показал анализ состояния митохондриального дыхания, после инъекций сукцината и аскорбата/TMPD в группе 5xFAD было обнаружено достоверно более низкое потребление кислорода органеллами, чем у животных дикого типа C57BL6/j. В то же время у трансгенных животных, получавших соединение I, наблюдалось увеличение скорости потребления кислорода аскорбата/TMPD, и как следствие, стимуляция цитохромоксидазного комплекса дыхательной цепи (Фиг. 3 А, Б). Такое действие соединения I подтверждает нейропротекторный потенциал данного вещества за счет наличия также и митопротекторной активности.

Фиг. 3. Ex vivo анализ влияния соединения I на работу комплексов дыхательной цепи митохондрий в синаптосомальной р2 фракции (10 мкг/лунка) посмертных образцов головного мозга мышей, получавших лечение гидроксамовой кислотой после экспериментов in vivo. Концентрация ротенона составляла 2 μМ, сукцината калия - 2 μМ, антимицина - 4 μМ, аскорбата/TMPD - 0,5 μМ. Данные представлены в виде среднее ± SEM. ****, р < 0,0001 по сравнению с группой 5xFAD.

Таким образом, приведенные выше примеры подтверждают, что заявляемое нами соединение - 4-(3-((2-адамантил)амино)-3-оксопроп-1-ен-1-ил)-N-гидроксибензамид I - является мультитаргетным нейропротекторным веществом, воздействующим одновременно на несколько ключевых звеньев патогенеза болезни Альцгеймера. Этот эффект реализуется за счет проявления ингибирующего действия в отношении гистоновой деацетилазы 6, способности препятствовать агрегации патологических форм β-амилоидного пептида и подавлять процессы, связанные с окислительным стрессом и дисфункцией митохондрий, и находит отражение в восстановлении утраченных когнитивных функций и улучшении процессов обучения и формирования долговременной гиппокамп-зависимой пространственной памяти трансгенных животных 5xFAD, моделирующих нейродегенерацию.

Список литературы:

1. Деменция. Информационный бюллетень. Всемирная организация здравоохранения. 2019; Available from: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/dementia.

2. McDade, E. and R.J. Bateman, Stop Alzheimer's before it starts. Nature, 2017. 547(7662): p. 153-155.

3. Reddy, P.H. and T.P. Reddy, Mitochondria as a therapeutic target for aging and neurodegenerative diseases. Curr Alzheimer Res, 2011. 8(4): p. 393-409.

4. Swerdlow, R.H. and S.M. Khan, A "mitochondrial cascade hypothesis" for sporadic Alzheimer's disease. Med Hypotheses, 2004. 63(1): p. 8-20.

5. Moran, M., et al., Mitochondrial respiratory chain dysfunction: implications in neurodegeneration. Free Radic Biol Med, 2012. 53(3): p. 595-609.

6. Li, X., X. Bao, and R. Wang, Neurogenesis-based epigenetic therapeutics for Alzheimer's disease (Review). Mol Med Rep, 2016. 14(2): p. 1043-53.

7. Chen, F., et al., Effects of Focal Cerebral Ischemia on Exosomal Versus Serum miR126. Transl Stroke Res, 2015. 6(6): p. 478-84.

8. Zhang, K., et al., Targeted proteomics for quantification of histone acetylation in Alzheimer's disease. Proteomics, 2012. 12(8): p. 1261-8.

9. Vaiserman, A.M. and E.G. Pasyukova, Epigenetic drugs: a novel anti-aging strategy? Front Genet, 2012. 3: p. 224.

10. Qing, H., et al., Valproic acid inhibits Abeta production, neuritic plaque formation, and behavioral deficits in Alzheimer's disease mouse models. J Exp Med, 2008. 205(12): p. 2781-9.

11. Ricobaraza, A., et al., Phenylbutyrate rescues dendritic spine loss associated with memory deficits in a mouse model of Alzheimer disease. Hippocampus, 2012. 22(5): p. 1040-50.

12. Huang, J., et al., Unilateral amyloid-beta25-35 injection into the rat amygdala increases the expressions of aberrant tau phosphorylation kinases. Chin Med J (Engl), 2010. 123(10): p. 1311-4.

13. Zhang, Z., et al., Valproic acid-mediated neuroprotection in retinal ischemia injury via histone deacetylase inhibition and transcriptional activation. Exp Eye Res, 2012. 94(1): p. 98-108.

14. Benito, E., et al., HDAC inhibitor-dependent transcriptome and memory reinstatement in cognitive decline models. J Clin Invest, 2015. 125(9): p. 3572-84.

15. Chopra, V., et al., LBH589, A Hydroxamic Acid-Derived HDAC Inhibitor, is Neuroprotective in Mouse Models of Huntington's Disease. J Huntingtons Dis, 2016. 5(4): p. 347-355.

16. Rivieccio, M.A., et al., HDAC6 is a target for protection and regeneration following injury in the nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A, 2009. 106(46): p. 19599-604.

17. Zhang, L., et al., Tubastatin A/ACY-1215 improves cognition in Alzheimer's disease transgenic mice. J Alzheimers Dis, 2014. 41(4): p. 1193-205.

18. Ryu, H., et al., Histone deacetylase inhibitors prevent oxidative neuronal death independent of expanded polyglutamine repeats via an Sp1-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U S A, 2003. 100(7): p. 4281-6.

19. Langley, B., et al., Pulse inhibition of histone deacetylases induces complete resistance to oxidative death in cortical neurons without toxicity and reveals a role for cytoplasmic p21(waf1/cip1) in cell cycle-independent neuroprotection. J Neurosci, 2008. 28(1): p. 163-76.

20. Sleiman, S.F., et al., Histone Deacetylase Inhibitors and Mithramycin A Impact a Similar Neuroprotective Pathway at a Crossroad between Cancer and Neurodegeneration. Pharmaceuticals (Basel), 2011. 4(8): p. 1183-1195.

21. Guo, Y., et al., Trichostatin A attenuates oxidative stress-mediated myocardial injury through the FoxO3a signaling pathway. Int J Mol Med, 2017. 40(4): p. 999-1008.

22. Olson, D.E., et al., Hydroxamate-based histone deacetylase inhibitors can protect neurons from oxidative stress via a histone deacetylase-independent catalase-like mechanism. Chem Biol, 2015. 22(4): p. 439-445.

23. Sleiman, S.F., et al., Hydroxamic acid-based histone deacetylase (HDAC) inhibitors can mediate neuroprotection independent of HDAC inhibition. J Neurosci, 2014. 34(43): p. 14328-37.

24. Mucke, L. and D.J. Selkoe, Neurotoxicity of amyloid beta-protein: synaptic and network dysfunction. Cold Spring Harb Perspect Med, 2012. 2(7): p. a006338.

25. Zhang, Y. and M.L. He, Deferoxamine enhances alternative activation of microglia and inhibits amyloid beta deposits in APP/PS1 mice. Brain Res, 2017. 1677: p. 86-92.

26. Parvathy, S., et al., Alzheimer's amyloid precursor protein alpha-secretase is inhibited by hydroxamic acid-based zinc metalloprotease inhibitors: similarities to the angiotensin converting enzyme secretase. Biochemistry, 1998. 37(6): p. 1680-5.

27. Zhang, Z.Y. and H.J. Schluesener, Oral administration of histone deacetylase inhibitor MS-275 ameliorates neuroinflammation and cerebral amyloidosis and improves behavior in a mouse model. J Neuropathol Exp Neurol, 2013. 72(3): p. 178-85.

28. Neganova, M.E., et al., The Hydroxamic Acids as Potential Anticancer and Neuroprotective Agents. Curr Med Chem, 2021. 28(39): p. 8139-8162.

29. Sonkusare, S.K., C.L. Kaul, and P. Ramarao, Dementia of Alzheimer's disease and other neurodegenerative disorders--memantine, a new hope. Pharmacol Res, 2005. 51(1): p. 1-17.

30. Herrmann, N., A. Li, and K. Lanctot, Memantine in dementia: a review of the current evidence. Expert Opin Pharmacother, 2011. 12(5): p. 787-800.

31. Gopalan, B., et al., Discovery of adamantane based highly potent HDAC inhibitors. Bioorg Med Chem Lett, 2013. 23(9): p. 2532-7.

32. Gornall, A.G., C.J. Bardawill, and M.M. David, Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J Biol Chem, 1949. 177(2): p. 751-66.

33. Neganova, M.E., et al., Neuroprotective Effects of the Securinine-Analogues: Identification of Allomargaritarine as a Lead Compound. CNS Neurol Disord Drug Targets, 2016. 15(1): p. 102-7.

34. Milackova, I., et al., Screening for antiradical efficiency of 21 semi-synthetic derivatives of quercetin in a DPPH assay. Interdiscip Toxicol, 2013. 6(1): p. 13-7.

35. Neganova, M.E., et al., Histone modifications in epigenetic regulation of cancer: Perspectives and achieved progress. Semin Cancer Biol, 2020.

36. Melesina, J., et al., Design of selective histone deacetylase inhibitors: rethinking classical pharmacophore. Future Med Chem, 2018. 10(13): p. 1537-1540.

37. Pulya, S., et al., HDAC6 as privileged target in drug discovery: A perspective. Pharmacol Res, 2021. 163: p. 105274.

38. Zhang, X.H., et al., A Review of Progress in Histone Deacetylase 6 Inhibitors Research: Structural Specificity and Functional Diversity. J Med Chem, 2021. 64(3): p. 1362-1391.

39. Sweeney, P., et al., Protein misfolding in neurodegenerative diseases: implications and strategies. Transl Neurodegener, 2017. 6: p. 6.

40. Weydt, P. and A.R. La Spada, Targeting protein aggregation in neurodegeneration--lessons from polyglutamine disorders. Expert Opin Ther Targets, 2006. 10(4): p. 505-13.

41. Phan, H.T.T., et al., Polyphenols Modulate Alzheimer's Amyloid Beta Aggregation in a Structure-Dependent Manner. Nutrients, 2019. 11(4).

42. Neganova, M.E., et al., Securinine Derivatives as Potential Anti-amyloid Therapeutic Approach. CNS Neurol Disord Drug Targets, 2017. 16(3): p. 351-355.

43. Oakley, H., et al., Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer's disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. J Neurosci, 2006. 26(40): p. 10129-40.

44. Morris, R., Developments of a water-maze procedure for studying spatial learning in the rat. J Neurosci Methods, 1984. 11(1): p. 47-60.

45. Vorhees, C.V. and M.T. Williams, Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nat Protoc, 2006. 1(2): p. 848-58.

4-(3-((2-Адамантил)амино)-3-оксопроп-1-ен-1-ил)-N-гидроксибензамид формулы I в качестве нейропротекторного соединения, в том числе средства для терапии болезни Альцгеймера

.