3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-он для применения при лечении нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов

Изобретение относится к применению соединения формулы (I), которое обладает высокой активностью при ингибировании большого спектра безусловных и обусловленных поведенческих эффектов агонистов CB1, не имеет известных побочных эффектов, не вызывает неспецифические поведенческие эффекты, такие как седативное действие, возбудимость, изменение спонтанного поведения, хорошо всасывается, является стабильным и не превращается в значительных количествах в последующие метаболиты. Изобретение может найти применение в медицине для лечения нарушений, связанных с каннабиноидами. 16 з.п. ф-лы, 10 ил., 8 табл., 8 пр.

формула (I)

 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области нарушений, связанных с употреблением психоактивных веществ, и в частности к области нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов. Оно относится к конкретному производному прегненолона, "3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-ону", который не может метаболизироваться in vivo с образованием активных метаболитов прегненолона, и к его применению для лечения нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Препараты каннабиноидов, содержащие синтетические агонисты CB1 или экстракт, полученный из растения Cannabis sativa, являются наиболее широко используемыми запрещенными психоактивными веществами в США и в европейских странах.

Последствия употребления каннабиноидов, в особенности, но без ограничения, у наиболее предрасположенных групп населения (14-25 лет) крайне серьезны и могут включать зависимость, нарушение развития мозга с пониженным IQ, ускорение развития психических заболеваний, включающих, без ограничения, шизофрению и депрессию, поступление субъектов в отделение неотложной помощи с различными синдромами интоксикации, более низкие результаты обучения, когнитивные нарушения, низкий уровень дохода, более высокой зависимостью от социального обеспечения, безработицу и пониженную удовлетворенность отношениями и жизнью (Substance Abuse and Mental Health Services Administration (2013). Results from the 2013 National Survey on Drug Use and Health: Summary of National Findings; Cerda et al., 2012; Volkow et al., 2014; Hall et al., 2009).

В США 12-месячное распространение каннабиноидной зависимости, определенное в одном из наиболее часто используемых руководств по диагностике как нарушение, вызванное употреблением каннабиса, составляет примерно 3,4% в возрасте 12-17 лет и 1,5% у взрослых в возрасте 18 лет и старше. Частота нарушения, вызванного употреблением каннабиноидов, выше среди взрослых мужчин (2,2%), чем взрослых женщин (0,8%), и среди мужчин от 12 до 17 лет (3,8%), чем среди женщин в возрасте от 12 до 17 лет (3,0%). Частота распространения нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов, за двенадцать месяцев снижается с возрастом, причем наиболее высокие показатели наблюдаются среди лиц в возрасте от 18 до 29 лет (4,4%), а самые низкие - среди лиц в возрасте 65 лет и старше (0,01%). Этнические и расовые различия в распространении являются умеренными.

Употребление каннабиноидов в США также является причиной 450000 обращений в отделения неотложной помощи в год (DAWN report, 2013). У этих пациентов наблюдаются несколько типов симптомов. Наиболее распространены следующие: a. состояние глубокой тревоги, которое напоминает паническую атаку: b. психоз, делирий и глубоко дезорганизованное поведение; с. синдром гиперемезиса; d. кататоническое поведение (Adams et al., 2017, Khan et al., 2016).

Наконец, употребление каннабиноидов растет и будет только еще больше увеличиваться при легализации использования каннабиса в рекреационных и медицинских целях в западных странах, с распространенностью более 30% в США и большинстве европейских стран среди лиц в возрасте от 16 до 24 лет. Примерно у 9% употребляющих каннабис развивается зависимость. Это число составляет примерно 1 из 6 среди тех, кто начинает употреблять марихуану в подростковом возрасте, и до 25-50% среди ежедневно курящих марихуану.

Связанные с употреблением каннабиноидов нарушения в первую очередь возникают в результате активации рецептора CB1 Δ9-тетрагидроканнабинол (ТГК), основным психоактивным компонентом каннабиса, или любым другим синтетическим соединением, таким как синтетические каннабиноиды.

Способы, направленные на блокирование активности CB1 посредством ингибирования ортостерического сайта связывания, сайта, в котором эндогенные лиганды связываются для активации рецептора, были разработаны и представлены для клинических исследований с целью снижения массы тела. Одно из таких соединений, римонабант, даже было выпущено в продажу под торговым наименованием Акомплиа®. К сожалению, доступные ортостерические антагонисты, такие как римонабант, полностью ингибируют активность рецептора, а также действуют как обратные агонисты рецептора CB1, то есть они ингибируют не только активацию CB1, но и базальную активность рецептора в отсутствие эндогенного лиганда. Из-за такого обратного агонистического действия и полного ингибирования активности рецептора доступные способы, основанные на введении ортостерических антагонистов CB1, также имеют ряд серьезных побочных эффектов. Из-за этих побочных эффектов коммерциализация Акомплиа® была приостановлена, а разработка других способов ингибирования ортостерического сайта CB1 была прекращена.

Ортостерические антагонисты CB1 и, в частности, Акомплиа® имеют следующие известные нежелательные эффекты, делающие их непрактичными средствами для лечения связанных с употреблением каннабиноидов нарушений:

1. Они уменьшают потребление пищи, что указывает на общее нарушение функций подкрепляющей системы;

2. Они вызывают подобное тревожному поведение у животных и тревогу у людей;

3. Они вызывают подобное депрессии поведение у животных и депрессию у людей;

4. Они увеличивают секрецию глюкокортикоидов, вызывающую нарушение гормонального статуса у субъекта. В частности, повышение уровня глюкокортикоидов может повышать активность дофаминергической системы, которая опосредует положительные подкрепляющие эффекты наркотических средств, в том числе каннабиноидов. Повышенная секреция глюкокортикоидов может затем приводить к повышенной чувствительности к подкрепляющим эффектам каннабиноидов, что может препятствовать терапевтическому действию ингибитора CB1 при нарушениях, связанных с употреблением каннабиноидов;

5. Они вызвают наступление абстинентного состояния у ТГК-зависимых животных;

6. Они вызывают судороги и общее нарушение поведенческих и клинических показателей в исследованиях фармакологической и токсикологической безопасности стандарта GLP;

7. Они обладают гепатотоксическим действием.

Недавно было обнаружено, что при избыточной активации рецептора CB1 синтетическими каннабиноидами или очень высокими дозами ТГК, значительно превышающими дозу ТГК, используемую лицами, злоупотребляющими каннабисом, повышается концентрация стероидного гормона прегненолона (3000%) в головном мозге. При этом прегненолон связывается со специфическим сайтом рецептора CB1, отличным от сайта, связываемого агонистами CB1, такими как ТГК, и действует как специфический ингибитор эндогенной сигнализации рецептора CB1 (eCB1-SSi). Таким образом, прегненолон селективно ингибирует CB1-индуцированную активацию пути MAPK (митоген-активируемой протеинкиназы), но не CB1-индуцированное ингибирование аденилатциклазы. Несмотря на это ограниченное молекулярное действие, когда прегненолон вводят до воздействия ТГК, он подавляет большинство опосредуемых ТГК поведенческих эффектов у грызунов (Vallee et al., 2014).

Бускетс-Гарсия с соавт. также демонстрируют, что прегненолон может блокировать весь спектр безусловного действия ТГК, который связан с психотическими симптомами, которые наблюдаются после употребления каннабиноидов у людей. Таким образом, авторы предполагают, что лекарственные средства, имитирующие активность прегненолона, можно применять для лечения острых психотических состояний, вызванных каннабиноидами (CIAPS) (Busquets-Garcia et al., 2017).

По этим причинам прегненолон представляется многообещающим средством для лечения нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов.

Однако прегненолон не может применяться в качестве лекарственного средства, поскольку он обладает плохой доступностью, имеет очень короткий период полувыведения и превращается в активные стероиды.

В WO2012/160006 три производных прегненолона, а именно 3-фторпрегненолон, 17-метилпрегненолон, 3-фтор-17-метилпрегненолон, исследовали на крысах или мышах после стимуляции ТГК и/или после ограничения пищи. Эти соединения могли ингибировать эффекты активации CB1 при приеме пищи.

Другие соединения, и особенно 3β-бензилоксипрегненолон, исследовали на их способность ингибировать: i. эффекты ТГК-индуцированной каннабиноидой тетрады (гипотермия и подавление двигательной активности); ii. ТГК-индуцированное увеличение потребления пищи, типичный эффект активации CB1; iii. повышение ФНО-альфа, вызванное ЛПС, другой эффект, типичный для антагонистов CB1.

В WO2014/083068 раскрыт "3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-он" и его применение для ингибирования рецептора CB1, однако в очень общем виде. Нет никакого упоминания об ингибировании активации CB1, вызванной, в частности, ТГК.

В любом случае, не существует никаких одобренных лекарственных средств для лечения нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов, что, следовательно, является важной неудовлетворенной потребностью медицины.

Таким образом, сохраняется потребность в лечении нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов.

Разработка способов лечения нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов, на основе специфического подавления сигналов рецептора CB1, которые могут применяться у человека, представляет несколько сложностей. При этом такое соединение должно одновременно обладать всеми следующими характеристиками:

1. Оно должно ингибировать активность рецептора CB1 селективным и сигнально-специфическим образом.

2. Оно должно ингибировать большой спектр безусловных и обусловленных поведенческих эффектов агонистов CB1, чтобы его можно было применять для лечения различных нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов. Это представляет особую проблему для специфического ингибитора сигнализации. Поскольку это соединение изменяет лишь некоторые клеточные эффекты активации CB1 под действием агониста. Следовательно, невозможно предсказать, какой из различных поведенческих эффектов каннабиноидов будет изменен специфическим ингибитором сигнализации.

3. Оно не должно иметь известных побочных эффектов ингибиторов CB1. В частности, оно не должно вызывать: a. уменьшение потребления пищи; b. усиление связанного с тревогой и депрессией поведения; с. увеличение секреции глюкокортикоидов; d. состояния отмены у ТГК-зависимых животных; e. судороги и нарушение клинических проявлений, связанных с центральной нервной системой; f. гепатотоксичность.

4. Оно не должно иметь неспецифических поведенческих эффектов, включающих, помимо прочего, седативное действие, возбудимость, измененное спонтанное поведение, которые могут нарушать его терапевтическое действие.

5. Оно должно хорошо всасываться, должно быть стабильным и не превращаться in vivo в значительные количества метаболитов, которые могут оказывать нежелательное действие, включая, без ограничения, активные стероиды.

6. Оно должно проникать в головной мозг, который является органом-мишенью терапевтического средства, направленного на лечение нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов.

7. Оно не должно модифицировать основные метаболические ферменты и белки-переносчики в организме, которые могут вызывать модификации на уровне или активности эндогенных молекул или экзогенных терапевтических средств.

8. Оно должно иметь хороший терапевтический индекс (соотношение между активной дозой и дозой, демонстрирующей нежелательные эффекты). Приемлемым терапевтическим индексом обычно считается по меньшей мере 10.

Ни для одного из специфических ингибиторов сигнализации и других антагонистов рецепторов CB1, описанных выше или в предшествующих доступных источниках, не были описаны все вышеуказанные особенности. В более общем смысле, практически ни одно соединение, применяемое для лечения поведенческих нарушений, не обладает всеми этими характеристиками. Таким образом, три основных класса психоактивных средств - анксиолитики, антидепрессанты и нейролептики - вызывают нежелательные поведенческие эффекты в диапазоне терапевтических доз. Например: a. Анксиолитические средства вызывают сонливость, снижают внимание и ухудшают память; b. Антидепрессант вызывает возбудимость, бессонницу и снижение либидо; c. Нейролептик вызывает гормональные нарушения, седативное действие, дискинезию и непроизвольные движения.

Следовательно, соединение, обладающее всеми характеристиками, описанными в пунктах 1-8, будет не только крупной инновацией в качестве лекарственного средства, предназначенного для лечения заболеваний, связанных с употреблением каннабиноидов, но также и крупной инновацией для всей области психоактивных средств, предназначенных для лечения поведенческих нарушений.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение в целом относится к определенному производному прегненолона для применения для лечения нарушения, связанного с употреблением каннабиноидов.

В частности, изобретение относится к соединению Формулы (I):

для применения при лечении нарушения, связанного с употреблением каннабиноидов.

Фактически, соединение согласно изобретению обладает уникальными характеристиками, заключающимися в наличии всех описанных ниже свойств, которые делают его крайне инновационным терапевтическим средством для лечения заболеваний, связанных с употреблением каннабиноидов.

1. Оно селективно ингибирует активность рецептора CB1 сигнально-специфическим образом;

2. Оно обладает очень высокой активностью при ингибировании большого спектра безусловных и обусловленных поведенческих эффектов агонистов CB1 и, следовательно, может применяться для лечения нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов;

3. Он не имеет известных побочных эффектов ингибиторов и антагонистов CB1. В частности, оно не: a. уменьшает потребление пищи; b. усиливает поведение, связанное с тревогой и депрессией; c. повышает секрецию глюкокортикоидов; d. вызывает наступление состояния отмены у ТГК-зависимых животных; e. вызывает судороги и нарушения, а также клинические проявления, связанные с центральной нервной системой; f. вызвает гепатотоксичность в исследованиях стандарта GLP.

4. Он не вызывает неспецифические поведенческие эффекты, такие как седативное действие, возбудимость, изменение спонтанного поведения, которые могли бы помешать его терапевтическому действию.

5. Оно хорошо всасывается, является стабильным и не превращается в значительных количествах в последующие метаболиты.

6. Оно проникает в мозг.

7. Оно не изменяет главные метаболические ферменты и белки-переносчики организма.

8. Оно имеет превосходный терапевтический индекс >7200.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

ФИГУРА 1: Схема синтеза соединения формулы (I) (3pMBP)

ФИГУРЫ 2: In vitro эффекты 3pMBP в отношении вызванных ТГК модификаций CB1-опосредованной сигнализации и клеточной активности.

ФИГУРА 2A: Действие 3pMBP (0, 1, 10 и 100 нМ) на ТГК-индуцированное фосфорилирование MAPK. Отношение P-MAPK/CoxIV из клеток HEK293, стабильно трансфицированных hCB1.

ФИГУРА 2B: Действие 3pMBP (0, 1, 10 и 100 нМ) на ТГК-индуцированное фосфорилирование MAPK. Отношение P-MAPK/MAPK из клеток HEK293, транзиентно трансфицированных hCB1.

ФИГУРА 2C: Действие 3pMBP (1 нМ, 10 нМ, 100 нМ и 1 мкМ) на ТГК-индуцированное снижение уровней цАМФ в клетках CHO, стабильно трансфицированных hCB1. NT=необработанные, т.е. клетки, получавшие оба растворителя 3pMBP и ТГК.

ФИГУРА 2D: Действие 3pMBP (0, 1, 10 и 100 нМ) на ТГК-индуцированное ингибирование клеточного дыхания в клетках HEK293, транзиентно трансфицированных hCB1.

***p<0,001; **p<0,01; *p<0,05, группы, обработанные ТГК в сравнении с группами, обработанными растворителем ТГК; ###p<0,001; ##p<0,01; #p<0,05, группы, обработанные 3pMBP+ТГК в сравнении с группами, обработанными растворителем 3pMBP (0 нМ) +ТГК. (A, B критерий Тьюки, D. критерий Даннетта).

ФИГУРЫ 3: Действие 3pMBP на ТГК-индуцированную гиперфагию, психомоторную стимуляцию и нарушение преимпульсного ингибирования:

ФИГУРА 3A: 3pMBP (внутрь) дозозависимо предотвращает у мышей увеличение потребления пищи, вызванное ТГК (1 мг/кг; в/б).

***p<0,001, ТГК в сравнении с растворителем ТГК; ###p<0,001, 3pMBP+ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP (0 мкг/кг) +ТГК (критерий Даннетта).

ФИГУРА 3B: 3pMBP (внутрь) дозозависимо предотвращает у мышей увеличение двигательной активности, вызванное ТГК (0,3 мг/кг; в/б).

Сплошные черные линии соответствуют средним; пунктирные черные линии соответствуют значениям SEM для групп, получавших растворитель ТГК (VEH) или ТГК без 3pMBP. Черные круги, средние значения ± SEM для групп, получавших 3pMBP и ТГК.

p>0,05, 3pMBP (0,00015 мг/кг) +ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP +ТГК,

p<0,01, 3pMBP (0,0005 мг/кг) +ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP +ТГК,

p<0,001, 3pMBP (0,0015 мг/кг) +ТГК, 3pMBP (0,015 мг/кг) +ТГК и 3pMBP (0,15 мг/кг) +ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP+ТГК.

(критерий Даннетта после однофакторного дисперсионного анализа, p<0,001).

ФИГУРА 3C: 3pMBP (внутрь) дозозависимо предотвращает у мышей нарушение преимпульсного (82 дБ) ингибирования (PPI), вызванного ТГК (10 мг/кг; в/б).

Сплошные черные линии соответствуют средним; пунктирные черные линии соответствуют значениям SEM для групп, обработанных растворителем ТГК (VEH) или ТГК без 3pMBP. Черные круги, средние значения ± SEM для групп, обработанных 3pMBP и ТГК.

p>0,05, 3pMBP (0,0015 мг/кг) +ТГК и 3pMBP (0,005 мг/кг) +ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP +ТГК,

p<0,05, 3pMBP (0,015 мг/кг) +ТГК и 3pMBP (0,05 мг/кг) +ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP +ТГК,

p<0,01, 3pMBP (0,03 мг/кг) +ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP +ТГК

(критерий Даннетта после однофакторного дисперсионного анализа, p<0,001).

ФИГУРЫ 4: Действие 3pMBP на ТГК-индуцированное нарушение кратковременной памяти, распознавания объектов, социального взаимодействия и тестирования реальности.

ФИГУРА 4A: 3pMBP (внутрь) дозозависимо предотвращает у мышей нарушение кратковременной памяти, вызванное ТГК (5 мг/кг) в водном лабиринте.

**p<0,01, ТГК в сравнении с растворителем ТГК (VEH_ТГК; критерий Даннетта).

#p<0,05, 3pMBP+ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP (0 мг/кг) +ТГК (критерий Даннетта).

ФИГУРА 4B: 3pMBP (внутрь) предотвращает у мышей нарушение распознавания объектов, вызванное ТГК (6 мг/кг).

***p<0,001, Знакомый в сравнении с Новым объектом (критерий Шидака).

###p<0,001, время исследования нового объекта: Растворитель 3pMBP (0 мг/кг) + ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP (0 мг/кг) и без ТГК или в сравнении с 3pMBP+ТГК (критерий Шидака).

ФИГУРА 4C: 3pMBP (внутрь) дозозависимо предотвращает у мышей нарушение социального взаимодействия, вызванное ТГК (3 мг/кг).

**p<0,01, ТГК в сравнении с растворителем ТГК (VEH_ТГК; критерий Даннетта).

###p<0,001; #p<0,05, 3pMBP+ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP (0 мг/кг) + ТГК (критерий Даннетта).

ФИГУРА 4D: 3pMBP (внутрь) дозозависимо предотвращает у мышей нарушение тестирования реальности, вызванное ТГК (1 мг/кг).

*p<0,05, ТГК в сравнении с растворителем ТГК (VEH_ТГК; непарный t-критерий).

ФИГУРЫ 5: Дествие 3pMBP на ТГК-индуцированную каталепсию, обусловленное раскрывание рта и выброс дофамина в прилежащем ядре.

ФИГУРА 5A: 3pMBP (внутрь) дозозависимо уменьшает у мышей каталепсию, вызванную ТГК (10 мг/кг).

***p<0,001, ТГК в сравнении с растворителем ТГК (критерий Манна-Уитни).

#p<0,05, 3pMBP+ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP (0 мг/кг) +ТГК (критерий Манна-Уитни).

ФИГУРА 5B: 3pMBP (внутрь) предотвращает у мышей обусловленное раскрывание рта, вызванное ТГК (10 мг/кг). Среднее количество ± SEM раскрываний рта, вызванных ТГК-спаренным раствором сахарина при предварительной обработке 3pMBP (0,005 и 0,015 мг/кг) или растворителем 3pMBP (0 мг/кг) во время адаптации и контрольного испытания.

*p<0,05, 3pMBP+ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP (0 мг/кг) +ТГК (однофакторный дисперсионный анализ, основное действие при введении 3pMBP).

ФИГУРА 5C: 3pMBP ингибирует увеличение оттока дофамина в зависимости от времени в прилежащем ядре крыс, обработанных ТГК (1 мг/кг). Черная стрелка, время инъекции ТГК.

ФИГУРА 5D: 3pMBP уменьшает среднюю площадь под кривой (AUC, вычисленную от времени "0" до 60 минут для каждой группы) оттока дофамина в прилежащем ядре крыс, обработанных ТГК (1 мг/кг).

***p<0,001; **p<0,01, 3pMBP+ТГК в сравнении с растворителем 3pMBP (0 мг/кг) +ТГК (критерий Даннетта).

ФИГУРА 6: Действие 3pMBP при внутривенном самовведении WIN 55,212-2 у мышей.

3pMBP (внутрь) уменьшает самовведение WIN 55-512,2 (0,0125 мг/кг/инфузия; в/в) у мышей. Количество инфузий во время освоения самовведения (первые 10 процедур, закрашенные черным круги) и во время процедур самовведения 3pMBP (0,005 мг/кг, процедуры 11-14 и 0,015 мг/кг, процедуры 15-18; серые квадраты) или с Растворителем 3pMBP (0 мг/кг, белым заполненными кругами).

*p<0,05, обработанная 3pMBP (0,015 мг/кг) группа в сравнении с растворителем (0 мг/кг) (двухфакторный дисперсионный анализ, основное действие при введении 3pMBP).

ФИГУРЫ 7: Действие 3pMBP при самовведении ТГК и восстановлении у обезьян.

ФИГУРА 7A: 3pMBP дозозависимо снижает количество инъекций ТГК у саймири во время внутривенного самовведения (1-ч процедуры) ТГК (4 мкг/кг/инъекция) при фиксированном отношении десять (FR10)

*p<0,05, в сравнении с растворителем 3pMBP+ТГК (критерий Бонферрони).

ФИГУРА 7B: 3pMBP дозозависимо уменьшает процент ответа на ТГК у саймири во время внутривенного самовведения (1-ч процедуры) ТГК (4 мкг/кг/инъекция) при фиксированном отношении десять (FR10).

*p<0,05, в сравнении с растворителем 3pMBP+ТГК (критерий Бонферрони).

ФИГУРА 7C: 3pMBP (внутрь) уменьшает ТГК-индуцированное возобновление (0,04 мг/кг) поиска наркотического средства у обезьян. Столбик представляет собой среднее количество ± SEM (n=4) инъекций растворителя. "0 мг/кг" представляет собой растворитель 3pMBP.

*p<0,05, в сравнении с 'праймингом растворителем' (критерий Тьюки).

#p<0,05, в сравнении с 'праймингом ТГК' (критерий Тьюки).

ФИГУРА 7D: 3pMBP (внутрь) уменьшает процент ответов во время теста ТГК-индуцированного возобновления (0,04 мг/кг) поиска наркотического средства у обезьян. Столбик представляет собой среднее значение ± SEM (n=4) процента ответов. "0 мг/кг" представляет собой растворитель 3pMBP.

*p<0,05, в сравнении с 'праймингом растворителем' (критерий Тьюки).

#p<0,05, в сравнении с 'праймингом ТГК' (критерий Тьюки).

ФИГУРЫ 8 Действие 3pMBP и римонабанта на потребление пищи и массу тела и на ТГК-индуцированное состояние отмены.

ФИГУРА 8A: Действие 3pMBP и римонабанта на массу тела у мышей с ожирением.

В сравнении с животными, получавшими растворитель (VEH), Римонабант (Rimo 10 мг/кг; в/б), но не 3pMBP (0,005, 0,015, 0,05, 5 и 15 мг/кг; внутрь), вызывал снижение массы тела у мышей с ожирением.

Дни 1-4: отсутствие значимого действия римонабанта.

Дни 5-7: p<0,05, Rimo в сравнении с VEH (критерий Даннетта).

Дни 7-15: p<0,01, Rimo в сравнении с VEH (критерий Даннетта).

ФИГУРА 8B: Действие 3pMBP и римонабант на потребление пищи у мышей с ожирением.

По сравнению с животными, получавшими растворитель (VEH), Римонабант (Rimo 10 мг/кг; IP), но не 3pMBP (0,005, 0,015, 0,05, 5 и 15 мг/кг; внутрь), вызывал снижение потребления пищи у мышей с ожирением.

День 1-5: p<0,001, Rimo в сравнении с VEH (критерий Тьюки).

ФИГУРА 8C: Действие 3pMBP и римонабанта на длительность качания головой.

Римонабант (Rimo, 10 мг/кг; в/б), но не 3pMBP (0,15 мг/кг; внутрь), увеличивает длительность качания головой у мышей, повторно получавших лечение путем введения ТГК (20 мг/кг; в/б), по сравнению с животными, повторно получавшими ТГК с инъекцией растворителя (VEH).

***p<0,001; VEH-ТГК в сравнении с группой Rimo-ТГК (t-критерий Стьюдента).

ФИГУРА 8D: Действие 3pMBP и римонабанта на длительность дрожания лап.

Римонабант (Rimo, 10 мг/кг; в/б), но не 3pMBP (0,15 мг/кг; внутрь), увеличивает продолжительность дрожания лап у мышей, повторно получавших лечение путем введения ТГК (20 мг/кг; в/б), по сравнению с животными, повторно получавшими ТГК с инъекцией растворителя (VEH).

*p<0,05; VEH-ТГК в сравнении с группой Rimo-ТГК (t-критерий Стьюдента).

ФИГУРЫ 9: Действие повторных введений 3pMBP или римонабанта на поведение, связанное с тревогой и депрессией, у мышей.

ФИГУРА 9A: Действие у мышей повторных (28 дней, один раз в день) введений 3pMBP (0, 0,05, 5, 15 мг/кг, внутрь) или римонабанта (Rimo 0 и 10 мг/кг; в/б) на поведение, связанное с тревогой, измеряемое процентом времени, проведенного в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта. 3pMBP не влияет на время пребывания в открытых рукавах, тогда как римонабант сокращает время, проведенное в открытых рукавах.

ФИГУРА 9B: Действие у мышей повторных (28 дней, один раз в день) введений 3pMBP (0, 0,05; 5; 15 мг/кг, внутрь) или римонабанта (Rimo 0 и 10 мг/кг; в/б) на поведение, связанное с тревогой, измеряемое процентом посещений открытых рукавов приподнятого крестообразного лабиринта. 3pMBP не влияет на посещения открытых рукавов, тогда как римонабант уменьшает процент посещений открытых рукавов.

**p<0,01; *p<0,05; Rimo в сравнении с растворителем (0 мг/кг) (t-критерий Стьюдента).

ФИГУРА 9C: Действие у мышей повторных (28 дней, один раз в день) введений 3pMBP (0, 0.05; 5; 15 мг/кг, внутрь) на поведение, связанное с депрессией, измеряемое в тесте на предпочтение сахарозы. 3pMBP не влияет на потребление сахарозы.

ФИГУРА 9D: Действие у мышей повторных (28 дней, один раз в день) введений римонабанта (Rimo 0 и 10 мг/кг; в/б) на поведение, связанное с депрессией, измеряемое в тесте на предпочтение сахарозы. Римонабант уменьшает потребление сахарозы (задержка до 20:30-22:00).

*p<0,05, Rimo в сравнении с растворителем (0 мг/кг) (t-критерий Стьюдента).

ФИГУРЫ 10: Влияние 3pMBP на концентрации кортикостерона в плазме у мышей.

ФИГУРА 10A: У самцов мышей введение 3pMBP (0,3 или 10 мг/кг; внутрь) или растворителя (VEH) не оказывает значительного влияния на концентрации кортикостерона в плазме, измеряемые через 2, 5, 8 и 24 часа после введения.

ФИГУРА 10B: У самок мыши введение 3pMBP (0,3 или 10 мг/кг; внутрь) или растворителя (VEH) не оказывает значительного влияния на концентрации кортикостерона в плазме, измеряемые через 2, 5, 8 и 24 часа после введения.

Данные представлены в log(10) масштабе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Настоящее изобретение в целом относится к соединению Формулы (I):

для применения при лечении нарушения, связанного с употреблением каннабиноидов.

Соединение согласно настоящему изобретению, 3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-он, блокирует не всю активность рецептора-мишени, а только часть его активности. Конкретным рецептором-мишенью соединения согласно настоящему изобретению является рецептор CB1.

Соединение Формулы (I) способно воспроизводить эффекты недавно открытого механизма в головном мозге, который обеспечивает эндогенную отрицательную обратную связь, регулируя избыточную активацию CB1. Важно отметить, что этот регуляторный механизм включается только тогда, когда CB1 сильно переактивирован, но не тогда, когда активация рецептора находится в границах более физиологического диапазона. Вот почему соединение согласно настоящему изобретению крайне эффективно блокирует эффекты агониста CB1, ТГК, и, таким образом, является эффективным для лечения нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов. Кроме того, из-за своего сигнально-специфического механизма действия соединение согласно настоящему изобретению не оказывает воздействия на поведение как таковое у здоровых субъектов, у которых CB1 не активирован каннабиноидами.

Механизм действия соединения согласно настоящему изобретению в этом отношении сильно отличается от механизма действия ортостерических антагонистов CB1, которые путем блокирования связывания эндогенных и экзогенных агонистов рецептора CB1 вызывают полное ингибирование всей активности CB1 и нарушают поведение как таковое. Кроме того, механизм действия антагонистов не существует на физиологическом уровне, то есть, насколько это известно, не существует эндогенных соединений, которые, как антагонисты, блокируют связывание агонистов CB1 с рецептором. Из-за искусственной природы этого механизма действия такие антагонисты, в дополнение к коррекции избыточно повышенной активации рецептора-мишени, обычно снижают его активность ниже базальных уровней, нарушая физиологию и вызывая побочные эффекты.

Иной механизм действия соединения согласно настоящему изобретению и ортостерических антагонистов, таких как римонабант, объясняет, почему оба лекарственных средства могут ингибировать эффекты ТГК, но не имеют других общих поведенческих эффектов.

Следовательно, соединение согласно настоящему изобретению не является антагонистом CB1 и как таковое не блокирует все клеточные эффекты ТГК, как это делает ортостерический антагонист CB1 римонабант.

Фактически, соединение согласно настоящему изобретению превращает ТГК в цАМФ-смещенный агонист CB1.

Смещенный агонист представляет собой соединение, которое способно активировать только некоторые клеточные эффекты, опосредуемые его рецептором-мишенью. В случае CB1, два основных эффекта агониста, такого как ТГК, заключаются в одновременном ингибировании продукции цАМФ и стимуляции активности MAPK. Смещенный агонист CB1 может при этом либо селективно ингибировать цАМФ (агонист CB1 с цАМФ-смещенной активностью), либо активировать MAPK (агонист CB1 с MAPK-смещенной активностью).

Когда соединение согласно настоящему изобретению уже присутствует в организме, ТГК все еще способен ингибировать продукцию цАМФ, но не может активировать MAPK.

Другими словами, соединение согласно настоящему изобретению превратило ТГК в цАМФ-смещенный агонист.

Данные доклинических исследований, полученные с соединением согласно настоящему изобретению, показывают, что ТГК как цАМФ-смещенный агонист теряет большую часть своих безусловных и обусловленных поведенческих эффектов, и становится менее усиливающим и в меньшей степени способен вызывать возобновление поиска наркотического средства после периода прекращения приема наркотического средства.

Однако ТГК все еще способен оказывать некоторые из своих клеточных эффектов. Вероятно, поэтому соединение согласно настоящему изобретению не вызывает наступление состояния отмены у ТГК-зависимых мышей, тогда как римонабант делает это.

Соединение согласно настоящему изобретению обладает преимуществом, которое состоит в том, что оно не проявляет поведенческих эффектов антагонистов CB1. Фактически, ортостерические антагонисты CB1 блокируют всю клеточную активность рецептора, тогда как соединение согласно настоящему изобретению блокирует только некоторые из них.

Также в качестве преимущества и в более общем смысле у соединения согласно настоящему изобретению не наблюдали нежелательных эффектов.

Отсутствие нежелательных эффектов и, во многих случаях, отсутсвие действия соединения согласно настоящему изобретению у грызунов и собак вероятно вызвано специфической структурой, механизмом действия и характеристиками Всасывания/Распределения/Метаболизма/Экскреции соединения согласно настоящему изобретению.

Авторы изобретения демонстрируют, что соединение согласно изобретению обладает сопутствующими свойствами, которые делают его уникальным идеальным средством для лечения нарушений, связанных с употребления каннабиноидов. Эти свойства включают, без ограничения перечисленным, следующее:

1. Соединение согласно настоящему изобретению обладает уникальным механизмом действия, специально созданным как эндогенный механизм в головном мозге для преодоления избыточной активации рецептора CB1, но, по-видимому, не оказывающий влияния на базальную активность рецептора. Нарушение базальной активности системы-мишени часто является причиной некоторых нежелательных эффектов антагонистов. Кроме того, соединение согласно настоящему изобретению обладает высокой селективностью и не взаимодействует ни с одним из 85 протестированных рецепторов. Нецелевые эффекты часто являются причиной некоторых нежелательных эффектов новых химических соединений. Клеточная активность рецептора CB1 при этом ингибируется селективным и сигнально-специфическим образом.

2. Соединение согласно настоящему изобретению демонстрирует in vivo очень высокую активность при ингибировании большого спектра безусловных и обусловленных эффектов агонистов CB1 в том числе, но без ограничения, ТГК.

3. Соединение согласно настоящему изобретению не имеет нежелательных эффектов ортостерических антагонистов CB1, включающих, без ограничения перечисленными: a. снижение потребления пищи; b. усиление поведения, связанного с тревогой и депрессией: c. повышенная секреция глюкокортикоидов; d. вызванное состояние отмены у ТГК-зависимых животных; e. индукция клонических судорог и клинических проявлений, связанных с поражением центральной нервной системы; f. гепатотоксичность.

4. Соединение согласно настоящему изобретению не вызывает соответствующих изменений в поведении как таковое, даже в дозах, которые в тысячу раз выше, чем ID₅₀ для ингибирования ТГК.

5. Соединение согласно настоящему изобретению имеет хорошие характеристики Всасывания, Распределения, Метаболизма и Экскреции с незначительным превращением в основные метаболиты, включающие, без ограничения, последующие активные стероиды.

6. Соединение согласно настоящему изобретению демонстрирует хороший доступ в головной мозг.

7. Соединение согласно настоящему изобретению не изменяет активность основных эндогенных метаболических ферментов и транспортных систем.

8. Соединение согласно настоящему изобретению не имеет побочных и токсических эффектов in vitro и in vivo в дозах, в тысячи раз превышающих ID₅₀ для ингибирования эффектов ТГК. Следовательно, соединение согласно настоящему изобретению имеет очень хороший терапевтический индекс >7200.

Согласно настоящему изобретению "связанные с каннабиноидами нарушения" или "связанное с каннабиноидами нарушение", или "CRD" включают нарушение, связанное с употреблением каннабиноидов (CUD); отравление каннабиноидами; синдром отмены каннабиноидов; другие вызванные каннабиноидами нарушения; неуточненное нарушение, связанное с каннабиноидами; синдром каннабиноидного гиперемезиса, вызванная каннабиноидами кататонию и любые нарушения, которые могут быть связаны с употреблением каннабиноидов.

Чтобы проиллюстрировать основные нарушения, связанные с каннабиноидами (CRD), здесь используются критерии пятого издания Диагностического и статистического руководства по психическим расстройствам (DSM-5™), которые относятся к каннабису и синтетическим каннабиноидам.

Однако это не исключительное описание нарушений, связанных с каннабиноидами, и охватывает аналогичные нарушения, описанные в других диагностических руководствах, включая, помимо прочего, Международную классификацию болезней (Всемирная организация здравоохранения) и, в более общем виде, все нарушения, вызванные препаратами, полученными из каннабиса или содержащими синтетические каннабиноиды.

Примеры таких нарушений подробно описаны в публикации Всемирной организации здравоохранения 2016 года под названием "Медицинские и социальные последствия немедицинского употребления каннабиса". Краткосрочные эффекты от употребления каннабиноидов включают такие нарушения, как нарушение когнитивных функций и координации, тревогу и психотические симптомы, острое токсическое действие, острые воздействия на сердечно-сосудистую систему и острые воздействия на легкие и на дыхательные пути. Длительное употребление каннабиноидов подразумевает не только неблагоприятные психосоциальные и психические последствия, но и сердечно-сосудистые нарушения, связанные с каннабиноидами, а также ишемический инсульт, связанный с каннабиноидами.

"Нарушение, связанное с употреблением каннабиноидов" или "CUD" следует понимать как проблемный профиль использования каннабиноидов, приводящий к клинически значимому ухудшению или нарушению, которое проявляется в виде по меньшей мере двух из следующих событий, происходящих за 12-месячный период:

1. Каннабиноиды часто принимают в больших количествах или в течение более длительного периода, чем было предусмотрено.

2. Присутствует постоянная тяга или неудачные попытки уменьшить или контролировать использование каннабиноидов.

3. Много времени тратится на деятельность, необходимую для получения каннабиноидов, использования каннабиноидов или восстановления после их действия.

4. Тяга, или сильное желание или потребность в использовании каннабиноидов.

5. Неоднократно повторяющееся использование каннабиноидов, приводящее к невыполнению основных обязанностей на работе, школе или дома.

6. Продолжение употребления каннабиноидов, несмотря на наличие постоянных или повторяющихся социальных или межличностных проблем, вызванных или усугубляемых действием каннабиноидов.

7. Отказ от важных социальных, профессиональных или развлекательных мероприятий или их ограничение из-за употребления каннабиноидов.

8. Неоднократно повторяющееся использование каннабиноидов в ситуациях, в которых это представляет физическую угрозу.

9. Использование каннабиноидов продолжается, несмотря на известное присутствие постоянной или повторяющейся физической или психологической проблемы, которая может быть вызвана или усилена каннабиноидами.

10. Толерантность, определяемая любым из следующего:

a. Потребность в заметно увеличенных количествах каннабиноидов с достижением интоксикации или нужного эффекта.

b. Заметно ослабленный эффект при продолжительном использовании одного и того же количества каннабиноидов.

11. Состояние отмены, проявляющийся любым из следующего:

a. Характерный синдром отмены каннабиноидов.

b. Каннабиноиды (или близко родственное вещество) принимают для облегчения или предотвращения наступления состояния отмены.

Согласно DSM-5™, нарушение, связанное с употреблением каннабиноидов, будет считаться "легким", если присутствуют 2-3 симптома, "средним", если присутствуют 4-5 симптомов, и "тяжелым", если присутствуют 6 или более симптомов.

При использовании в настоящем документе "отравление каннабиноидами" следует диагностировать по следующим критериям:

A. Недавнее использование каннабиса или синтетического каннабиноида.

B. Клинически значимые проблематичные поведенческие или психологические изменения (например, нарушение координации движений, эйфория, тревога, ощущение замедленного времени, помутнение сознания, социальное отчуждение), которые развивались во время или вскоре после использования каннабиноидов.

C. Два (или более) следующих признака или симптома, развивающихся в течение 2 часов после использования каннабиноидов:

1. Конъюнктивальная инъекция.

2. Повышенный аппетит.

3. Сухость во рту.

4. Тахикардия.

D. Признаки или симптомы не связаны с другим заболеванием и не могут быть лучше объяснены присутствием другого психического расстройства, включая интоксикацию другим веществом.

Термин "нарушение, связанное с состоянием отмены каннабиноидов" следует диагностировать по следующим критериям:

A. Прекращение использования каннабиноидов, которое было тяжелым и длительным (т.е. обычно ежедневное или почти ежедневное использование в течение по меньшей мере нескольких месяцев).

B. Три (или более) следующих признаков и симптомов развиваются в течение приблизительно 1 недели после Критерия A:

1. Раздражительность, гнев или агрессия.

2. Нервозность или тревожное состояние.

3. Трудности с засыпанием (например, бессонница, беспокойные сны).

4. Сниженный аппетит или потеря веса.

5. Возбуждение.

6. Подавленное настроение.

7. По меньшей мере один из следующих физических симптомов, вызывающих значительный дискомфорт: боль в животе, дрожь/тремор, потливость, жар, озноб или головная боль.

C. Признаки или симптомы критерия B вызывают клинически значимые расстройства или нарушения в социальной, профессиональной или других важных сферах жизнедеятельности.

D. Признаки или симптомы не относятся к другому заболеванию и не могут быть лучше объяснены присутствием другого психического расстройства, включая интоксикацию или отмену другого вещества.

Согласно DSM-5™ "Другие вызванные каннабиноидами нарушения" являются вызванным каннабиноидами тревожным расстройством; вызванным каннабиноидами психотическим нарушением; вызванным каннабиноидами нарушением сна; каннабиноидным интоксикационным делирием. Такие вызванные каннабиноидами нарушения диагностируют вместо отравления каннабиноидами или отмены каннабиноидов, когда симптомы являются достаточно тяжелыми, чтобы служить основанием независимого клинического наблюдения.

"Вызванное каннабиноидами психотическое нарушение" следует диагностировать по следующим критериям:

A. Присутствие одного или обоих следующих симптомов:

1. Бредовые идеи.

2. Галлюцинации.

B. Существует подтверждение из анамнеза, объективного обследования или результатов лабораторного исследования (1) и (2):

1. Симптомы Критерия A развились во время или вскоре после отравления каннабиноидами или отмены каннабиноидов, или после воздействия лекарственного средства.

2. Включенные каннабиноиды способны вызывать симптомы Критерия A.

C. Нарушение не может быть лучше объяснено психотическим нарушением, которое не вызвано употреблением психоактивного вещества. Такой симптом независимого психотического нарушения мог включать следующее:

Симптомы присутствовали до начала употребления каннабиноидов; симптомы сохраняются в течение значительного периода времени (например, около 1 месяца) после прекращения острого состояния отмены или тяжелой интоксикации: или существует другое подтверждение независимого психотического нарушения, не связанного с психоактивным веществом/лекарственным средством (например, наличие в анамнезе повторяющихся эпизодов, не связанные с психоактивным веществом/лекарственным средством).

D. Нарушение наблюдается не только во время делирия.

E. Нарушение вызывает клинически значимое расстройство или нарушение в социальной, профессиональной или других важных сферах жизнедеятельности.

Этот диагноз следует ставить вместо диагноза интоксикации или отмены психоактивного вещества только в том случае, если симптомы Критерия A преобладают в клинической картине и когда они являются достаточно тяжелыми, чтобы требовать клинического внимания.

"Вызванное каннабиноидами тревожное расстройство" следует диагностировать по следующим критериям:

A. Панические атаки или тревога преобладают в клинической картине.

B. Существует подтверждение из анамнеза, объективного обследования или результатов лабораторного исследования (1) и (2):

1. Симптомы Критерия A развились во время или вскоре после отравления каннабиноидами или отмены каннабиноидов, или после воздействия каннабиноидов.

2. Включенные каннабиноиды способны вызывать симптомы Критерия A.

C. Нарушение не может быть лучше объяснено присутствием тревожного расстройства, которое не вызвано каннабиноидами. Такое подтверждение независимого тревожного расстройства может включать следующее:

Симптомы присутствовали до начала использования психоактивного вещества/лекарственного средства; симптомы сохраняются в течение существенного периода времени (например, приблизительно 1 месяц) после прекращения острого состояния отмены или тяжелой интоксикации: или существует другое подтверждение, предполагающее присутствие независимого тревожного расстройства, не вызванного психоактивным веществом/лекарственным средством (например, повторные эпизоды в анамнезе, не связанные с психоактивным веществом/лекарственным средством).

D. Нарушение наблюдается не только во время делирия.

E. Нарушение вызывает клинически значимое расстройство или нарушение в социальной, профессиональной или других важных сферах жизнедеятельности.

Примечание: Этот диагноз следует ставить вместо диагноза отравления каннабиноидами или состояния отмены каннабиноидов только, когда симптомы Критерия A преобладают в клинической картине и являются достаточно тяжелыми, чтобы служить основанием клинического наблюдения.

"Вызванное каннабиноидами нарушение сна" следует диагностировать по следующим критериям:

A. Выраженное и тяжелое нарушение сна.

B. Существует подтверждение в анамнезе, объективного обследования или результатов лабораторного исследования (1) и (2):

1. Симптомы Критерия A развились во время или вскоре после отравления каннабиноидами или после отмены каннабиноидов, или воздействия каннабиноидов.

2. Включенные каннабиноиды способны вызывать симптомы Критерия A.

C. Нарушение не может быть лучше объяснено нарушением сна, которое не вызвано каннабиноидами. Такое подтверждение независимого нарушения сна может включать следующее:

Симптомы присутствовали до начала использования каннабиноидов; симптомы сохраняются в течение существенного периода времени (например, приблизительно 1 месяц) после прекращения острого состояния отмены или тяжелой интоксикации; или существует другое подтверждение, предполагающее присутствие независимого нарушения сна, не вызванного каннабиноидами (например, повторные эпизоды в анамнезе, не связанные с психоактивным веществом/лекарственным средством).

D. Нарушение наблюдается не только во время делирия.

E. Нарушение вызывает клинически значимое расстройство или нарушение в социальной, профессиональной или других важных сферах жизнедеятельности.

Примечание: Этот диагноз следует ставить вместо диагноза отравления каннабиноидами или отмены каннабиноидов только тогда, когда симптомы Критерия A преобладают в клинической картине и когда они являются достаточно тяжелыми, чтобы служить основанием для клинического наблюдения.

"Интоксикационный делирий" следует диагностировать по следующим критериям:

A. Нарушение внимания (т.е. сниженная способность направлять, сосредотачивать, удерживать и переключать внимание) и осознанности (ухудшение ориентации в окружающей среде).

B. Нарушение развивается за короткий период времени (обычно от нескольких часов до нескольких дней), представляет изменение от исходного уровня внимания и восприятия, и имеет тенденцию к изменению тяжести в течение дня.

C. Дополнительное нарушение когнитивной функции (например, нарушение памяти, дезориентация, нарушение речи, зрительно-пространственной способности или восприятия).

D. Нарушения Критериев A и C не могут быть лучше объяснены присутствием другого, существовшего ранее, установившегося или развивающегося нейрокогнитивного нарушения, и не наблюдаются в контексте сильно сниженного уровня активации, такого как кома.

E. Существует подтверждение из анамнеза, объективного обследования или результатов лабораторного исследования, что нарушение является прямым физиологическим последствием отравления каннабиноидами или отмены каннабиноидов.

Диагноз каннабиноидного интоксикационного делирия следует ставить вместо отравления каннабиноидами, когда симптомы Критериев A и C преобладают в клинической картине и когда они являются достаточно тяжелыми, чтобы служить основанием для клинического наблюдения.

Диагноз делирия на фоне отмены каннабиноидов следует ставить вместо состояния отмены психоактивного вещества, когда симптомы Критериев A и C преобладают в клинической картине и когда они являются достаточно тяжелыми, чтобы служить основанием для клинического наблюдения.

При использовании в настоящем документе и в соответствии с DSM-5™, категория "Неуточненное связанное с каннабиноидом нарушение" относится к проявлениям, в которых симптомы, характерные для расстройства, связанного с каннабиноидами, которые вызывают клинически значимое расстройство или нарушение в социальной, профессиональной или других важных сферах жизнедеятельности, преобладают, но не соответствуют полным критериям каких-либо конкретных нарушений, связанных с каннабиноидами, или каких-либо нарушений в диагностическом классе нарушений, связанных с употреблением психоактивных веществ, и аддиктивных расстройств.

При использовании в настоящем документе "синдром каннабиноидного гиперемезиса" относится к проявлениям, характеризуемым употреблением каннабиноидов, циклическими эпизодами тошноты и рвоты, обычно связанными с частым принятием горячих ванн. Клиническое течение синдрома каннабиноидного гиперемезиса можно разделить на три фазы: продромальную, гиперемезию и фазу восстановления. Гипереметическая фаза обычно прекращается в течение 48 часов. Пациенты часто демонстрируют привычное поведение частого принятия горячих ванн, что приводит к временному прекращению тошноты, рвоты и болей в животе (Galli et al., 2011).

При использовании в настоящем документе "Вызванная каннабиноидами кататония" относится к проявлениям, характеризуемым использованием каннабиноидов, сопровождаемым состоянием, подобным кататоническому, с ограниченной подвижностью, внимательностью и чувствительностью к внешней стимуляции как преобладающей клинической симптоматики (Adams et al 2017, Khan et al., 2016).

Следовательно, настоящее изобретение относится к соединению Формулы (I):

для применения при лечении нарушения, связанного с каннабиноидами, выбранного из нарушения, связанного с употреблением каннабиноидов (CUD); отравления каннабиноидами; состояния отмены каннабиноидов; других вызванных каннабиноидами нарушений, неуточненного связанного с каннабиноидами нарушения; синдрома каннабиноидного гиперемезиса и вызванной каннабиноидами кататонии.

При использовании в настоящем документе "каннабиноиды" относятся к веществам, которые являются полными или частичными агонистами, действующими на каннабиноидные рецепторы. Каннабиноиды включают природные экстракты и синтетические соединения, также известные как подобные каннабису вещества.

Были описаны два главных типа каннабиноидных (CB) рецепторов: рецепторы CB1 и CB2.

Как правило, природные каннабиноиды могли быть выделены из растения Cannabis L., в особенности Cannabis sativa.

Со временем растительный материал, полученный из растения конопли Cannabis L., приобрел множество названий (например, травка, зелье, трава, косяк, марихуана, наркота, бханг, сканк, бум, гангстер, киф и ганджа). Лица, употребляющие каннабиноиды, могут употреблять либо части растения, например, цветок или листья, либо другой тип концентрированного экстракта растения, одним из которых является наиболее часто используемый гашиш. Компоненты растений или экстракты растений обычно курят или употребляют вместе с некоторыми пищевыми продуктами.

Каннабис является психоактивным растением, содержащим больше 500 компонентов, из которых в настоящее время были идентифицированы 104 каннабиноида.

Δ9-тетрагидроканнабинол (ТГК) является главным психоактивным компонентом в растении конопли. Активность каннабиса, прежде всего, оценивают по концентрации ТГК. По этой причине экстракт, содержащий чистый ТГК (чистое золото), может быть приобретен и используется потребителями каннабиноидов. Неблагоприятные эффекты после кратковременного или регулярного употребления каннабиса находится в прямой зависимости от концентраций ТГК в продукте (Lafaye et al., 2017).

Каннабидиол (КБД), каннабинол (КБН), каннабиварин (ТГКВ), каннабигерол (КБГ), каннабихромен (КБХ), дельта-8-ТГК, каннабициклол (КБЛ), каннабитриол (КБТ) и каннабиэлсоин являются одними из многих различных природных каннабиноидов, содержащихся в растении конопли. Большинство из них, как известно, обладают психоактивными свойствами.

Синтетические каннабиноиды связываются с каннабиноидными рецепторами и вызывают эффекты, подобные действию Δ9-тетрагидроканнабинола (ТГК). Некоторые примеры синтетических каннабиноидов описаны, но без ограничения, в Таблице 1.

Вещества, содержащие синтетические каннабиноиды (SCB), также известны под зарегистрированными патентованными наименованиями "Spice", "K2", "herbal incense", "Cloud 9", "Mojo".

Таблица 1: Примеры синтетических каннабиноидов

Следовательно, при использовании в настоящем документе связанные с каннабиноидами нарушения включают нарушения, связанные с употреблением каннабиноидов.

Термины "3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-он" или "C₂₉H₄₀O₃" или "3-β(пара-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-он" или "3pMBP" или "1-((3S,8S,9S,10R,13S,14S,17S)-3-(4-метоксибензил)-окси)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1H-циклопента[a]фенантрен-17-ил)этан-1-он" обозначают производное прегненолона согласно настоящему изобретению, имеющее следующую формулу (I):

Термин "лечение" или "способ лечения" или его эквивалент не предназначен в качестве абсолютного термина, и применетельно, например, к нарушениям, связанным с каннабиноидами, относится к процедуре или порядку действий, которые предназначены для уменьшения или устранения, или для облегчения одного или более симптомов нарушений, связанных с каннабиноидами.

Часто "лечение" или "способ лечения" нарушений, связанных с каннабиноидами, выполняют даже при низкой вероятности успеха, но, тем не менее, считается, что они вызывают общий положительный эффект. Лечение нарушений, связанных с каннабиноидами, относится, например, к задержке начала, уменьшению частоты одного или более симптомов или уменьшению тяжести одного или более симптомов, связанных с нарушением. В некоторых случаях частота и тяжесть одного или более симптомов снижается до непатологического уровня.

В частности, термин "лечение" или "способ лечения" нарушений, связанных с каннабиноидами, относится к улучшению клинических поведенческих или биологических критериев у субъекта. Например, "лечение" или "способ лечения" нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов, может относиться, в частности, к уменьшению количества и/или интенсивности критериев с 1 по 11, определенных выше для нарушений, связанных с употреблением каннабиноидов. Это также может относиться к предотвращению или задержке возникновения или снижению интенсивности клинических поведенческих или биологических критериев, связанных с другими нарушениями, связанными с каннабиноидами.

Настоящее изобретение также относится к способу производства соединения Формулы (I), который включает три химических стадии, из легко доступного исходного материала прегненолона.

Следовательно, настоящее изобретение относится к способу производства соединения Формулы (I), включающему:

- Первую стадию защиты прегненолона:

до соединения Формулы (IV):

- Вторую стадию, в которой указанное соединение Формулы (IV) реагирует с соединением Формулы (III):

с получением соединения Формулы (II):

- Третью стадию, в которой соединение Формулы (II), подвергают снятию защиты с получением соединения Формулы (I):

Способ производства соединения Формулы (I) описан на Фигуре 1.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, включающей соединение Формулы (I):

и по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Форма фармацевтической композиции, путь введения, доза и схема применения обычно зависят от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, возраста, веса и пола пациента, и т.д.

Хотя соединение настоящего изобретения можно вводить отдельно, предпочтительно включать его в состав фармацевтической композиции в соответствии со стандартной фармацевтической практикой. Таким образом, в изобретении также предложена фармацевтическая композиция, включающая соединение формулы (I) в смеси по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

Также в настоящем изобретении предложен способ получения фармацевтической композиции, который включает смешивание соединения Формулы (I) по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом.

Фармацевтическая композиция, как правило, будет включать по меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Приемлемые вспомогательные вещества для терапевтического применения известны в области фармацевтики и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, 21st Edition 2011. Выбор фармацевтического вспомогательного вещества может быть сделан в соответствии с предполагаемым путем введения и стандартной фармацевтической практикой. Вспомогательное вещество должно быть приемлемым в том смысле, что оно не должно быть токсичным для реципиента. По меньшей мере одно фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество может быть, например, связующим веществом, разбавителем, носителем, смазывающим веществом, разрыхлителем, смачивающим веществом, диспергирующим веществом, суспендирующим веществом и т.п.

Пути введения (доставки) указанного выше соединения включают, без ограничения перечисленными: пероральный (например, в виде таблетки, капсулы или в виде раствора для приема внутрь), наружный, мукозальный (например, в виде назального спрея или аэрозоля для ингаляции), назальный, желудочно-кишечный, интраспинальный, внутрибрюшинный, внутримышечный, внутривенный, внутриматочный, внутриглазной, внутрикожный, внутричерепной, интратрахеальный, интравагинальный, интрацеребровентрикулярный, интрацеребральный, подкожный, офтальмологический (включая интравитреальный или интракамеральный), трансдермальный, ректальный, буккальный, эпидуральный, подъязычный.

Предпочтительные пути введения включают пероральный, мукозальный, парентеральный и подъязычный.

Например, соединение могут вводить перорально в форме таблеток, таблеток с оболочкой, пилюль, капсул, мягких желатиновых капсул, порошков для приема внутрь, гранул, суппозиториев, настоек, растворов или суспензий, которые могут содержать ароматизаторы или красители, для применения путем немедленного, отсроченного, модифицированного, замедленного, импульсного или контролируемого высвобождения.

Таблетки могут содержать вспомогательные вещества, такие как микрокристаллическую целлюлозу, лактозу, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция и глицин, разрыхлитель, такой как крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный крахмал или крахмал тапиоки), натрий крахмалгликолят, натрий кроскармеллозу и некоторые сложные силикаты, связующее вещество, такое как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлозу (ГПМЦ), гидроксипропилцеллюлозу (ГПЦ), сахарозу, желатин и гуммиарабик, смазывающее вещество, такое как стеарат магния, стеариновую кислоту, глицерилбегенат. Твердые композиции аналогичного типа также могут использоваться в качестве наполнителей в твердых желатиновых капсулах. Предпочтительные вспомогательные вещества в этом случае включают лактозу, сахарозу, сорбит, маннит, картофельный крахмал, кукурузный крахмал, амилопектин, производные целлюлозы или желатин. Твердые желатиновые капсулы могут содержать гранулы соединения согласно изобретению.

Мягкие желатиновые капсулы могут быть изготовлены при использовании капсул, содержащих соединение согласно изобретению, растительное масло, воски, жир или другой подходящий растворитель для мягких желатиновых капсул. В качестве примера приемлемым растворителем может быть масляный носитель, такой как растительное масло из длинноцепочечных триглицеридов (например, кукурузное масло).

Диспергируемые порошки и гранулы, подходящие для приготовления водной суспензии путем добавления воды, могут содержать активный ингредиент в смеси с диспергирующими веществами, смачивающими веществами и суспендирующими веществами и одним или более консервантами. Также могут присутствовать дополнительные вспомогательные вещества, например подсластители, ароматизаторы и красители. Такие композиции можно консервировать путем добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые растворы, эмульсии, суспензии, сиропы и настойки, содержащие инертные разбавители, обычно используемые в данной области, такие как воду или масляный носитель. Жидкая лекарственная форма может быть представлена в виде сухого продукта для смешивания с водой или другим подходящим растворителем перед применением. Такие композиции также могут включать вспомогательные вещества, такие как смачивающие вещества, эмульгаторы и суспендирующие вещества, комплексообразователи, такие как 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрин, сульфобутилэфир-бета-циклодекстрин, а также подсластители, ароматизаторы, отдушки, красящие вещества или красители с такими разбавителями, как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин, а также их комбинации. Эти композиции можно консервировать путем добавления антиоксиданта, такого как бутилгидроксианизол или альфа-токоферол.

Тонко измельченный порошок соединения согласно изобретению может быть изготовлен, например, с помощью микронизации или процессов, известных в уровне техники. Соединение согласно изобретению можно молоть с использованием известных процедур размола, таких как влажный размол, с получением частиц с размером, подходящим для формования таблеток и составов других типов.

Если соединение согласно настоящему изобретению вводят парентерально, то примеры такого введения включают одно или более из: внутривенного, внутриартериального, внутрибрюшинного, интратекального, интравентрикулярного, интрауретрального, внутригрудинного, интракраниального, внутримышечного или подкожного введения средства; и/или при использовании методов инфузии.

Соединение согласно изобретению могут вводить парентеральным путем с готовым доступным составом или составом депо-типа.

Фармацевтические композиции для парентерального введения готового доступного состава могут быть в форме стерильного водного или масляного раствора или суспензии для инъекций в нетоксичном, парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, и могут содержать вспомогательные вещества, такие как суспендирующие, стабилизирующие, диспергирующие, смачивающие и/или комплексообразующие вещества, такие как циклодекстрин, например, 2-гидроксипропил-бета-циклодекстрин, сульфобутилэфир-бета-циклодекстрин.

Состав депо-типа для парентерального введения может быть изготовлен обычными методами с фармацевтически приемлемым вспомогательным веществом, включающим, без ограничения перечисленными, биосовместимые и биоразлагаемые полимеры (например, поли(β-капролактон), полиэтиленоксид, полигликолевую кислоту, сополимер молочной и гликолевой кислоты..., поли молочную кислоту..., бионеразлагаемые полимеры (например, сополимер этилена и винилацетата, полиуретан, полиэфирамид, поливинилхлорид …), водные и неводные носители (например, воду, кунжутное масло, хлопковое масло, соевое масло, касторовое масло, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла, пропиленгликоль, ДМСО, ТГФ, 2-пирролидон, N-метилпирролидинон, N-винилпирролидинон …).

В альтернативе активный ингредиент может находиться в сухой форме, такой как порошок, кристаллическое или лиофилизированное твердое вещество, для восстановления подходящим носителем. Изготовление подходящих парентеральных составов в стерильных условиях легко осуществляется с помощью стандартных фармацевтических методов, хорошо известных специалистам в данной области.

Как указано, соединение согласно настоящему изобретению можно вводить интраназально или путем ингаляции, и его удобно доставлять в форме ингалятора сухого порошка или аэрозольного спрея из контейнера под давлением, насоса, спрея или небулайзера с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторметана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана (например, производства Ineos Fluor), диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением единица дозы может быть определена с помощью клапана для доставки дозируемого количества. Контейнер под давлением, насос, спрей или небулайзер могут содержать раствор или суспензию действующего соединения. Капсулы и картриджи (изготовленные, например, из желатина) для применения в ингаляторе или инсуффляторе могут быть изготовлены так, чтобы они содержали порошковую смесь соединения и подходящую порошковую основу, такую как лактозу или крахмал. Для композиций, подходящих и/или предназначенных для ингаляционного введения, предпочтительно, чтобы соединение или соль формулы (I) находились в форме с уменьшенным размером частиц, при этом более предпочтительно форма с уменьшенным размером получена или может быть получена путем микронизации. Предпочтительный размер частиц соединения с уменьшенным размером частиц (например, микронизированного), соли или сольвата определяется значением D50 от приблизительно 0,5 до приблизительно 50 микрон (например, при измерении с помощью лазерной дифракции).

В альтернативе соединение согласно настоящему изобретению могут вводить в форме суппозитория или пессария, или его можно применять наружно в форме геля, гидрогеля, лосьона, раствора, крема, мази или присыпки. Соединение согласно настоящему изобретению также можно вводить дермально или трансдермально, например, с использованием кожного пластыря. Их также можно вводить легочным или ректальным путем. Его также можно вводить глазным путем. Для офтальмологического применения соединение может быть изготовлено в виде микронизированных суспензий в изотоническом, pH-отрегулированном стерильном физиологическом растворе или, предпочтительно, в виде растворов в изотоническом, pH-отрегулированном стерильном физиологическом растворе, необязательно в комбинации с консервантом, таким как хлорид бензалкония. В альтернативе оно может быть изготовлено в виде мази, такой как петролатум.

Для наружного применения на коже средство согласно настоящему изобретению может быть изготовлено в виде подходящей мази, содержащей действующее соединение, суспендированное или растворенное, например, в смеси с одним или более следующими компонентами: минеральное масло, вазелиновое масло, вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, соединение полиоксипропилена, эмульгирующий воск и вода. В альтернативе оно может быть изготовлено в виде подходящего лосьона или крема, суспендированного или растворенного, например, в смеси одного или более следующих компонентов: минеральное масло, сорбитан моностеарат, полиэтиленгликоль, вазелиновое масло, полисорбат 60, воск цетиловых эфиров, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и вода.

Как правило, врач определяет фактическую дозу, которая будет наиболее подходящей для отдельного субъекта. Конкретный уровень дозы и частота введения доз для любого конкретного лица могут изменяться и будут зависеть от множества факторов, включающих активность конкретного применяемого соединения и продолжительность действия этого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, питание, способ и время приема, скорость выведения, комбинацию лекарственных средств, тяжесть конкретного состояния и пациента, проходящего терапию.

Вышеуказанное соединение могут вводить субъекту для применения при лечении заболеваний, связанных с каннабиноидами, в любой дозе, подходящей для получения терапевтического эффекта.

Для перорального и парентерального введения человеку ежедневный уровень дозы средства может содержаться в одной или дробных дозах.

Предложенный диапазон дозы соединения согласно настоящему изобретению для введения человеку (весом приблизительно 70 кг), составляет, включая, но без ограничения, от 1 мкг до 1000 мг, более типично от 1 мкг до 500 мг, более типично от 1 мкг до 100 мг, более типично от 1 мкг до 50 мг, более типично от 1 мкг до 10 мг, более типично от 1 мкг до 5 мг, более типично от 1 мкг до 1 мг, более типично от 1 мкг до 600 мкг, более типично от 1 мкг до 200 мкг, более типично от 1 мкг до 100 мкг, более типично от 1 мкг до 60 мкг, более типично от 10 мкг до 1000 мг, более типично от 10 мкг до 500 мг, более типично от 10 мкг до 100 мг, более типично от 10 мкг до 50 мг, более типично от 10 мкг до 10 мг, более типично от 10 мкг до 5 мг, более типично от 10 мкг до 1 мг, более типично от 10 мкг до 600 мкг, более типично от 10 мкг до 200 мкг, более типично от 10 мкг до 100 мкг, более типично от 20 мкг до 1000 мг, более типично от 20 мкг до 600 мг, более типично от 20 мкг до 200 мг, более типично от 20 мкг до 60 мг, более типично от 20 мкг до 20 мг, более типично от 20 мкг до 6 мг, более типично от 20 мкг до 2 мг, более типично от 20 мкг до 600 мкг, более типично от 20 мкг до 200 мкг действующего веществв на стандартную дозу, в расчете на вес свободной кислоты. Стандартную дозу могут вводить, например, 1-4 раза в день. Доза будет зависеть от пути введения. Следует понимать, что может потребоваться сделать обычные коррекции дозы в зависимости от возраста и веса пациента, а также тяжести состояния. Доза также будет зависеть от пути введения. Точную дозу и способ введения, в конечном счете, будет определять лечащий врач или ветеринар.

"Подходящая доза", "эффективное количество" соединения согласно изобретению относится к эффективному количеству, достаточному для предотвращения, уменьшения, устранения, контроля, лечения или ингибирования нарушения, связанного с каннабиноидами. Термин "контроль" предназначен для обозначения всех процессов, в которых может происходить замедление, прерывание, прекращение или остановка прогрессирования заболеваний и состояний, описанных в настоящем документе, но не обязательно указывает на полное устранение всех симптомов заболеваний и состояний. Дозы, используемые для введения, могут быть адаптированы в зависимости от различных параметров, в частности, в зависимости от используемого способа введения, соответствующей патологии или, альтернативно, от требуемой продолжительности лечения. Обычно форма фармацевтической композиции, путь введения, доза и схема применения зависят от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, возраста, веса и пола субъекта, и т.д. Диапазоны эффективной дозы, представленные ниже, не должны ограничивать изобретение и представляют собой предпочтительные диапазоны доз. Однако предпочтительная доза может быть скорректирована для отдельного субъекта, как это известно, и может быть определена специалистом в данной области, без излишних экспериментов.

Изобретение также относится к способу лечения нарушений, связанных с каннабиноидами, у нуждающегося в этом субъекта, включающему введение эффективного количества соединения Формулы (I):

указанному пациенту.

Весь вариант осуществления, раскрытый выше, охвачен этим аспектом.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к применению соединения Формулы (I):

для лечения нарушения, связанного с каннабиноидами.

Весь вариант осуществления, раскрытый выше, охвачен этим аспектом.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к применению соединения Формулы (I):

для производства фармацевтического препарата для лечения нарушения, связанного с каннабиноидами.

Весь вариант осуществления, раскрытый выше, охвачен этим аспектом.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Синтез, получение и изготовление состава 3 p MBP

3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-он (3pMBP) является химическим соединением, содержащим 7 хиральных центров 3S, 8S, 9S, 10R, 13S, 14S, 17S, как описано в Формуле (I):

Стереохимическая конфигурация в этих центрах идентична конфигурации исходного соединения, прегненолона.

Получение 3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-она (3pMBP)

Получение 3pMBP описано на фигуре 1 и ниже

Стадия 1: Получение соединения Формулы (IV): (3S,8S,9S,10R,13S,14S,17S)-10,13-диметил-17-(2-метил-1,3-диоксолан-2-ил)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1H-циклопента[a]фенантрен-3-ол

Стадию 1 проводили одной партией. Этиленгликоль (11,676 кг), прегненолон (6,992 кг) и пара-толуолсульфоновую кислоту (0,840 кг, 4,42 моль, 0,2 экв.) вносили в реактор. Реакционную смесь перемешивали при температуре от 15°C до 25°C в течение 25 мин. Триэтилортоформиат (20,939 кг) добавляли тремя порциями и перемешивали смесь в течение по меньшей мере 1 часа при температуре от 15°C до 25°C. После завершения реакции реакционную смесь собирали и медленно вливали в раствор бикарбоната натрия (2,943 кг в 35,5 л воды) при температуре от 0°C до 10°C. В конце добавления реакционную смесь перемешивали при температуре от 0°C до 10°C в течение 1 ч, после чего реакционную смесь фильтровали и промывали водой (12 л). Фильтрат также промывали 2-пропанолом (12 л) и сушили в вакууме в токе азота. Высушенное твердое вещество собирали и вносили в реактор с 2-пропанолом (35 л). Суспензию нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь охлаждали до температуры от 0°C до 10°C, после чего перемешивали в течение 2 ч. Твердое вещество отфильтровывали и промывали 2-пропанолом (12 л), после чего сушили в вакууме в токе азота. Соединение Формулы (IV) (8,031 кг) получали с выходом 100,8% (некорректированный выход).

Стадия 2: Получение соединения Формулы (II): 2-(3S,8S,9S,10R,13S,14S,17S)-3-(4-метоксибензил)окси)-10,13-диметил-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-тетрадекагидро-1H-циклопента[a]фенантрен-17-ил)-2-метил-1,3-диоксолан

Соединение Формулы (IV) (3,460 кг) и тетрагидрофуран (ТГФ) (69 л) вносили в реактор. Реакционную смесь перемешивали при температуре от 20°C до 25°C в течение 80 минут. Реакционную смесь фильтровали и раствор соединения Формулы (IV) в ТГФ вводили в реактор. К раствору Соединения Формулы (IV) в ТГФ порциями добавляли t-BuOK (2,835 кг) при температуре от 20°C до 25°C. В конце добавления к реакционной смеси через капельную воронку добавляли пара-метоксибензилхлорид Формулы (III) (2,832 кг) и ТГФ (4 л). Реакционную смесь нагревали при температуре от 38°C до 42°C. В реакционную смесь порциями вводили TBAI (1,555 кг) при температуре от 38°C до 42°C. Реакционную смесь нагревали при температуре от 55°C до 60°C в течение 16 ч 30 мин.

После завершения реакции реакционную смесь выпаривали в вакууме с отгонкой от 34 л до 36 л ТГФ. Затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры.

В реактор вводили воду (52 л), затем охлаждали при температуре от 0°C до 10°C. Реакционную смесь осторожно вливали в воду при поддержании температуры от 0°C до 10°C. В конце добавления реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч 50 мин при температуре от 0°C до 10°C. Реакционную смесь фильтровали и промывали водой (13 л). Фильтрат промывали ацетонитрилом (13,5 л) и твердое вещество сушили в вакууме в токе азота в течение 4 дней.

Твердое вещество собирали и вносили в реактор с ацетонитрилом (13 л). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 4 ч. Дополнительный ацетонитрил (11 л) вводили в реактор и нагревали с обратным холодильником до получения прозрачного раствора. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 14 ч. Реакционную смесь охлаждали до температуры от 0°C до 10°C, перемешивали в течение 45 минут при температуре от 0°C до 10°C и затем фильтровали. В реакторе вводили ацетонитрил (10,5 л), охлаждали до температуры от 0°C до 10°C, затем добавляли на фильтр для промывки фильтрата и сушили твердое вещество в вакууме в токе азота в течение 21 ч. Соединение Формулы (II) (2,449 кг) получали с выходом 59,2%.

Стадия 3: Получение соединения Формулы (I): 3 p MBP

Соединение Формулы (II) (2,448 кг) и дихлорметан (10 л) вносили в реактор. Раствор перемешивали в течение 20 минут. В раствор добавляли 1М соляную кислоту (4,9 л) при температуре от 15°C до 25°C. Реакционную смесь перемешивали до завершения реакции при температуре от 15°C до 25°C. Дихлорметан (8 л) добавляли (до полного растворения осадка) и позволяли фазам разделиться. Органический слой два раза промывали водой (5 л). Органический слой собирали и вводили с 2-пропанолом (24,5 л) в реактор при температуре от 15°C до 25°C. Реакционную смесь выпаривали в вакууме при температуре ниже 40°C. После завершения реакции реакционную смесь нагревали с обратным холодильником. Добавляли 2-пропанол (40 л), пока раствор не становился прозрачным. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь охлаждали при температуре от 0°C до 10°C, перемешивали в течение 1 ч при температуре от 0°C и 10°C. Твердое вещество отфильтровывали и промывали 2-пропанолом (5 л), затем сушили в вакууме в токе азота при нагревании фильтра при температуре от 35°C до 45°C в течение 20 ч. Соединение Формулы (I) (1,907 кг) получали с выходом 85,8%.

Фармацевтическая композиция

3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-он может быть изготовлен в лекарственной форме в виде капсулы, содержащей раствор 3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-она в кукурузном масле. Состав этой лекарственной формы описан в таблице 2.

В настоящем изобретении представлен пример изготовления мягких желатиновых капсул, содержащих соответственно 20 мкг, 0,2 мг и 2 мг раствора 3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-она в кукурузном масле.

Этапы, составляющие процесс производства, могут быть кратко описаны следующим образом:

1. 3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-он перемешивали в кукурузном масле до полного растворения.

2. Затем раствором 3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-она этапа 1 наполняли мягкую желатиновую капсулу.

Все вспомогательные вещества соответствуют статьям Европейской фармакопеи (Ph. Eur.) и статьям Национального Формуляра фармакопеи США (USP-NF).

Таблица 2: Состав мягких желатиновых капсул 3-β(4-метоксибензилокси)прегн-5-ен-20-она
	Капсула 0,02 мг	Капсула 0,20 мг	Капсула 2,00 мг
3pMBP	0,020 мг	0,200 мг	2,000 мг
Кукурузное масло	96,980 мг	969,800 мг	969,000 мг
Диоксид титана	1,04 мг	5,29 мг	5,29 мг
Глицерин 85%	21,61 мг	134,77 мг	134,77 мг
Желатин,	47,79 мг	232,02 мг	232,02 мг
Общая масса	167,44 мг	1342,08 мг	1342,08 мг

Пример 2: Специфическое ингибирование активности рецептора CB1 под действием 3 p MBP

Понимание действия соединения настоящего изобретения, 3pMBP, на активность рецептора CB1 исследовали путем изучения действия 3pMBP на следующие клеточные эффекты, вызванные активацией рецептора CB1 под действием ТГК. Специфичность действия 3pMBP на рецептор CB1 изучали путем анализа влияния этого соединения на связывание других 85 рецепторов.

Материалы и методы

Действие 3pMBP на ТГК-индуцированное повышение фосфорилирования MAPK:

Цель данного исследования состояла в оценке эффектов 3pMBP на повышение фосфорилирования Erk1/2MAPK, обычно называемой MAPK (митоген-активируемой протеинкиназы), вызванное введение ТГК в эмбриональные клетки почки человека 293 (HEK-293), стабильно или транзиентно трансфицированные человеческим рецептором CB1 (hCB1).

Клетки HEK-293 были выбраны, потому что они не экспрессируют эндогенные рецепторы CB1, они могут быть легко трансфицированы и ранее использовались в экспериментах по исследованию in vitro активности рецептора CB1 (Shore et al., 2014) и в экспериментах, демонстрирующих, что прегненолон способен ингибировать ТГК-индуцированное фосфорилирование MAPK (Vallee et al., 2014).

Исследовали действие 3pMBP в трех дозах (1 нМ, 10 нМ и 100 нМ, растворенных в ацетонитриле 0,01%) на эффект ТГК в количестве 1 мкМ (растворенный в EtOH 6.2e-4%, Эксперимент 1) и 10 мкм (растворенный в EtOH 6.2e-3%, Эксперимент 2) на фосфорилирование MAPK. Различие в концентрациях ТГК, используемых в двух экспериментах, связано с разной эффективностью трансфекции плазмиды кДНК hCB1, которая является стабильной в Эксперименте 1 и транзиентной в Эксперименте 2. Обработка ТГК и 3pMBP была параллельной и продложалась 5 мин.

Фосфорилирование MAPK (белки P-Erk1/2MAPK) измеряли с помощью Вестерн-блоттинга. В эксперименте 1 митохондриальный маркер CoxIV и в эксперименте 2 нефосфорилированные белки MAPK использовали в качестве контролей нанесения. Вычисляли отношения P-MAPK/CoxIV и P-MAPK/MAPK, данные приведены в % клеток, обработанных растворителем.

Влияние 3pMBP на ТГК-индуцированное снижение цАМФ

Цель данного исследования состояла в оценке эффектов 3pMBP на снижение цАМФ, вызванное введение ТГК в клетки яичников китайского хомячка (CHO), стабильно экспрессирующие человеческий рецептор CB1, CHO-hCB1.

Клетки CHO-hCB1 были выбраны в этих экспериментах, потому что они эндогенно не экспрессируют рецептор CB1 и ранее использовались в экспериментах по изучению действия агонистов CB1 (Rinaldi-Carmona, 1996), включая ТГК, на цАМФ и P-MAPK.

Исследовали действие 3pMBP в четырех дозах (1 нМ, 10 нМ, 100 нМ и 1 мкМ, растворенные в N, N-диметилформамиде 0,01%) против функциональной зависимости доза-эффект ТГК (0,3 нМ, 1 нМ, 3 нМ, 10 нМ, 30 нМ, 100 нМ и 300 нМ, растворенного в этаноле 0,0063%).

Клетки CHO-CB1-C2 обрабатывали путем параллельного добавления ТГК и тестируемого соединения в течение 45 минут. Форсколин (2,5 мкм) также одновременно добавляли во всех исследуемых условиях для поддержания базального уровня цАМФ. В конце обработки клетки лизировали для проведения количественного определения цАМФ. Все измерения проводили в тройной повторности в одном эксперименте.

Количественное определение цАМФ проводили с помощью конкурентного флуоресцентного иммуноанализа. Данные выражены в % Дельта флуоресценции (Дельта F), который вычисляли следующим образом: Дельта F % = (Флуоресценция образца - Флуоресценция отрицательного контроля)/Флуоресценция отрицательного контроля.

Влияние 3pMBP на ТГК-индуцированное уменьшение клеточного дыхания

Цель данного исследования состояла в исследовании действия 3pMBP на ингибирование клеточного дыхания, вызванное ТГК (1 мкМ) в клетках HEK-293, транзиентно трансфицированных человеческими рецепторами CB1 (hCB1).

Клетки HEK-293, транзиентно трансфицированные экспрессионной плазмидой hCB1, сначала обрабатывали 3pMBP (0, 1, 10 и 100 нМ, растворенные в ацетонитриле 0,01%). Через 15 мин инкубирования в чашки для культивирования добавляли ТГК (0, 1 мкМ, растворенный в EtOH 0,0034%) на 30 минут.

Клеточное дыхание измеряли на калиброванном респирометре, снабженном электродом Кларка. Скорость поглощения кислорода (ОС) использовали для измерения клеточного дыхания. Действие ТГК в отсутствие и в присутствии 3pMBP на скорость OC выражали в процентах от исходного уровня OC клетки, обработанной растворителем 3pMBP и растворителем ТГК в том же эксперименте. Было проведено 10 независимых экспериментов с получением n=10 на каждое условие эксперимента. Каждый эксперимент включал n=5, содержащие n=1 на экспериментальную группу.

Селективность связывания 3pMBP in vitro:

Данная серия анализов направлена на оценку специфичности связывания 3pMBP путем ее сравнения с профилем прегненолона.

Была протестирована потенциальная способность 3pMBP и прегненолона в концентрации 10 мкМ вытеснять связывание лигандов 85 рецепторов (высокопроизводительный профиль CEREP+4 стероидных рецептора+каннабиноидный рецептор 2 типа). Высокопроизводительный профиль CEREP состоит из 80 трансмембранных и растворимых рецепторов, ионных каналов и рецепторов, сопряженных с G-белком. Он был специально разработан для получения информации с целью определения приоритета наиболее перспективных соединений в процессе отбора потенциальных кандидатов. Рецепторы андрогенов, эстрогенов, прогестерона и PXR, а затем в этот анализ были добавлены каннабиноидные рецепторы 2 типа, чтобы лучше адаптировать анализ к 3pMBP, дополняя спектр стероидных рецепторов, уже содержащихся в высокопроизводительном профиле CEREP.

Результаты

3pMBP имеет профиль, подобный eCB1-SSi прегненолону. 3pMBP ингибирует ТГК-индуцированное повышение фосфорилирования MAPK (ФИГУРА 2A И 2B) и ТГК-индуцированное уменьшение клеточного дыхания (IC50=1,2-11 нМ) в клетках HEK-293, стабильно или транзиентно трансфицированных hCB1 (ФИГУРА 2D).

В отличие от этого 3pMBP не ингибировал ТГК-индуцированное снижение цАМФ в клетках CHO, стабильно экспрессирующих рецептор CB1 человека, CHO-hCB1 (ФИГУРА 2C).

Кроме того, 3pMBP (10 мкм) не изменял связывание ни одного из 85 рецепторов, протестированных in vitro с помощью высокопроизводительного профиля CEREP, включающего основные стероидные рецепторы, рецепторы PXR и рецепторы CB1 и CB2. В этом отношении 3pMBP было более селективным, чем прегненолон (10 мкМ), вытеснвший (>80%) связывание глюкокортикоидных, андрогеновых и прогестероновых рецепторов, и в меньшей степени (>40%) связывание центральных и периферических бензодиазепиновых рецепторов.

Эффекты 3pMBP представлены в приведенной ниже таблице:

Таблица 3: In vitro оценка механизма действия 3pMBP
Действие 3pMBP на:	Тест-система	ID50	ID100	% ингибирования
ТГК-индуцированное повышение фосфорилирования MAPK в клетках, стабильно экспрессирующих hCB1	HEK-293	1,2 нМ	10 нМ	60
ТГК-индуцированное повышение фосфорилирования MAPK в клетках, транзиентно экспрессирующих hCB1	HEK-293	11 нМ	100 нМ	100
ТГК-индуцированное снижение цАМФ	CHO	>1 мкМ	--	NA
ТГК-индуцированное снижение клеточного дыхания	HEK-293	8 нМ	100 нМ	57
Высокопроизводительный профиль связывания CEREP (85 рецепторов)	Связывание рецепторов	>10 мкМ	--	NA
NA=Не исследовали, поскольку не обнаружили эффекта

Выводы

Следовательно, 3pMBP in vitro действует как сигнально-специфический ингибитор CB1 (CB1-SSi). Таким образом, 3pMBP в линиях клеток, экспрессирующих человеческий рецептор CB1, (hCB1) ингибировал ТГК-индуцированное повышение фосфорилирования MAPK (митоген-активируемой протеинкиназы) и ТГК-индуцированное уменьшение клеточного дыхания. В отличие от этого, 3pMBP не ингибировал ТГК-индуцированное снижение цАМФ (циклического аденозинмонофосфата).

Кроме того, 3pMBP in vitro является более селективным, чем эндогенный сигнально-специфический ингибитор прегненолон. Фактически, прегненолон (10 мкМ) вытесняет связывание (>80%) прогестероновых, глюкокортикоидных и андрогеновых рецепторов, а также связывание бензодиазепиновых рецепторов (>40%). 3pMBP (10 мкМ) не изменял связывание этих рецепторов и ни одного из других рецепторов (в общей сложности 85), которые исследовали с помощью высокопроизводительного профиля CEREP.

Пример 3: Доклиническая оценка 3 p MBP в качестве средства для лечения нарушений, связанных с каннабиноидами

В следующих доклинических исследованиях 3pMBP солюбилизировали в кукурузном масле, растительном масле с длинноцепочечными триглицеридами, которое можно безопасно использовать у человека. Этот липидный состав вводили перорально через зонд в виде жидкости.

Активация рецептора CB1 может вызывать связанные с каннабиноидами нарушения и связанные с ними нежелательные последствия за счет двух дополнительных эффектов:

1. Безусловные фармакодинамические эффекты каннабиноидов, которые включают глубокие когнитивные, мотивационные и поведенческие нарушения. Эти три эффекта могут синергически вызывать тяжелые последствия при различных типах нарушений, связанных с каннабиноидами. В частности, они ответственны за: a. Нарушение социальных отношений и снижение удовлетворенности жизнью; b. Более низкие результаты обучения, более низкий доход, более сильную зависимость от социального обеспечения и безработицу, особенно для наиболее уязвимой группы населения (14-25 лет); c. психические расстройства, включающие, без ограничения, депрессию, тревогу и психоз; и d. Сопротивление психологическому лечению;

2. Обусловленные эффекты каннабиноидов, приводящие к развитию поиска каннабиноидов, регулярному употреблению и, в конечном итоге, к зависимости от каннабиноидов. Способность каннабиноидов обусловливать поведение, которое приводит к зависимости от каннабиноидов, затрудняет прекращение употребления каннабиноидов и способствует рецидиву после периода отмены, что приводит к постоянному воздействию нежелательных эффектов каннабиноидов.

На основе предыдущих наблюдений идеальное фармакологическое лечение нарушений, связанных с каннабиноидами, должно быть способно:

1. Противодействовать широкому спектру безусловных эффектов каннабиноидов, чтобы уменьшить негативное воздействие от употребления каннабиноидов на функционирование головного мозга и поведение.

2. Облегчать уменьшение употребления и снижать возобновление употребления каннабиноидов после прекращения, чтобы уменьшить воздействия каннабиноидов на мозг и их негативные последствия.

Эти два комбинированных эффекта, создающие цепь положительной прямой связи (уменьшение эффектов каннабиноидов и уменьшение употребляемого количества каннабиноидов), должны обеспечивать мощное средство для лечения различных нарушений, связанных с каннабиноидами.

С учетом этих соображений доклиническая оценка потенциала 3pMBP для лечения нарушений, связанных с каннабиноидами, была выполнена путем изучения:

1. Нескольких поведенческих моделей, воспроизводящих безусловные эффекты агонистов CB1 у лиц, употребляющих каннабиноиды. В этих исследованиях использовали активное начало каннабиса, ТГК, поскольку это один из наиболее часто используемых каннабиноидов у человека.

2. Нескольких поведенческих моделей (на мышах и приматах кроме человека), оценивающих способность ТГК и синтетических каннабиноидов обусловливать поведение и вызвать зависимость.

1. Ингибирование безусловных эффектов ТГК под действием 3pMBP

Исследовали ингибирование при пероральном введении 3pMBP описанных ниже безусловных поведенческих и нейрохимических эффектов ТГК, ассоциированных с нарушениями, связанными с каннабиноидами:

a. ТГК-индуцированное увеличение потребления пищи;

b. ТГК-индуцированное увеличение психомоторной стимуляции;

c. ТГК-индуцированное нарушение преимпульсного ингибирования;

d. ТГК-индуцированные нарушение памяти;

e. ТГК-индуцированное нарушение социального взаимодействия;

f. ТГК-индуцированное нарушение исследования реальности;

g. ТГК-индуцированная каталепсия;

h. ТГК-индуцированное поведение раскрывания рта;

i. ТГК-индуцированный выброс дофамина в прилежащем ядре.

a. ТГК-индуцированное увеличение потребления пищи

В этих экспериментах стремились оценить способность 3pMBP ингибировать увеличение потребления пищи, вызванное введением ТГК у мышей. Это поведение было выбрано, поскольку у лиц, употребляющих каннабис, наблюдается нарушение пищевого поведения со склонностью к гиперфагии и предпочтению приемлемой пищи сразу после употребления наркотического средства (Kirkham, 2005).

Материалы и методы

Влияние ТГК на потребление пищи изучали при использовании модели ограничения-возобновления кормления (Bellochio et al., 2010) у самцов мышей CB1^f/f. Исследовали действие 3pMBP в трех дозах (5, 15 и 50 мкг/кг) на увеличение потребления пищи, вызванное ТГК (1 мг/кг; в/б) у мышей после 24-часового ограничения доступа к пище с возобновлением кормления через 30 минут после введения ТГК. Потребление пищи измеряли в течение одного часа. Независимые группы животных (по меньшей мере n=8 в группе) использовали для каждого условия лечения. 3pMBP вводили за три часа до введения ТГК.

Результаты

Как описано на Фигуре 3A, 3pMBP ингибирует (ID₅₀≈15 и ID₁₀₀≈50 мкг/кг) увеличение потребления пищи, вызванное ТГК (1 мг/кг) у мышей.

b. ТГК-индуцированное увеличение психомоторной стимуляции

В этих экспериментах стремились оценить способность 3pMBP ингибировать увеличение психомоторной стимуляции, вызванное введением ТГК у мышей. Это поведение было выбрано, поскольку его считают суррогатной моделью подобных психотическим симптомов, которые могут быть вызваны употреблением каннабиса (Wiley et al., 2008; DSM 5^TH ed, 2013).

Материалы и методы

ТГК-индуцированную психомоторную стимуляцию изучали у самцов мышей C57BL/6N путем измерения двигательной активности в открытом поле с разделенном на квадраты полом. Передвижение оценивали через 45 минут после введения ТГК в течение 5 минут путем подсчета количества пересекаемых квадратов и выражали в процентах от контрольных животных, получавших растворитель.

Исследовали действие 3pMBP в пяти дозах (0,00015, 0,0005, 0,0015, 0,015 и 0,15 мг/кг) на увеличение двигательной активности, вызванное ТГК (0,3 мг/кг). Независимые группы животных (по меньшей мере n=9 в группе) использовали для каждой дозы 3pMBP. 3pMBP вводили за три часа до введения ТГК.

Результаты

3pMBP ингибирует (ID₅₀≈0,0004 и ID₁₀₀≈0,0015 мг/кг) психомоторную стимуляцию, вызванную ТГК (0,3 мг/кг) у мышей (Фигура 3B).

c. ТГК-индуцированное нарушение преимпульсного ингибирования

В этих экспериментах стремились оценить способность 3pMBP ингибировать нарушение фильтрации сенсорной информации, вызванное введением ТГК у мышей, изучаемое в анализе преимпульсного ингибирования (PPI). Это поведение было выбрано, поскольку оно представляет собой модель нарушения сенсомоторной фильтрации, наблюдаемого во время психоза (DSM 5^th ed., 2013; Kedzior et al., 2006), который, как было показано, был вызыван ТГК (Nagai, 2006).

Материалы и методы

Исследовали действие 3pMBP в пяти дозах (0,0005, 0,0015, 0,015, 0,03 и 0,05 мг/кг) на нарушение PPI, вызванное ТГК (10 мг/кг) у самцов мышей C57BL/6N. 3pMBP вводили за три часа до введения ТГК.

PPI измеряли с помощью автоматизированных клеток PPI, которые позволяли автоматически вести протокол PPI и регистрацию реакций вздрагивания животного. Каждую мышь (по меньшей мере n=8 в группе) помещали в клетку для теста PPI через 60 минут после введения ТГК на 45 минут.

Тест PPI включал различные типы испытаний, состоящих либо в создании фонового шума, отдельного стимула, вызывающего испуг (S; 120 дБ), одного из подготовительных стимулов (73 дБ, 76 дБ или 82 дБ) отдельно или комбинации одного из каждого подготовительного стимула с последующим стимулом, вызывающим испуг (PPI-S). Реакцию вздрагивания после приложения импульса регистрировали и вычисляли индекс PPI (PPI%=100×(S-PPI-S)/S).

Результаты

3pMBP ингибирует (ID₅₀≈0,005 и ID₁₀₀≈0,015 мг/кг) нарушение преимпульсного ингибирования, вызванное ТГК (10 мг/кг) у мышей. На Фигуре 3C показано действие 3pMBP с предварительным импульсом 82 дБ.

d. Действие 3pMBP на ТГК-индуцированное нарушение памяти

В этих экспериментах изучали действие 3pMBP на нарушение, вызванное ТГК в двух тестах на запоминание: a. кратковременной памяти и b. долговременной памяти. Кратковременная память является способностью временно сохранять и обрабатывать информацию. Она требуется для выполнения повседневной деятельности, такой как поддержание беседы, рассуждение, понимание прочитанного. Дефицит кратковременной памяти является одним из основных когнитивных симптомов во время психоза, который не поддается улучшению при применении существующих антипсихотических средств (Pratt et al., 2012). Нарушение кратковременной памяти также является типичным последствием кратковременного употребления ТГК как у людей, так и у животных (D'Souza, 2007). Долговременная память является способностью хранить изученную информацию в компартементе стабильной памяти, позволяющей вспоминать ее долгое время после того, как произошло изучение. Нарушение долговременной памяти также является типичным эффектом при введении ТГК.

Материалы и методы

Нарушение кратковременной памяти, вызванное ТГК

У мышей кратковременную память можно оценивать в варианте водного лабиринта Морриса с отставленным выбором по соответствию месту, теста на пространственную память, в котором животные должны обрабатывать новую и ранее приобретенную информацию, чтобы найти местоположение скрытой платформы спасения.

У мышей однократное введение ТГК (5 мг/кг) ухудшает кратковременную память в данной задаче (Busquets-Garcia et al., 2017).

Установка состояла из белого круглого бассейна (диаметром 150 см и высотой 60 см), помещенного посреди экспериментальной комнаты с интенсивностью света от 90 до 100 люксов. Бассейн наполняли водой (19-21°C), сделанной непрозрачной при использовании нетоксичного белого косметического красителя без запаха. Белая платформа диаметром 14 см была скрыта на 1 см под поверхностью воды. Этот поведенческий тест состоял из трех фаз: привыкание, обучение и тестирование. Во время фазы привыкания животных один раз помещали в бассейн на 90 секунд, а затем отпускали на платформу на 30 секунд, чтобы они привыкли к условиям эксперимента и снизили уровень своего стресса во время обучения и тестирования. После привыкания мышей подвергали обучению. Изображения разных форм, размещенные на стенах комнаты, служили пространственными ориентирами. Каждая обучающая сессия (по одной в день) состояла из четырех попыток. При каждом испытании мышь помещали в воду лицом к стенке бассейна, а затем оставляли плавать, пока она не достигала скрытой платформы. Если мышь не достигала платформы в течение 90 секунд, ее направляли к ней. Затем мышь оставалась на платформе в течение 30 секунд (интервал между испытаниями). Стартовые положения были одинаковыми для первого и четвертого испытаний, но разные для остальных. Положение платформы меняли каждый день, так что при первом испытании в каждой сессии мышь всегда находила ее случайно. Обучающие сессии повторяли до тех пор, пока мыши не начинали демонстрировать значительное уменьшение времени, требуемого для нахождения платформы между первым испытанием и каждым из трех последующих испытаний в течение трех дней подряд. Обучение длилось от 8 до 12 дней. После обучения мыши получали фармакологические препараты, а затем выполняли одну тестовую сессию с использованием такого же протокола, что и в обучающих сессиях (т.е. 4 испытания с интервалами между испытаниями 30 секунд и остановкой испытания через 90 секунд).

Эффективность кратковременной памяти в обучающей сессии измеряли при вычислении коэффициента экономии времении с помощью следующей формулы: коэффициент экономии = (время до спасения в испытании 1 - время до спасения в испытании 4)/( время до спасения в испытании 1 + время до спасения в испытании 4).

Мышам вводили ТГК (5 мг/кг, в/б) или его растворитель за 30 минут до тестирования. 3pMBP (0,015; 0,15 или 0,45 мг/кг, внутрь через зонд) или его растворитель вводили за 3 часа до введения ТГК или его растворителя.

Нарушение долговременной памяти, вызванное ТГК.

У мышей долговременную память можно оценивать с помощью теста на распознавание объектов, в котором память об одном конкретном объекта оценивают через 24 ч. Для этого конкретного эксперимента самцы мышей CD1-SWISS получали однократное пероральное введение 3pMBP (0,005 мг/кг) или кукурузного масла (5 мл/кг, растворитель) с последующей внутрибрюшинной (в/б) инъекцией ТГК (6 мг/кг; 10 мл/кг) через 3 часа. За десять минут до инъекции ТГК мышам позволяли исследовать 2 идентичных объекта в "L"-образном лабиринте. На следующий день один объект заменяли новым. Согласно спонтанному предпочтению нового мыши исследуют более длинные новые объекты (Ennaceur, 2010). Сравнение времени, затраченного на исследование знакомых и новых объектов, используют в качестве индекса различения знакомого и нового. Поэтому данный параметр используют для оценки эффективности распознавания объектов.

Результаты

3pMBP полностью ингибирует ТГК-индуцированное нарушение распознавания объектов (Фигура 4B) при дозе 0,005 мг/кг с ID50, которая составила <0,005 мг/кг. Аналогично, 3pMBP, вводимый в дозе 0,015, 0,15 или 0,45 мг/кг дозозависимо блокирует нарушение эффективности кратковременной памяти, вызванное ТГК (5 мг/кг), с ID100 0,15 мг/кг (Фигура 4A).

e. Действие 3pMBP на ТГК-индуцированное нарушение социального взаимодействия

Социальная изоляция при психозе определяется как безразличие или отсутствие желания к социальному взаимодействию (Wilson and Koenig, 2014). Социальное взаимодействие можно оценивать у мышей, измеряя их спонтанное предпочтение встречи с сородичем по сравнению с избегание контакта. В этой парадигме однократное введение ТГК (3 мг/кг) снижает социальное предпочтение (Busquets-Garcia et al., 2017; Фигура 4C), обеспечивая надежную модель эндофенотипа социальной изоляции при психозе.

Материалы и методы

Мышей тестировали в открытом поле (35×35 см) с двумя пластмассовыми контейнерами (пластмассовыми цилиндрами диаметром 8 см с отверстиями для взаимодействия с запахами), помещенными в два противоположных угла, в один из которых помещали мышь (взрослого самца C57BL/6-N возрастом 8-10 недель), тогда как другой контейнер оставался пустым. В каждом углу определяли 'общественные' и 'обособленные' зоны в виде области 8 см, окружающей контейнеры. Для каждой экспериментальной группы положение контейнера с мышью уравновешивали. Экспериментальную мышь помещали в центр открытого поля для исследования на 5 минут и вели съемку камерой. Время, проведенное в обеих зонах, посчитывали, определяя, что животное находится в одной зоне, когда все его четыре лапы находились за проведенными линиями. Социальный индекс вычисляли следующим образом:

Социальный индекс=Время, проведенное в "общественной зоне"/Общее время, проведенное в обеих зонах.

Мышам вводили ТГК (3 мг/кг, в/б) или его растворитель за 2 часа до входа в открытое поле. 3pMBP (0,005; 0,015; 0,05 мг/кг, внутрь в кукурузном масле) или его растворитель вводили за 3 часа до ТГК или его растворителя.

Результаты

3pMBP, вводимый в дозе 0,005; 0,015 или 0,05 мг/кг, дозозависимо блокирует уменьшение социального взаимодействия, вызванное ТГК, с ID100 0,015 мг/кг (Фигура 4C).

f. ТГК-индуцированное нарушение тестирования реальности

Изменения в мысленном представлении стимулов, приводящие к несоответствию восприятия и реальности, являются ключевыми характеристиками позитивных симптомов психотических состояний (Busquets-Garcia et al., 2017). У грызунов задача "тестирования реальности" оценивает потенциальное несоответствие между внутренним представлением стимула (запаха или вкуса) и реальностью, которую они предсказывают.

Этот тест основан на парадигме обусловленного отвращения. Два стимула равной силы, обычно вкус и запах, сначала предъявляют одновременно повторяющимся образом (6 раз). Затем один из стимулов, например, запах, связывают с неприятным событием (например, с дискомфортом в желудке, вызванным LiCl). После кондиционирования мыши проявляют определенное отвращение к стимулу, связанному с неприятным событием (то есть к запаху), но не к нейтральному стимулу (то есть к вкусу), хотя запах и вкус ранее были представлены вместе. Эти реакции предполагают, что у мышей создаются определенные представления каждого из стимулов. Однако психодислептики, включая MK-801, амфетамин и ТГК, вызывают отвращение к обоим стимулам, включая тот, который не был обусловлен неприятным событием (опосредованное отвращение). Этот эффект указывает, что психодислептики вызывают неправильное представление о "нейтральном" стимуле. Эти изменения снимаются атипичным антипсихотическим средством рисперидоном (Busquets-Garcia et al., 2017). Таким образом, нарушение "тестирования реальности", вызванное ТГК, а также другими психодислептиками у мышей, показывает как очевидную, так и прогностическую достоверность для исследования положительных психотических симптомов.

Материалы и методы

Тестирование реальности состоит из четырех фаз с различными парами (пара означает одновременное объединение двух стимулов): привыкание (3 дня), предварительное кондиционирование (6 пар запах/вкус, 12 дней), кондиционирование (т.е. 3 пары запахов/введение средства, вызывающего дискомфорт (LiCl), 6 дней), день на восстановление (1 день с водой) и, наконец, тесты (тесты на опосредованное отвращение и прямое отвращение).

Мышам ограничивали доступ к воде на 24 часа перед началом привыкания, которое заключалось в доступе к воде в течение 1 часа в день в течение 3 дней, чтобы привыкнуть получать жидкость каждый день в течение 1 часа и, таким образом, достичь постоянного потребления в течение всего протокола. После этого следовала фаза предварительного кондиционирования, во время которой мышам давали 1-часовой доступ в день к смешанному раствору (O1T1) с одним запахом (миндаль или банан, O1) и одним вкусом (мальтодекстрин или сахароза, T1) в воде. В день 2 мыши получали 1-часовой доступ к раствору с запахом и вкусом, который не давали в предыдущий день (O2T2). После 6 пар O1T1 и O2T2 (12 дней) начинали фазу кондиционирования.

В первый день кондиционирования мышам давали 1-часовой доступ к воде с запахом (O1), сразу после внутрибрюшинной инъекции раствора хлорида натрия. На следующий день мышам давали доступ ко второй воде с запахом (O2), сразу после внутрибрюшинной инъекции LiCl (0,3М) в объеме 10 мл/кг для создания дискомфорта в желудке. После 3 пар O1/раствора хлорида натрия и O2/LiCl (6 дней) мышам давали день на восстановление с 1-часовым доступом к воде.

На следующий день опосредованное отвращение оценивали путем выполнения теста с двумя вариантами выбора с двумя бутылками воды, содержащими один из двух вкусов: вкус в сочетании с запахом, связанным с инъекцией LiCl (T2), называемый C+; или вкус в сочетании с другим запахом, который был связан с инъекцией раствора хлорида натрия (T1), называемый C-. В этом тесте появление опосредованного отвращения выражалось в уменьшении потребления воды, содержащей вкус в сочетании с запахом, который ранее был связан с LiCl (T2, C+), по сравнению с водой, содержащей другой вкус, связанный с запахом, который никогда не сочетался с LiCl (T1, C-). Результаты тестов выражали индексом отвращения следующим образом:

Индекс отвращения = (Потребление C- - Потребление C+)/Общее потребление

Мышам вводили ТГК (1 мг/кг, в/б) или его растворитель за 2 часа до теста с двумя вариантами выбора, оценивающего опосредованное отвращение. 3pMBP (0,015; 0,05 мг/кг, внутрь), или его растворитель вводили за 3 часа до ТГК или его растворителя.

Результаты

После инъекции раствора хлорида натрия животные не проявляли отвращения к вкусу, ранее связанному с запахом, который во время кондиционирования приобретал свойство ожидаемого дискомфорта, вызванного LiCl (Фигура 4D). Это - правильная интерпретация, поскольку вкус никогда не был непосредственно связан с вызывающим отвращение стимулом (инъекцией LiCl). С другой стороны ТГК вызывает отвращение к тому же вкусу, поведенческую реакцию, указывающую, что животное неправильно воспринимает внешние стимулы (Фигура 4D). Введение 3pMBP в дозе 0,015 или 0,05 мг/кг полностью предотвращает такое неверное восприятие, вызванное ТГК (1 мг/кг), с ID100 0,015 мг/кг (Фигура 4D).

g. ТГК-индуцированная каталепсия

В этих экспериментах стремились оценить способность 3pMBP ингибировать ТГК-индуцированную каталепсию у мышей. Каталепсию изучали, поскольку ее можно рассматривать как модель кататонического состояния, наблюдаемого у некоторых субъектов после употребления каннабиноидных препаратов (Khan et al., 2016).

Материалы и методы

Исследовали действие 3pMBP в четырех дозах (0,0015, 0,005, 0,015 или 0,05 мг/кг) в 5 мл/кг кукурузного масла) на каталепсию, вызванную ТГК (10 мг/кг в 10 мл/кг 0,9% NaCl, содержащего 2% этанола и 3% Tween80) у самцов мышей C57BL6/J (24,8±0,1 г, среднее ± SEM, на начало экспериментов), линии, которую обычно используют для этого типа теста (Vallee et al., 2014). ТГК вводили через 3 ч 00 мин после 3pMBP. Измерение каталепсии, вызванной ТГК, начинали через 30 минут после инъекции ТГК.

Каталепсию измеряли с помощью теста каталепсии с перекладиной. Передние лапы мышей помещали на перекладину, зафиксированную горизонтально на уровне 3,5 см от поверхности лабораторного стола. Регистрировали время задержки при перемещении с перекладины, с фиксированным временем остановки теста через 420 с (7 минут). Каждой мыши предоставляли максимум четыре последовательных попытки. Максимальное время задержки, показанное в одной попытке, выбирали в качестве показателя каталепсии.

Результаты

3pMBP ингибировал (на 50%) каталепсию, вызванную ТГК (10 мг/кг), с ID50≈0,005 и ID100≈0,05 мг/кг (Фигура 5A).

h. ТГК-индуцированное поведение обусловленного раскрывания рта

ТГК-индуцированное раскрывание рта использовали в настоящем документе в качестве модели синдрома каннабиноидного гиперемезиса. Таким образом, несмотря на то, что крысы неспособны к рвоте, они демонстрируют выраженные реакции обусловленного раскрывания рта во время ковторного контакта с запахом, ранее объединенным с рвотным средством. Такой устойчивый навык приобретается в одном испытании и с длительными перерывами (часы) между пробой нового запаха и введением рвотного средства. Обусловленные реакции раскрывания рта последовательно воспроизводят рвотными средствами и предотвращают противорвотными средствами, указывая, что они являются надежным показателем недомогания и тошноты, вызванной лекарственным средством.

Материалы и методы

Через три дня после операции канюлирования, крыс адаптировали к камере вкусовой реактивности. Крыс индивидуально помещали в камеру вкусовой реакции (TR), при этом их канюли подсоединяли к инфузионному насосу для вливания воды в их ротовую полость в течение 2 минут со скоростью 1 мл/мин, а затем возвращали в их домашнюю клетку. Крысы проходили первое из трех ежедневных испытаний для выработки условного рефлекса через три дня после адаптационного испытания. Крыс случайно распределяли по условиям предварительного лечения; 3pMBP 0,015 мг/кг (n=8), 3pMBP 0,005 мг/кг (n=8), растворитель 0 мг/кг (n=8). Крысы получали лекарственное средство для предварительного лечения за 3 часа до кондиционирования через зонд для искусственного питания. Затем их помещали в TR камеру и вливали 0,1% раствор сахарина в течение 2 минут со скоростью 1 мл/мин, при этом регистрировали орофациальные реакции. Сразу после инфузии сахарина крысам вводили (внутрь) 10 мг/кг ТГК или VEH и возвращали в их домашнюю клетку. Через двадцать четыре часа крыс подвергали тесту без лекарственного средства, в котором их помещали в TR камеру и вливали 0,1% раствор сахарина в течение 2 минут со скоростью 1 мл/мин, и регистрировали орофациальные реакции.

Результаты

При кондиционировании 10 мг/кг ТГК, крысы больше раскрывали рот во время контрольного испытания, чем во время испытания по выработке условного рефлекса. Как видно на Фигуре 5B, предварительная обработка обеими дозами 3pMBP (0,005 и 0,015 мг/кг) препятствовала установлению обусловленного раскрывания рта путем уменьшения среднего количества реакций раскрывания рта (различие между растворителем и 3pMBP 0,005 мг/кг, p=0,023, между растворителем и 3pMBP 0,015 мг/кг, p=0,029).

i. ТГК-индуцированный выброс дофамин в прилежащем ядре

В этих экспериментах стремились оценать способность 3pMBP ингибировать увеличение выброса дофамина (DA), вызванное ТГК в прилежащем ядре (Nac) свободно передвигающихся крыс, измереяемое методом микродиализа. Выброс DA в Nac изучали, поскольку его считают главной биологической основой аддиктивных свойств веществ, вызывающих привыкание, включая ТГК.

Материалы и методы

Исследовали действие 3pMBP в трех дозах (0,005, 0,015 или 0,05 мг/кг, внутрь) на увеличение выброса DA в Nac, вызванное ТГК (1 мг/кг) у самцов крыс Спрег-Доули. ТГК солюбилизировали в 0,9% NaCl, содержащем этанол (2%) и Tween80 (2%), который также использовали в качестве контрольного растворителя (VEH_ТГК), и вводили внутрибрюшинно в объеме 1 мл/кг.

Крысам (n=5-7 в группе) под анестезией имплантировали направляющую канюлю непосредственно над субрегионами оболочки правого Nac. В день фармакологического эксперимента (через 5-7 дней после операции) свободно передвигающиеся крысы получали одну из доз 3pMBP или VEH_3pMBP, и зонд для микродиализа имплантировали в направляющую канюлю, которую затем перфузировали искусственной спинномозговой жидкостью. Диализаты собирали каждые 15 минут. Через 180 минут после начала перфузии всем животным вводили ТГК. Затем наблюдали отток DA в течение 120 минут. Концентрации DA в образцах диализата исследовали с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сопряженной с электрохимическим детектированием, как описано ранее (Leggio et al., 2009). Содержание DA в каждом образце выражали в процентах от среднего исходного уровня, вычисленного по трем фракциям, предшествующим введению ТГК. Площадь под кривой (AUC) вычисляли для каждой группы от времени забора проб 0 минут до 60 минут после инъекции ТГК.

Результаты

3pMBP ингибирует (ID₅₀≈0,005 и ID₁₀₀≈0,015 мг/кг) увеличение выброса дофамина в прилежащем ядре, вызванное 1 мг/кг ТГК у крыс (Фигуры 5C и 5D).

2. Ингибирование под действием 3pMBP способности ТГК и агонистов CB1 формировать поведение и вызывать зависимость

Исследовали ингибирование при пероральном введении 3pMBP описанных ниже обусловленных фармакодинамических эффектов агонистов CB1 и ТГК:

a. Внутривенное самовведение агониста CB1 WIN 55,212-2;

b. Внутривенное самовведение ТГК и возобновление поиска ТГК.

a. Внутривенное самовведение агониста CB1 WIN 55,212-2

В этих экспериментах стремились оценить у мышей способность 3pMBP ингибировать подкрепляющие эффекты агониста CB1 WIN 55,212-2 (WIN), изучаемые с помощью теста внутривенного самовведения, который считают золотым стандартом для измерения подкрепляющих эффектов психоактивных средств.

Материалы и методы

Действие 3pMBP при внутривенном (в/в) самовведении измеряли у самцов мышей CD1-Swiss.

Перед началом сеансов самовведения мышам под анестезией в правую яремную вену имплантировали катетеры. Эксперименты по самовведению проводили через 3 дня после операции в оперантных камерах мышей, оборудованных одним "активным" и одним "неактивным" отверстиями. Когда животное помещало свой нос (просовывало нос) в активное отверстие, ему делали внутривенную инфузию WIN (12,5 мкг/кг). Мышей обучали по схеме подкрепления условного рефлекса с фиксированным соотношением 1 (FR1).

Двухчасовые ежедневные сеансы самовведения проводили 6 дней в неделю в течение 19 дней. Мыши получали растворитель кукурузное масло (2 мл/кг) перорально в день 9 и 10, чтобы они могли привыкнуть к процедуре введения через зонд. На 11 день мышей случайным образом распределяли в две группы (n=13 в группе), одна из которых получала 3pMBP, а другая - растворитель кукурузное масло за 3 часа до начала сеанса самовведения в течение 9 дней подряд. 3pMBP вводили в дозе 0,005 мг/кг в первые четыре дня и в дозе 0,015 мг/кг в остальные пять дней.

Результаты

3pMBP ингибирует (ID50≈0,005 и ID100≈0,015 мг/кг) внутривенное самовведение WIN 55,212-2 у мышей (Фигура 6).

b. Внутривенное самовведение ТГК и возобновление поиска ТГК у неотносящихся к человеку приматов

В этих экспериментах стремились оценить способность 3pMBP ингибировать подкрепляющие эффекты ТГК у неотносящегося к человеку примата (саймири), который является моделью золотого стандарта для изучения зависимости от каннабиса и рецидива у животных. Использовали две экспериментальных модели:

- ТГК-опосредованное внутривенное самовведение

- опосредованное ТГК-праймингом возобновление поиска ТГК

Эти две модели использовали, потому что они считаются лучшими моделями для измерения соответственно склонности лица к употреблению каннабиса и подверженности к рецидиву употребления каннабиса после периода отмены.

Материалы и методы

Для всех экспериментов 3pMBP вводили перорально в винограде в объеме 0,1 мл кукурузного масла за 4 ч до тестирования.

Использовали четыре самца саймири (Saimiri sciureus или обыкновенной беличьей обезьяны), потому что это - вид, у которого самовведение ТГК может быть изучено наиболее достоверно.

Обезьян обучали нажимать рычаг для получения внутривенной (в/в) инъекции ТГК (4 мкг/кг/инъекция) в соответствии со схемой с фиксированным отношением десять к одной инъекции психоактивного средства (FR10, каждый 10-й ответ на нажатие рычага производил инъекцию ТГК).

Регистрировали количество нажатий рычага и количество инъекций в каждой сессии. Процент ответа вычисляли на основе доступного времени сессии для ответа (т.е. вычитали время перерывов). Статистическую обработку выполняли для количества инъекций и процента ответа в каждой сессии с использованием однофакторного или двухфакторного дисперсионного анализа с повторными измерениями с дозой ТГК или временем в качестве факторов.

Обезьян, использованных в предыдущих экспериментах, подвергали ежедневным сеансам ослабления условной реакции, во время которых нажатие на рычаг приводило к инфузии растворителя, плюс визуальные сигналы, которые были ранее сопряжены с инфузиями ТГК, но без ТГК. После по меньшей мере двух сеансов ослабления, когда ответ достигал низкого уровня, определяли влияние предварительной обработки 3pMBP (0,0015, 0,005 и 0,015 мг/кг) или контрольного растворителя 3pMBP на индуцированное ТГК-праймингом (0,04 мг/кг в/в) возобновление поиска ТГК. Инициирующие инъекции ТГК делали непосредственно перед началом сеансов тестирования. Во время тестирования нажатие рычага (FR10) продолжало производить только инъекции растворителя и дискретные сигналы. Влияние 0,015 мг/кг 3pMBP на прайминг растворителем также тестировали для определения, будет ли 3pMBP в таком качестве влиять на ответ после ослабления условной реакции.

Результаты

3pMBP ингибирует (ID₅₀≈0,005 и ID₁₀₀≈0,015 мг/кг) внутривенное самовведение ТГК у неотносящихся к человеку приматов (саймири) (Фигура 7A и 7B). 3pMBP также ингибировал (ID₁₀₀≤0,0015 мг/кг) возобновление поиска ТГК у неотносящихся к человеку приматов (саймири), индуцированное праймингом ТГК, но не оказывал никакого влияния на прайминг растворителем (Фигуры 7C и 7D).

Выводы

Результаты экспериментов по оценке влияния 3pMBP на обусловленные и безусловные эффекты ТГК представлены в таблице ниже (Таблица 4). В этой таблице четко показано, что 3pMBP является очень мощным ингибитором широкого спектра эффектов ТГК, связанных с несколькими нарушениями, которые появляются после употребления каннабиноидов. Следовательно, 3pMBP представляет в качестве средства для общего лечения нарушений, связанных с каннабиноидами.

Таблица 4: Результаты доклинической оценки 3pMBP в качестве средства для лечения нарушений, связанных с каннабиноидами
	Тест-система	ID50 (мг/кг)	ID100 (мг/кг)	% ингибирования
Безусловные эффекты ТГК
ТГК-индуцированное увеличение потребления пищи	мыши	0,015	0,05	100
ТГК-индуцированное увеличение психомоторной стимуляции	мыши	0,00036	0,0015	100
ТГК-индуцированное нарушение преимпульсного ингибирования	мыши	0,0045	0,015	100
ТГК-индуцированное нарушение кратковременной памяти	мыши	ND	0,15	100
ТГК-индуцированное нарушение долговременной памяти	мыши	<0,005	ND	100
ТГК-индуцированное нарушение социального взаимодействия	мыши	0,005	0,015	100
ТГК-индуцированное нарушение тестирования реальности	мыши	<0,015	ND	100
ТГК-индуцированная каталепсия	мыши	0,005	0,05	50
ТГК-индуцированное поведение раскрывания рта	крысы	<0,005	ND	50
ТГК-индуцированное нарушение выброса дофамина	крысы	0,005	0,015	50
Обусловленные эффекты ТГК и WIN 55,212-2
Внутривенное самовведение агониста CB1 WIN 55,212-2	мыши	0,005	0,015	80
Внутривенное самовведение ТГК	обезьяны	0,005	0,015	80
Возобновление поиска ТГК	обезьяны	<0,0015	ND	80
ND=не определяли

Пример 4: 3 p MBP не имеет ни одного из поведенческих и эндокринологических побочных эффектов ортостерических антагонистов CB1

Сравнивали фармакологический профиль и влияние на фенотипы, связанные с побочными эффектами, 3pMBP и ортостерического антагониста CB1 римонабанта. Ортостерические антагонисты CB1, такие как Акомплиа®, были сняты с продажи из-за побочных эффектов. Следовательно, чтобы терапевтическое средство, ингибирующее CB1, имело практическое применение у человека, оно не должно иметь известных побочных эффектов ортостерических антагонистов CB1.

Известными побочными эффектами ортостерических антагонистов рецепторов CB1 и, в частности, римонабанта являются: 1. Снижение потребления пищи и массы тела, что является признаком неспецифического действия на пути подкрепления; 2. Индукция поведения, связанного с тревогой и депрессией; 3. Повышение секреции глюкокортикоидов, вызывающее нарушение гормонального статуса субъекта; 4. Индукция состояния отмены у субъектов, зависимых от каннабиноидов.

Затем авторы изобретения исследовали воздействие 3pMBP на все эти параметры.

1. Влияние многократного лечения 3pMBP на потребление пищи и массу тела

В этих экспериментах стремились оценить способность многократного лечения 3pMBP снижать потребление пищи и массу тела в модели алиментарного ожирения (DIO) на мышах и сравнить эти эффекты с эффектами ортостерического антагониста CB1 римонабанта. Массу тела и потребление пищи изучали, поскольку они снижаются при многократном лечении ортостерическими антагонистами CB1 как у мышей, так и у людей (Wiley et al., 2005; Mazier et al., 2015; Bermudez-Silva FJ, et al., 2012). Использовали мышей DIO, потому что эффекты антагониста CB1 имеют более широкую амплитуду у мышей с ожирением, чем у тощих мышей.

Методы и материалы

Самцы мышей C57BL/6J получали без ограничения рацион с высоким содержанием жиров (HFD) в течение 8 недель до начала фармакологического лечения. Во время фармакологического лечения HFD сохраняли и ежедневно измеряли потребление пищи и массу тела. Количество потребляемой пищи вычисляли путем вычитания количества корма, оставшегося в бункерах, из первоначального предварительно взвешенного количества.

В первом эксперименте (n=10-7 в группе) исследовали действие 3pMBP (0, 0,005, 0,015 и 0,05 мг/кг; в 2 мл/кг кукурузного масла) в течение четырех недель. Во втором эксперименте (n=8 в группе) действие 3pMBP (0, 5 и 15 мг/кг в 5 мл/кг кукурузного масла) сравнивали с действием римонабанта (10 мг/кг в 5 мл/кг кукурузного масла) в течение двух недель лечения. 3pMBP и римонабант вводили перорально через зонд один раз в день, за два часа до начала темной фазы цикла света/темноты.

Результаты

3pMBP ни в одной из протестированных доз не изменял потребление пищи или массу тела в течение всей продолжительности эксперимента (четыре недели для 0,005, 0,015 и 0,05 мг/кг и две недели для 5 и 15 мг/кг). В отличие от этого, антагонист CB1 римонабант снижал и потребление пищи, и массу тела (Фигуры 8A и 8B).

2. Влияние 3pMBP на развитие синдрома отмены

В этих экспериментах стремились оценить способность 3pMBP вызывать синдром отмены у мышей, длительно получавших ТГК. Вызванный синдром отмены изучали, поскольку он может составлять потенциальный побочный эффект ингибитора ТГК у субъектов с зависимостью от каннабиноидов. Например, ортостерический антагонист CB1 римонабант, как известно, вызывает синдром отмены у мышей, длительно получавших ТГК.

Материалы и методы

Схема долговременного приема ТГК (20 мг/кг, два раза в день), используемая в этих экспериментах, была выбрана потому, что она имитирует интенсивное употребление марихуаны (Cook et al., 1998) и рассматривается как модель зависимости от каннабиноидов у мышей (Cutando et al., 2013; Hutcheson et al., 1998).

Действие римонабанта (10 мг/кг) и 3pMBP (0,15 мг/кг) изучали в независимых экспериментах на мышах CD1-Swiss. С 1 по 4-5 дни мышам в/б вводили растворитель или ТГК (20 мг/кг в NaCl 0,9%, содержащем 2% этанола и 2% Tween80, 10 мл/кг) два раза в день. В последний день лечения мыши в группе ТГК получали римонабант или 3pMBP. Все остальные животные получали соответствующий растворитель. Данные анализировали в течение 45 минут сразу (римонабант) или через 3 часа (3pMBP) после введения. Доза и схема введения римонабанта, выбранные для этого исследования, обычно использовали, чтобы вызвать состояние отмены ТГК у мышей (Cook et al., 1998, Hutcheson et al., 1998, Huang et al., 2009).

Для измерения ускоренного наступления состояния отмены мышей помещали в новую домашнюю клетку, при этом видеокамера, расположенная перед каждой клеткой, записывала поведение животных. Оценку производили в течение 1 минуты каждые 5 мин. Исследовали два признака состояния отмены: тремор лап и потряхивание головой, поскольку они являются наиболее частыми признаками отмены ТГК, наблюдаемыми у мышей (Cook et al., 1998, Hutcheson et al., 1998, Lichtman et al., 2001).

Результаты

3pMBP не вызывал состояние отмены у мышей. Напротив, в тех же экспериментальных условиях признаки состояния отмены появлялись после введения ортостерического антагониста CB1 римонабанта (Фигуры 8C и 8D).

3. Влияние многократного введения 3pMBP на связанное с тревогой и депрессией поведение у мышей

В этих экспериментах стремились оценить способность многократного лечения 3pMBP усиливать связанное с тревогой и депрессией поведение у мышей и сравнить эти потенциальные эффекты с действием ортостерического антагониста CB1 римонабанта. Связанное с тревогой и депрессией поведение изучали, потому что увеличение тревоги и депрессии является последствиями многократного лечения ортостерическими антагонистами CB1 и у грызунов, и у людей (Bellocchio et al., 2013, Patel et al., 2006, Moreira et al., 2009, Tzavara et al., 2003). Подобное тревоге поведение изучали в приподнятом крестообразном лабиринте (EPM), потому что эта модель широко используется у грызунов для оценки предполагаемого анксиогенного или анксиолитического действия фармакологических соединений (Walf et al., 2007). Связанное с депрессией поведение изучали с помощью теста на предпочтение сахарозы, который часто используют в качестве модели ангедонии, одного из кардинальных симптомов депрессии.

Материалы и методы

Установка EPM состояла из четырех приподнятых отсеков, расположенных крестообразно, при этом два противоположных отсека были окружены стенками, а два других отсека были открыты. Для всех экспериментов, после получения соответствующего лечения мышей помещали в центр EPM и позволяли исследовать лабиринт в течение 5 минут. Затраченное время и количество заходов в открытые и закрытые отсеки измеряли с помощью автоматической системы видеонаблюдения. Уменьшение процента посещений и/или времени, проведенного в открытых отсеках, считается показателем повышения уровня тревоги.

Тест на предпочтение сахарозы проводили в домашней клетке мышей. Две одинаковые бутылки, одна с водой, а другая с 2% раствором сахарозы, были помещены в бункер каждой домашней клетки. Мыши имели неограниченный доступ к воде и растворам сахарозы во время фазы активности, темной фазы цикла света/темноты, которая начиналась в 7 часов вечера. Объемы воды и растворов сахарозы, выпитых мышами, измеряли в течение двух интервалов по 1 ч 30, первый - с 19:00 до 20:30, и второй - с 20:30 до 22:00. В каждую точку времени бутылки взвешивали и вычисляли выпитый объем путем вычитания первоначального веса бутылки из конечного веса бутылки.

Самцы мышей C57BL/6J (n=6-8 в группе) получали либо одно ежедневное введение 3pMBP (0,05; 5 или 15 мг/кг), римонабанта (10 мг/кг) или соответствующих растворителей в течение 28 дней. В день 26 мышей подвергали тесту ЕРМ, а в день 28 - тесту на предпочтение сахарозы. Все поведенческие процедуры начинали через 3 часа после обработки 3pMBP или растворителем 3pMBP (0 мг/кг) и через 30 минут после обработки римонабантом или растворителем римонабанта (0 мг/кг).

Результаты

3pMBP не оказывал влияния на поведение, связанное с тревогой и депрессией, при измерении в тестах EPM (Фигуры 9A и 9B) и на предпочтение сахарозы (Фигура 9C), соответственно. В отличие от этого римонабант усиливал связанное тревогой и депрессией поведение, на что указывало уменьшение времени, проведенного в открытых отсеках EPM (Фигура 9A), и процента посещений открытых отсеков (Фигура 9B), а также снижение предпочтения сахарозы (Фигура 9D).

4. Влияние 3pMBP на секрецию глюкокортикоидов у мышей

В этих экспериментах стремились оценить у мышей действие 3pMBP на концентрации в плазме кортикостерона, основного глюкокортикоида, вырабатываемого в надпочечниках у грызунов и соответствующего кортизолу у людей. Действие 3pMBP на уровни кортикостерона изучали, поскольку ортостерический антагонист CB1 римонабант повышает концентрацию кортикостерона в плазме (Steiner et al., 2008).

Материалы и методы

Действие 3pMBP (0.3 и 10 мг/кг) или растворителя (VEH) на уровни кортикостерона в плазме изучали у самцов и самок мышей CD-1 Swiss. Забор крови производили через 2, 5, 8 и 24 ч после введения дозы (n=3 каждого пола, на дозу и на момент забора пробы). Для забора крови мышам делали анестезию изофлураном и собирали кровь путем кардиальной пункции. Кровь центрифугировали, отбирали плазму и замораживали при -80°C до проведения количественного анализа кортикостерона с помощью ЖХ-МС/МС (газовой хроматографии-тандемной масс-спектрометрии) при использовании утвержденного метода ЖХ-МС, описанного в литературе (Vallee et al., 2014; Vallee et al., 2000; George et al., 2010).

Результаты

3pMBP в дозе 0,3 и 10 мг/кг не увеличивал секрецию глюкокортикоидов у самцов (Фигура 10A) и у самок (Фигура 10B) мышей.

Выводы

Нежелательный эффект римонабанта сравнивали с действием 3pMBP в таблице 5.

Таблица 5: 3pMBP не имеет ни одного из нежелательных эффектов римонабанта
IN VIVO	ТЕСТ-СИСТЕМА	3pMBP	Римонабант
Эффект	Макс. тестируемая доза (мг/кг)	N раз IC50*	Эффект	IC100 (мг/кг)	N раз IC100**
Ингибирование потребления пищи и массы тела (многократное введение)	самцы мышей	Нет	15	3000	Да	10	1
Ускоренное состояние отмены у ТГК-зависимых мышей	самцы мышей	Нет	0,15	30	Да	10	1
Увеличение связанного с тревогой и депрессией поведения (многократное введение)	самцы мышей	Нет	15	3000	Да	10	1
Увеличение секреции глюкокортикоидов	самцы+самки мышей	Нет	10	2000	Да	2	0,2#
*=0,005 мг/кг наиболее часто наблюдаемая ID50 3pMBP для ингибирования поведенческих эффектов ТГК;
**=Референсная ID100 для эффектов римонабанта =10 мг/кг.
#=из Steiner et al., 2008

Действие 3pMBP сильно отличается от ортостерического антагониста CB1 римонабанта.

3pMBP не имеет ни одного из типичных нежелательных эффектов римонабанта и других ортостерических антагонистов CB1, таких как уменьшение потребления пищи, увеличение связанного с тревогой и депрессией поведения, ускоренного состояния отмены у ТГК-зависимых животных и увеличение секреции глюкокортикоидов.

Это отсутствие эффектов 3pMBP наблюдали для всех максимальных доз, используемых в каждом тесте. Эти дозы были в несколько раз выше (в мг/кг), чем ID50 (0,005 мг/кг) 3pMBP для ингибирования самовведения агонистов CB1 и ТГК, соответственно: в 30 раз выше для ускоренной отмены; В 2000 раз выше для секреции глюкокортикоидов; и в 3000 раз выше для потребления пищи, массы тела, связанного с тревогой и депрессией поведения.

Пример 5: 3 p MBP не оказывает никакого влияния на спонтанное поведение у мышей .

В дополнение к отсутствию таких же нежелательных поведенческих эффектов ортостерических антагонистов CB1, 3pMBP не оказывал никаких поддающихся обнаружению эффектов на поведение как таковое у грызунов, как показано с помощью видеоанализа спонтанного поведения в домашней клетке в течение 24 часов после введения 3pMBP у мышей в дозе 15 мг/кг.

Пример 6: 3 p MBP не оказывает никакого влияния на настроение и когнитивную эффективность у человека .

Эти эксперименты были разработаны для оценки действия однократной и повторных повышаемых доз 3pMBP на настроение, когнитивную функцию и суицидальные проявления у людей с использованием батареи валидированных тестов.

Материалы и методы

Проводили два исследования. В первом исследовании независимые когорты здоровых добровольцев получали однократное введение 3pMBP в одной из 3 повышаемых доз (0,2, 0,6; 2 мг/субъект) или плацебо. В каждой когорте дозы, с использованием двойной слепой процедуры, 6 субъектов получали назначенную дозу 3pMBP, и 2 субъекта получали плацебо. Во втором исследовании независимые когорты здоровых добровольцев получали многократные введения 0,6 мг/субъект 3pMBP (один раз в день в течение 7 дней). В каждой когорте дозы, с использованием двойной слепой процедуры, 6 субъектов получали назначенную дозу 3pMBP, и 2 субъекта получали плацебо. Доза 0,2 мг/субъект вызывает повышение концентраций 3pMBP в плазме, которые находятся в границах концентраций, наблюдаемых при наиболее часло наблюдаемой ED100 (0,015 мг/кг) для ингибирования поведенческих эффектов ТГК у грызунов.

В обоих исследованиях после введения дозы 3pMBP субъекты также подвергались общему наблюдению поведения, выполняемому сертифицированным медработником, и проводили следующие исследования.

Визуальная шкала Бонда и Ладера

Визуальная аналоговая шкала (VAS) Бонда и Ладера (Bond and Lader, 1974) состоит из 16 биполярных линий самооценки длиной 100 мм между двумя противоположными определениями. Тест выполняют с помощью компьютера. Субъект должен указать на каждой линии, как он чувствует себя во время теста, с помощью мышки. Ответ оценивают путем измерения расстояния в мм между левым концом линии и отметкой субъекта. Балл состоит из трех производных факторных подбаллов: внимательность, удовлетворение (благополучие) и спокойствие. Более высокий балл указывает на более высокую внимательность, удовлетворение и спокойствие.

ARCI 49

Этот самостоятельно заполняемый и выполняемый с помощью компьютера опросник состоит из 49 пунктов. Каждый вопрос появляется один за другим на экране. Используя мышь, субъект должен нажать "неверно" или "верно" для каждого пункта, относительно того, что он чувствует в то время, когда он читает вопрос. Затем получают 5 оценок: PCAG (оценка по шкале группы пентобарбитала-хлорпромазина-алкоголя), BG (группа бензедрина), AG (оценка по шкале группы амфетамина), LSD (оценка по шкале группы ЛСД) и MBG (оценка по шкале группы морфина-бензедрина) (Martin et al., 1971).

POMS 65

Шкала Профиля эмоционального состояния состоит из 65 определений, описывающих различные чувства настроения (Mc Nair et al., 1992; Cayrou et al., 2000; Cayrou et al., 2003).

Эта версия является компьютерной версией. Каждое определение появляется один за другим на экране, и субъекта просят описать, как эти определения отражают его настроение в то время, когда он заполняет опросник, оценивая каждое описание по 5-балльной шкале возрастающего согласия: от "нисколько" до "чрезвычайно".

При заполнении опросника классически получают шесть оценок: напряжение - тревога (TA); депрессия - уныние (DD); гнев - враждебность (АХ); энергичность - активность (VA); усталость - инертность (FI); дезориентация - растерянность (CB).

Шкала оценки тяжести суицидальных проявлений Колумбийского университета (C-SSRS)

Взаимосвязь между лекарственными средствами, проникающими в ЦНС, и возможностью суицидальных проявлений (суицидальных мыслей и поведения) недавно привлекла повышенное внимание регулирующих органов, таких как FDA, и вызвала необходимость упреждающего внедрения более последовательных и строгих механизмов сбора данных в клинических исследованиях.

Проспективную оценку суицидальных проявлений проводят с использованием Колумбийской шкалы оценки степени тяжести самоубийств (C-SSRS). C-SSRS разработана для оценки как суицидального поведения, так и суицидальных мыслей, и состоит из двух опросников: один предназначен для оценки исходного состояния (охватывает продолжительность жизни субъекта до посещения с целью оценки исходного состояния), а другой используется во время исследования (опросник "С момента последнего посещения").

Результаты

Ни для одной из протестированных доз 3pMBP не наблюдали никакого изменения общего поведения субъекта и никакого изменения ни одного из проведенных психометрических тестов. В частности, отсутствие изменений в тесте ARCI-49 указывает, что субъекты не могут сказать, что они получали психоактивное вещество.

В заключении следует отметить, что данные показывают, что у человека, как наблюдали и у животных, введение 3pMBP не вызывает значимых изменений исходного поведения, настроения и когнитивной эффективности.

Пример 7: Исследования фармакологической безопасности и токсикологические исследования 3 p MBP в сравнении с римонабантом

1. Оценка фармакологической безопасности 3pMBP стандарта GLP

Материалы и методы

Оценка действия 3pMBP на ток каналов hERG в стабильно трансфицированных клетках HEK-293:

Цель данного исследования состояла в оценке любых возможных эффектов 3pMBP на следовой ток hERG в стабильно трансфицированных клетках HEK-293. Исследование проводили согласно общим требованиям GLP, при этом схема исследования соответствовала рекомендациям ICH S7A (2001) для исследований безопасности лекарственных средств.

3pMBP исследовали в 3 клетках HEK-293, стабильно трансфицированных hERG. На каждой клетке тестировали следующее лечение: раствор Тироде; Растворитель 3pMBP (0,3% ДМСО в растворе Тироде) и 3pMBP в концентрации 10,98×10^-8 M, 10,98×10^-7 M и 3pMBP в концентрации 10,98×10^-6 M.

E-4031 использовали в качестве положительного контроля и тестировали в одной отдельной клетке HEK-293 для подтверждения достоверности используемого метода.

Клетки фиксировали при -80 мВ, деполяризовали до 0 мВ в течение 5 секунд для активации тока hERG и повторно поляризовали до -50 мВ в течение 5 секунд, обеспечивая деактивацию следового тока hERG. Эту экспериментальную процедуру повторяли при частоте 0,06 Гц. Токи фильтровали при 1 кГц и регистрировали при частоте 2 кГц. Амплитуду следового тока hERG измеряли во время импульса реполяризации от 0 до -50 мВ. Клетки перфузировали раствором Тироде, а затем раствором Тироде, содержащим 3pMBP, в течение по меньшей мере 5 минут, пока в течение каждого периода перфузии не достигалось стационарное состояние. Ток измеряли до и после воздействия тестируемого препарата.

Влияние 3pMBP на тесты Ирвина и температуру тела у крыс:

Цель данного исследования состояла в оценке любых потенциальных нейроповеденческих эффектов и влияния 3pMBP на температуру тела после однократного перорального введения у крыс.

Исследование проводили согласно общим требованиям GLP, а схема исследования соответствовала директиве (2001) ICH S7A для исследований безопасности лекарственных средств.

Исследование включало 4 группы из 6 самцов крыс линии Вистар весом от 154,0 до 185,9 г. Группы получали дозы, соответственно, растворителя (кукурузного масла, т.е. контрольная группа) или 2, 9 или 36 мг/кг 3pMBP.

В день исследования животных сначала оценивали при использовании стандартизированной батареи наблюдения Ирвина и измеряли температуру тела. Затем им перорально вводили одну из доз 3pMBP или его растворитель в объеме 4 мл/кг. После этого оценки Ирвина, а также измерение температуры тела снова производили через 1, 3, 6, 8 и 24 часа после введения.

Оценка действия 3pMBP на дыхание у нефиксированной бодрствующей крысы после однократного перорального введения

Цель данного исследования состояла в оценке любого возможного действия однократного перорального введения 3pMBP на показатели дыхания (частоту дыхания, максимальные скорости вдоха и максимальные скорости выдоха, время вдоха и выдоха, индекс сопротивления дыхательных путей, дыхательный объем и минутную вентиляцию), измеренные с помощью метода плетизмографии всего тела у бодрствующих крыс.

Исследование проводили согласно общим требованиям GLP, а схема исследования соответствовала директиве (2001) ICH S7A для исследований безопасности лекарственных средств.

Исследование включало 4 группы из 6 самцов крыс линии Вистар, группы получали дозы, соответственно, растворителя (кукурузного масла, т.е. контрольная группа) или 2, 9 или 36 мг/кг 3pMBP.

За день до исследования животным позволяли пить только воду. В день исследования животных помещали в плетизмограф и сразу же начинали производить измерения. Метод плетизмографии всего тела позволяет измерять в закрытой камере изменения воздушного потока из-за движений грудной клетки во время дыхания и позволяет измерять показатели дыхания у бодрствующего животного, которое могло совершенно свободно перемещаться. По меньшей мере через 15 минут после начала измерений животным перорально вводили 3pMBP или его растворитель в объеме 4 мл/кг. Дыхание регистрировали в течение 6 часов после введения дозы. Показатели дыхания определяли на основе анализа дыхательных циклов.

Оценка действия 3pMBP на артериальное давление, частоту сердечных сокращений, электрокардиограмму и температуру тела после однократного перорального введения бодрствующим собакам

Цель данного исследования состояла в оценке любых возможных эффектов 3pMBP на артериальное давление, частоту сердечных сокращений, температуру тела и электрокардиограмму после однократного перорального введения бодрствующим собакам.

Исследование проводили согласно общим требованиям GLP, а схема исследования соответствовала директиве (2001) ICH S7A для исследований безопасности лекарственных средств.

Исследование включало 4 самца биглей, которым ранее были установлены телеметрические передатчики для измерений артериального давления, температуры тела и электрокардиограммы.

Исследование проводили в двух частях. В I части каждое животное получало растворитель (т.е. кукурузное масло), 3pMBP в дозе 2, 9 и 36 мг/кг перорально, согласно схеме введения повышаемых доз, с периодом выведения между дозами одна неделя. Телеметрические измерения артериального давления, частоты сердечных сокращений, температуры тела и электрокардиограммы (эпикардиальное отведение II) начинали по меньшей мере за 2 часа до введения каждой дозы и продолжали в течение по меньшей мере 24 часов после введения доз. Во II части животным снова перорально вводили 3pMBP в дозе 9 или 36 мг/кг (n=2 на уровень дозы) для дополнительных исследований, т.е. забора крови и наблюдения за животными.

Результаты

3pMBP не показал нежелательных эффектов в анализах фармакологической безопасности стандарта GLP:

1. In vitro, 3pMBP (100 нМ, 1 мкМ и 10 мкМ) не изменял следовой ток hERG (человеческий Ether-ago-go-родственный ген) в клетках HEK-293, стабильно трансфицированных кДНК hERG-1.

2. In vivo, 3pMBP (2, 9 и 36 мг/кг) не изменял: a. поведение (теста Ирвина) и температуру тела у крыс; b. дыхание у бодрствующих крыс; и c. артериальное давление, частоту сердечных сокращений, электрокардиограмму и температуру тела у бодрствующих собак.

Единственным отмеченным эффектом было уменьшение высокочастотных ритмов и колебаний сердечных сокращений, связанное с уменьшением вариабельности сердечного ритма при дозе 9 мг/кг только у собаки. Это открытие предполагает влияние на баланс вегетативной нервной системы и, более точно, снижение вагусной активности. Однако этот эффект был слабым, поскольку он не вызывал никаких изменений частоты сердечных сокращений и не может считаться нежелательным эффектом сам по себе.

2. Токсикологическая оценка 3pMBP GLP

Материалы и методы

Цитотоксические, мутагенные и генотоксические эффекты 3pMBP исследовали до максимальных концентраций, приемлемых для тестируемых систем, т.е. от 74 до 100 мкМ.

Эти дозы приблизительно в 7400 и 10000 выше, чем максимальная IC₅₀ 3pMBP (10 нМ) для ингибирования CB1-опосредованных клеточных эффектов ТГК.

Токсикологические исследования, которые проводили in vitro с целью анализа 3pMBP, включали следующее: 1. Тест Эймса +/-метаболическую активацию (GLP); 2. Анализ хромосомных аберраций у человека +/- метаболическую активацию (GLP); 3. Цитотоксичность в первичной культуре нейронов и гепатоцитов (не GLP).

Исследования токсичности повторных доз проводили на крысах и собаках. Эти два вида были выбраны, потому что у обоих этих видов экспрессируется рецептор CB1, и их обычно успешно использовали для обнаружения токсического действия ортостерических антагонистов CB1, таких как римонабант. Кроме того, предполагаемый сайт связывания прегненолона обладает 100% гомологией у крыс, собак и людей. Наконец, исследования связывания с белками показывают, что связывание 3pMBP не отличается у крыс (84-94%), собак (84-105%) и людей (88-98%), тогда как у обезьян оно, по-видимому, выше (97-99%).

Повторные токсикологические исследования, проведенные с целью анализа 3pMBP, представляли собой 28-дневное исследование токсического действия при пероральном введении (GLP) у крыс и собак с тремя дозами (2 мг/кг, 9 мг/кг и 36 мг/кг).

Результаты

Исследования in vitro

3pMBP не показал цитотоксичности, генотоксичности и мутагенеза даже при наиболее высокой тестируемой концентрации (от 74 до 100 мкМ). Концентрации 74 и 100 мкМ 3pMBP в 7400-10000 раз выше, чем IC50 3pMBP для ингибирования CB1-зависимого фосфорилирования MAPK.

Исследования in vivo

Таблица 6: Результаты исследований токсического действия in vivo 3pMBP у крыс и собак
	Токсикологическое исследование перорального введения многократных доз
Дни лечения	28	28	28	28 (+14)
Доза 3pMBP (мг/кг)	2	9	36	36
Растворитель кукурузное масло (мг/кг)	4	4	4	4
Кол-во крыс	10M, 10F	10M, 10F	10M, 10F	10M, 10F
Кол-во собак	3M, 3F	3M, 3F	3M, 3F	2M, 2F
Смертность	NOE	NOE	NOE	NOE
Клинические признаки	NOE	NOE	NOE	NOE
Температура тела	NOE	NOE	NOE	NOE
Масса тела	NOE	NOE	NOE	NOE
Потребление пищи	NOE	NOE	NOE	NOE
Офтальмология	NOE	NOE	NOE	NOE
Сердечнососудистые показатели	NAR, NOED	NAR, NOED	NAR, NOED	NA
Гематология и коагуляция	NOE	NOE	NOE	NOE
Биохимический анализ крови	NOAER, NOED	NOAER, NOED	NOAER, NOED	NOAER, NOED
Анализ мочи	NOAER, NOED	NOAER, NOED	NOAER, NOED	NOAER, NOED
Масса органов	NOAER, NOED	NOAER, NOED	NOAER, NOED	NOAER, NOED
Макроскопические исследования	NOE	NOE	NOE	NOE
Патогистология	NOE	NOE	NOE	NOE
M=самцы; F=самки; NOE=не наблюдаемые эффекты; NOAE=не наблюдаемые нежелательные эффекты; NA=не исследовали; если не указано иное, эффекты наблюдали и у крыс, и у собак. NOAER и NOER=изменение, наблюдаемое только у крысы; NOAED и NOED=изменение, наблюдаемое только у собаки.

In vivo, 3pMBP имеет у крысы NOAEL (уровень дозы без наблюдаемых нежелательных эффектов) >36 мг/кг/день/28 дней, и у собаки NOEL (уровень дозы без наблюдаемых эффектов) >36 мг/кг/день/28 дней.

С учетом того, что наиболее часто наблюдаемая ID50 3pMBP для ингибирования эффектов ТГК у мышей, крыс и не относящихся к человеку приматов составляет 0,005 мг/кг, 3pMBP имеет терапевтический индекс (ТИ) >7200.

Выводы

По результатам токсикологических экспериментов, 3pMBP показывает благоприятный профиль токсичности с ТИ>7200. Такой высокий ТИ может быть результатом двух характеристик 3pMBP:

1. Уникальный и очень селективный механизм действия (MoA), не обнаруженный у других одобренных лекарственных средств и, насколько известно, еще не проверенный в других доклинических исследованиях. Таким образом, 3pMBP, по-видимому, ингибирует только активность одного из индуцируемых ТГК сигнальных путей (MAPK) и не оказывает никакого действия на ТГК-независимые, CB1-опосредуемые фенотипы in vivo.

2. Низкое превращение в образующиеся из лекарственного средства метаболиты, которые очень часто являются причиной токсичности НХС in vivo.

Как показано в приведенной ниже таблице (Таблица 7) профиль безопасности и токсичности 3pMBP сильно отличался от профиля ортостерического антагониста CB1 римонабанта. Таким образом, римонабант вызвал несколько нежелательных явлений в дозах, очень близких к терапевтической дозе, и, в частности, клонические судороги, гепатотоксичность и несколько глубоких изменений поведения.

Таблица 7 Сравнение токсического действия 3pMBP и римонабанта в исследованиях GLP
Токсичность в исследованиях GLP	Антагонист CB1 (Римонабант)	3pMBP
Эффект	ED100 (мг/кг)	Индекс безопасности	Эффект	Максимальная протестированная доза (мг/кг)	Индекс безопасности
Острая токсичность	(в/б) Грызун	(внутрь) Крыса
Клиническая токсичность: пролежени, прострация, сниженная активность, слабость, пилоэрекция, загрязнение урогенитальной области, выделения из носа	Да	60	6	Нет	36	>7200
Токсическое действие на ЦНС: двигательная гиперактивность, сопровождаемая седативным действием	Да	3	0,3	Нет	36	>7200
Клонические судороги	Да	60	6	Нет	36	>7200
Максимумальная нелетальная доза	Да	60	6	Нет	36	>7200
Токсичность повторных доз (внутрь) КРЫСА
Клиническая токсичность: худоба, запекшаяся кровь на мордочке, припухлость вокруг глаз и красные выделения/ слезоточения из глаз, загрязнение урогенитальной области, пилоэрекция, обезвоживание, гипотония, потеря равновесия	Да	6 (самки) 40 (самцы)	0,6 (самки) 4 (самцы)	Нет	36	>7200
Токсическое действие на ЦНС: Повышенная возбудимость: гиперестезия, тактильная гиперестезия или повышенная чувствительность к прикосновениям, чрезмерное почесывание, повышенная возбудимость, гиперактивность, гиперкинезия, агрессивность и атакующее поведение	Да	30	3	Нет	36	>7200
Клонические судороги	Да	6 (самки) 40 (самцы)	0,6 (самки) 4 (самцы)	Нет	36	>7200
Гепатотоксичность: Очаговый гепатоцеллюлярный некроз, себорея, увеличение веса и размера печени, гипертрофия центрилобулярных гепатоцитов, имеющих цитоплазму с эффектом матового стекла, и гиперплазия гладкого эндоплазматического ретикулума.	Да	40	4	Нет	36	>7200
Смертность	Да	60 (самки) 120 (самцы)	6 (самки) 12 (самцы)	Нет	36	>7200
Токсичность повторных доз (внутрь) собака
Клинические признаки: гиперсаливация; дрожь, покраснение конъюнктив, атаксия, гипокинезия	Да	10-15	ND	Нет	36	ND
Признаки со стороны ЦНС: агрессивность и прыжки при испуге	Да	15	ND	Нет	36	ND
ND=Не определяли, индекс безопасности вычисляли для 10 мг/кг Римонабанта и 0,005 для 3pMBP

Пример 8: Исследования фармакокинетики, всасывания, распределения, метаболизма и экскреции 3 p MBP

1. Фармакокинетика и всасывание 3pMBP у животных

Материалы и методы

Фармакокинетику (ФК) 3pMBP в плазме изучали у самцов и самок мышей, крыс и собак после введения внутрь (в кукурузном масле) через желудочный зонд. Распределение 3pMBP в головном мозге изучали у мышей и крыс. У собак 3pMBP также вводили внутривенно после солюбилизации в циклодекстрине. И в плазме, и в мозге концентрации 3pMBP измеряли с помощью жидкостной хроматографии, сопряженной с тандемной масс-спектрометрией (ЖХ/МС-МС).

Результаты

Различий между самцами и самками по ФК параметрам 3pMBP в плазме после введения мышам (0,3, 4 и 10 мг/кг, внутрь), крысам (1,6 мг/кг, внутрь) и собакам (0,7 мг/кг, внутрь и в/в). Как описано в Таблице 8 (результаты для самцов и самок животных суммировали), увеличение AUC в плазме после однократного введения 3pMBP было линейным для трех доз, исследованных у мышей (0,3, 4 и 10 мг/кг). У мышей, крыс и собак t_max 3pMBP было аналогичным (≈3ч), что свидетельствует о сопоставимой скорости всасывания 3pMBP. Период полувыведения 3pMBP был самым длительным у собак (28,0 ч внутрь; 35,9 в/в), далее следовали мыши (17,8-18,3 ч), и самым коротким он был у крыс (8-13,9 ч). Отношения AUC/доза после перорального введения были выше у собак (2074), затем мышей (848-1132); и самое низкое - у крыс (661).

У мышей и крыс 3pMBP имел более длительный t_max (7 ч и ≈3 ч) и более высокие AUC и C_max в мозге, чем в плазме. Отношение AUC и C_max в мозге/плазме оказались обратно пропорциональными дозе, при этом самые высокие отношения (C_max=2,8 и AUC=7,38) наблюдали для 0,3 мг/кг 3pMBP у мышей. Период полувыведения 3pMBP из мозга и плазмы был аналогичным.

После перорального или внутривенного введения 3pMBP мыши, крысы и собаки демонстрировали двухфазный профиль элиминации, быстрое снижение (фаза распределения) с последующим намного более медленным снижением до последнего момента забора проб (фаза элиминации).

У собак биодоступность 3pMBP составляла приблизительно 68%.

Таблица 8: Обобщенные средние фармакокинетические параметры в плазме мышей, крыс и собак после однократного введения 3pMBP
Вид	Введение	Доза мг/кг	n	Cmax (нг/мл)	Tmax (ч)	AUClast (нг/мл*ч)	Отношение AUC/доза	Отношение AUC M/F	T1/2 (ч)
Мыши	Внутрь	0,3	6	35,5	2,5	254	848	1,1	17,8
		4	6	490	2,25	3744	936	1,5	18,3
10		6	1787	2,25	11322	1132	0,9	18,2
Крысы	1,6	9	116,4	4,1	1058,7	661,7	0,7	13,9
Собаки	в/в	0,7	6	505	0,125	2192	3131	1,28	35,9*
внутрь	0,7	6	137,7	2,67	1452,5	2074,5	0,93	28,0*

Данные от самцов и самок были сложены. Значения C_max и AUC, выделенные жирным шрифтом, следует умножить примерно на 4, чтобы компенсировать фактически введенную более низкую дозу.

*=t¹/₂ определено при использовании ручного метода линейной регрессии с выбором последних трех точек на каждой ФК кривой.

2. Фармакокинетика 3pMBP у человека

Материалы и методы

В данном исследовании независимые когорты здоровых добровольцев получали однократное введение 3pMBP в одной из 3 повышаемых доз (0,2, 0,6; 2 мг/субъект) или плацебо. В каждой когорте дозы при использовании двойной слепой процедуры 6 субъектов получали назначенную дозу 3pMBP, и 2 субъекта получали плацебо.

Концентрации 3pMBP в плазме оценивали, проводя полный фармакокинетический анализ в течение первых 24 ч после введения дозы и каждые 24 ч после этого.

Результаты

Пероральное введение 3pMBP создавало концентрацию лекарственного средства в плазме, которая находилась в границах концентраций, предсказанных в ФК исследования на животных с использованием преобразования по отношению площади поверхности тела, подтверждая хорошее всасывание 3pMBP у людей. Доза 0,2 мг/субъект вызывала увеличение концентраций 3pMBP в плазме, которые находились в диапазоне концентраций, наблюдаемых при наибольшей наблюдаемой ED100 (0,015 мг/кг) для ингибирования поведенческих эффектов ТГК у грызунов.

3. Метаболизм 3pMBP

Материалы и методы

Метаболическая стабильность 3pMBP в микросомах печени человека, крысы, мыши и собаки:

Исследование выполняли на микросомах печени (LM), полученных у мыши (MLM), крысы (RLM), собаки (DLM) и человека (HLM).

3pMBP инкубировали с пулами микросом печени с добавкой NADPH в качестве кофактора. Образцы отбирали в 5 разных точках времени (0, 10, 20, 30 и 60 минут) и контролировали образцы на предмет исчезновения исходного соединения в режиме MRM с помощью ЖХ/МС-МС. Определяли собственный клиренс и период полувыведения. Верапамил использовали в качестве референсного соединения.

Определение метаболического профиля [3H]-3pMBP в плазме и выделениях крыс

Метаболический профиль оценивали в плазме, моче и экскрементах, и изотопно-меченные метаболиты идентифицировали по их времени удерживания с помощью радио-ВЭЖХ анализа. Результаты выражали как % суммы площадей всех обнаруженных пиков.

Превращение 3pMBP в последующие стероиды у мышей, крыс, собак и людей:

Превращение 3pMBP в последующие стероиды изучали у мышей путем измерения образующихся из прегненолона стероидов, прогестерона и 17α,OH-прегненолона, которые являются первыми двумя стадиями метаболизма прегненолона. Превращение 3pMBP в последующие стероиды также изучали у крыс и собак после введения 2, 9 и 36 мг/кг соединения путем измерения тестостерона, ДГЭА и аллопрегнанолон. Наконец, превращение в последующие стероиды (ДГЭА, аллопрегнанолон и тестостерон) изучали у людей после однократного введения одной из трех доз (0,2, 0,6 и 2 мг/субъект) 3pMBP. Во всех этих исследованиях концентрации стероидов в плазме измеряли с помощью газовой хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (ЖХ/МС-МС).

Результаты

Метаболическая стабильность в микросомах печени (МП)

3pMBP имел низкий клиренс в МП человека и крысы (собственный клиренс=3,38 и 12,3 мкл/мин/мг; период полувыведения=410 и 113 мин, соответственно) и умеренный клиренс в МП собак и мышей (собственный клиренс=26,0 и 29,7 мкл/мин/мг и период полувыведения=53,4 и 46,6 мин, соответственно).

Метаболический профиль у крысы

In vivo, [³H]-3pMBP не образует основных метаболитов в плазме. Соединение экскретируется преимущественно с калом, где, по-видимому, происходит большая часть метаболизма. В плазме через три и шесть часов после перорального введения [³H]3pMBP, наблюдали только один основной пик, соответствующий 3pMBP, составлявший соответственно 100% (3 ч) и 78% (6 ч) от всех интегрированных пиков. Через 24 часа 3pMBP не присутствовал в плазме, при этом оставались только следовые количества одного метаболита. В моче обнаруживали небольшое количество 3pMBP (меньше чем 0,5% дозы) в каждый интервал времени. В 0-6-часовой интервал были обнаружены три основных пика (≈30% каждый), включая один пик, соответствующий 3pMBP. Через 6-24 ч и 24-48 ч 3pMBP не обнаруживался в моче, при этом присутствовали только два других пика. Большая часть экскретируемой дозы была обнаружена в кале, в котором, в дополнение к 3pMBP, были обнаружены семь других пиков, каждый из которых составлял от 30 до 10% интегрированных пиков.

Превращение 3pMBP в последующие стероиды

Введение 3pMBP в дозе 0,3 и 10 мг/кг внутрь не вызывало повышения в плазме концентраций прогестерона и 17-OH-прегненолона, продуктов первых двух стадий метаболизма прегненолона, при измерении у самцов и самок мышей через 2, 5, 8 или 24 часа после введения 3pMBP. Аналогичным образом, у самцов и самок крыс и собак не было обнаружено никакого влияния однократного или многократного (28 дней) введения 3pMBP (2, 9 и 36 мг/кг) на концентрации в плазме тестостерона, ДГЭА и аллопрегнанолона, при измерении до введения дозы, а затем через 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч и 24 ч после введения дозы. Наконец, никаких изменений активных стероидов у людей для всех протестированных доз 3pMBP не наблюдали.

4. Взаимодействие 3pMBP с метаболическим ферментом CYP, UGT и клеточными белками-переносчиками

Материалы и методы

Потенциальное ингибирование под действием 3pMBP активности нескольких изозимов CYP (1А, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 3А) исследовали in vitro при использовании микросом печени человека.

3pMBP предварительно инкубировали в одной концентрации (10 мкМ) с субстратом и смешанными человеческими микросомами печени. Реакцию инициировали путем добавления образующих NADPH соединений, и после остановки реакции обрабатывали образцы; ВЭЖХ-УФ/вид и ВЭЖХ-МС/МС детектирование использовали для определения площади пиков, соответствующих метаболиту каждого субстрата.

3pMBP (10 мкМ) тестировали в анализе ингибирования UGT1A1 (рекомбинантный, субстрат скополетин). 3pMBP предварительно инкубировали с UGT1A1 и флуоресцентным субстратом скополетином в Трис-буфере (pH 7,5) в течение 15 минут при 37°C. Реакцию инициировали путем добавления кофактора уридин-дифосфатглюкуроновой кислоты (UDPGA), инкубирование продолжали в течение 60 минут, и относительную интенсивность флуоресценции (RFI) измеряли на флуоресцентном планшетном анализаторе.

Способность тестируемого соединения 3pMBP индуцировать CYP1A2, CYP2B6 и CYP3A4 исследовали in vitro в тройной повторности в тестируемых концентрациях 0,01, 0,1 и 1 мкМ с использованием уровня мРНК в качестве конечного результата.

Ингибирование под действием 3pMBP активности различных клеточных белков-переносчиков (OCT2, BCRP, OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, P-gp) исследовали in vitro.

Действие 3pMBP (10 мкМ) и референсных ингибиторов каждого белка-переносчика изучали в клеточной линии с оверэкспрессией клеточных переносчиков-мишеней. Яичники китайского хомячка (CHO) использовали для всех белков-переносчиков за исключением P-gp, который исследовали в клетках почек собаки Мадина-Дарби (MDR1-MDCKII). Ингибирование активности каждого белка-переносчика оценивали путем измерения изменений транспорта их специфических субстратов с помощью флуорометрии.

Результаты

3pMBP в концентрации 10 мкМ не вызывал значимого ингибирования активности изозимов CYP (1А, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6, 3А) и при 10 нМ, 100 нМ и 1 мкМ не повышал экспрессию CYP1A2, CYP2B6 и CYP3A4.

Согласно руководству FDA, 3pMBP может быть маркирован как лекарственное средство, не взаимодействующее с ферментами CYP.

Кроме того, 3pMBP (10 мкМ) не изменял активность UGT1A1 и нескольких клеточных белков-переносчиков (OCT2, BCRP, OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, P-gp).

Выводы

В целом 3pMBP демонстрирует благоприятные показатели всасывания/распределения/метаболизма/экскреции, которые не отличаются у самцов и самок и аналогичны у мышей, крыс, собак и людей, за исключением более длительного периода полувыведения и более высокой AUC у собак и людей, чем у двух других видов. 3pMBP также обладает хорошей биодоступностью (68% у собак).

3pMBP демонстрирует в четыре раза более высокую AUC в головном мозге, чем в плазме.

3pMBP также метаболически стабилен. Он не превращается в стероиды у мышей, крыс, собак и людей. Он показывает наиболее высокую стабильность in vitro в микросомах печени и гепатоцитах человека по сравнению с другими видами. У крыс in vivo 3pMBP не образует каких-либо метаболитов в количествах, превышающих следовые уровни в плазме, при этом большая часть соединения выводится в таком виде с калом.

Наконец, 3pMBP не ингибирует активность основных изоферментов CYP, UGT человека и клеточных переносчиков, а также не индуцирует экспрессию изоферментов CYP.

Adams AJ, Banister SD, Irizarry L, Trecki J, Schwartz M, Gerona R, "Zombie" Outbreak Caused by the Synthetic Cannabinoid AMB-FUBINACA in New York. N Engl J Med. 2017 Jan 19; 376(3):235-242

Bellocchio L, Lafenêtre P, Cannich A, Cota D, Puente N, Grandes P et al.Bimodal control of stimulated food intake by the endocannabinoid system. NatNeurosci 2010. 13, 281-283.

Bellocchio L, Soria-Gómez E, Quarta C, Metna-Laurent M, Cardinal P, Binder E, et al. Activation of the sympathetic nervous system mediates hypophagic and anxiety-like effects of CB₁ receptor blockade. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Mar 19; 110(12):4786-91.

Bermudez-Silva FJ, Cardinal P, Cota D. The role of the endocannabinoid system in the neuroendocrine regulation of energy balance. J Psychopharmacol. 2012 Jan; 26(1):114-24.

Bond and Lader, Br. J. Med. Psychol. 1974; 47:211-218

Busquets-Garcia A, Soria-Gómez E, Redon B, Mackenbach Y, Vallée M, Chaouloff F, Varilh M, Ferreira G, Piazza PV, Marsicano G. Pregnenolone blocks cannabinoid-induced acute psychotic-like states in mice, 2017 Nov;22(11):1594-1603

Cayrou S., Dickès P. & Dolbeault S. Profile Of Mood States (POMS-f) Journal de Thérapie Comportementale et Cognitive, 2003, 13(2), 83-88.

Cayrou S., Dickès P., Gauvain-Piquard A., Dolbeault S., Callahan S. & Roge B. Validation de la traduction française du POMS (Profile Of Mood States). Psychologie et Psychométrie, 2000, 21(4), 5-22.

Cerdá M, Wall M, Keyes K.M, Galea S, and Hasin D. Medical marijuana laws in 50 states: investigating the relationship between state legalization of medical marijuana and marijuana use, abuse and dependence. Drug Alcohol Depend. 2012; 120, 22-27;

Cook SA, Lowe JA, Martin BR. CB1 receptor antagonist precipitates withdrawal in mice exposed to Delta9-tetrahydrocannabinol. J Pharmacol Exp Ther. 1998 Jun; 285(3):1150-6.

Cutando L, Busquets-Garcia A, Puighermanal E, Gomis-González M, Delgado-García JM, Gruart A, Maldonado R, Ozaita A. Microglial activation underlies cerebellar deficits produced by repeated cannabis exposure. J Clin Invest. 2013 Jul;123(7):2816-31.

D'Souza DC. Cannabinoids and psychosis. Int Rev Neurobiol. 2007 78:289-326.

DSM-V Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 5th Edition. 2013 Washington DC, USA: American Psychiatric Press.

Ennaceur A. One-trial object recognition in rats and mice: Methodological and theoretical issues. Behav Brain Res. 2010 Dec 31; 215(2):244-54

Galli J. A., Sawaya R. A., Friedenberg F. K. Cannabinoid hyperemesis syndrome. Current Drug Abuse Reviews. 2011; 4(4):241-249

EPAR (EMEA) discussion: http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/EPAR_-_Scientific_Discussion/human/000666/WC500021284.pdf

George O, Vallée M, Vitiello S, Le Moal M, Piazza PV, Mayo W. Low brain allopregnanolone levels mediate flattened circadian activity associated with memory impairments in aged rats. Biol Psychiatry. 2010 Nov 15; 68(10):956-63

Hall W, and Degenhardt L. Adverse health effects of non-medical cannabis use. Lancet 2009 374, 1383-1391.

Howlett AC, Barth F, Bonner TI, Cabral G, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. International Union of Pharmacology. XXVII. Classification of cannabinoid receptors. Pharmacol Rev. 2002 Jun; 54(2):161-202.

Huang P, Liu-Chen LY, Unterwald EM, Cowan A. Hyperlocomotion and paw tremors are two highly quantifiable signs of SR141716-precipitated withdrawal from delta9-tetrahydrocannabinol in C57BL/6 mice. Neurosci Lett. 2009 Nov 6; 465(1):66-70.

Hutcheson DM, Tzavara ET, Smadja C, Valjent E, Roques BP, Hanoune J, Maldonado R. Behavioural and biochemical evidence for signs of abstinence in mice chronically treated with delta-9-tetrahydrocannabinol. Br J Pharmacol. 1998 Dec; 125(7):1567-77.

International Conference On Harmonisation Of Technical Requirements For Registration Of Pharmaceuticals For Human Use. The nonclinical evaluation of the potential for delayed ventricular repolarization (QT interval prolongation) by Human pharmaceuticals S7B. Revised Step.

Khan M, Pace L, Truong A, Gordon M, Moukaddam N, Catatonia secondary to synthetic cannabinoid use in two patients with no previous psychosis Am J Addict, 25 (1) (2016), pp. 25-27

Kedzior KK, Martin-Iverson MT. Chronic cannabis use is associated with attention-modulated reduction in prepulse inhibition of the startle reflex in healthy humans. J Psychopharmacol. 2006. 20:471-84.

Kirkham TC. Endocannabinoids in the regulation of appetite and body weight.Behav Pharmacol 2005.16, 297-313.

Lafaye G, Karila L, Blecha L, Benyamina A, Cannabis, cannabinoids, and health., Dialogues Clin Neurosci. 2017 Sep; 19(3):309-316.

Leggio GM, Cathala A, Neny M, Rouge-Pont F, Drago F, Piazza PV, Spampinato U. In vivo evidence that constitutive activity of serotonin2C receptors in the medial prefrontal cortex participates in the control of dopamine release in the rat nucleus accumbens: differential effects of inverse agonist versus antagonist. J Neurochem. 2009 Oct; 111(2):614-23

Lichtman AH, Fisher J, Martin BR. Precipitated cannabinoid withdrawal is reversed by Delta(9)-tetrahydrocannabinol or clonidine. Pharmacol Biochem Behav. 2001 May-Jun; 69(1-2):181-8.

Malinen H, Hyytiä P. Ethanol self-administration is regulated by CB1 receptors in the nucleus accumbens and ventral tegmental area in alcohol-preferring AA rats. Alcohol Clin Exp Res. 2008 Nov; 32(11):1976-83.

Martin WR, Sloan JW, Sapira JD and Jasinski DR. Physiologic, subjective, and behavioral effects of amphetamine, methamphetamine, ephedrine, phenmetrazine, and methylphenidate in man. Clin. Pharm. Ther. 1971 12:245-258, 1971.

Mazier W, Saucisse N, Gatta-Cherifi B, Cota D. The endocannabinoid system as pivotal orchestrator of obesity and metabolic disease. Trends Endocrinol Metab. 2015 Oct; 26(10):524-37.

McNair DM, Lorr M, Droppleman LF. Edits manual for the profile of mood states. San-Diego, California: Educational and industrial testing service, 1992.

Moreira FA, Grieb M, Lutz B. Central side-effects of therapies based on CB1 cannabinoid receptor agonists and antagonists: focus on anxiety and depression. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2009 Feb; 23(1):133-44.

Nagai H, Egashira N, Sano K, Ogata A, Mizuki A, Mishima K et al. Antipsychotics improve Delta9-tetrahydrocannabinol-induced impairment of the prepulse inhibition of the startle reflex in mice. Pharmacol Biochem Behav. 2006. 84: 330-6.

Patel S and Hillard CJ. Pharmacological evaluation of cannabinoid receptor ligands in a mouse model of anxiety: further evidence for an anxiolytic role for endogenous cannabinoid signaling. J Pharmacol Exp Ther. 2006 Jul 318(1):304-11.

Petit-Demouliere B, Chenu F, Bourin M. Forced swimming test in mice: a review of antidepressant activity. Psychopharmacology (Berl). 2005 Jan; 177(3):245-55.

Pratt J, Winchester C, Dawson N, Morris B Advancing schizophrenia drug discovery: optimizing rodent models to bridge the translational gap. Nat Rev Drug Discov. 2012 Jun 22; 11(7):560-79.

Rinaldi-Carmona M, Calandra B, Shire D, Bouaboula M, Oustric D, Barth F, Casellas P, Ferrara P, Le Fur G. Characterization of two cloned human CB1 cannabinoid receptor isoforms. J Pharmacol Exp Ther. 1996 Aug; 278(2):871-8.

S7A Safety Pharmacology Studies For Human Pharmaceuticals ICH July 2001

Sanchis-Segura C and Spanagel R. Behavioural Assessment of Drug Reinforcement and Addictive Features in Rodents: an Overview. Addict Biol 2006. 11:2-38.

Shore DM, Baillie GL, Hurst DH, Navas F, Seltzman HH, Marcu JP, et al. Allosteric modulation of a cannabinoid G protein-coupled receptor: binding site elucidation and relationship to G protein signaling. J Biol Chem. 2014 Feb 28; 289(9):5828-45.

Steiner MA, Marsicano G, Nestler EJ, Holsboer F, Lutz B, Wotjak CT. Antidepressant-like behavioral effects of impaired cannabinoid receptor type 1 signaling coincide with exaggerated corticosterone secretion in mice. Psychoneuroendocrinology. 2008 Jan; 33(1):54-67.

Substance Abuse and Mental Health Services Administration (2013). Results from the 2013 National Survey on Drug Use and Health: Summary of National Findings;

Substance Abuse and Mental Health Services Administration, Center for Behavioral Health Statistics and Quality. The DAWN Report: Highlights of the 2011 Drug Abuse Warning Network (DAWN) Findings on Drug-Related Emergency Department Visits. Rockville, MD: 2013. Feb 22

Tzavara ET, Davis RJ, Perry KW, Li X, Salhoff C, Bymaster FP, Witkin JM, Nomikos GG. The CB1 receptor antagonist SR141716A selectively increases monoaminergic neurotransmission in the medial prefrontal cortex: implications for therapeutic actions. Br J Pharmacol. 2003 Feb; 138(4):544-53.

Vallée M, Rivera JD, Koob GF, Purdy RH, Fitzgerald RL. Quantification of neurosteroids in rat plasma and brain following swim stress and allopregnanolone administration using negative chemical ionization gas chromatography/mass spectrometry. Anal Biochem. 2000 Dec 1; 287(1):153-66.

Vallée M, Vitiello S, Bellocchio L, Hébert-Chatelain E, Monlezun S, Martin-Garcia E, et al. Pregnenolone can protect the brain from cannabis intoxication. Science. 2014 Jan 3; 343(6166):94-8.

Volkow N.D, Baler R.D, Compton W.M, and Weiss S.R.B. Adverse health effects of marijuana use. N. Engl. J. Med. 2014 370, 2219-2227;

Walf AA and Frye CA. The use of the elevated plus maze as an assay of anxiety-related behavior in rodents. Nat Protoc. 2007; 2(2):322-8.

Wiley JL, Burston JJ, Leggett DC, Alekseeva OO, Razdan RK, Mahadevan A, Martin BR. CB1 cannabinoid receptor-mediated modulation of food intake in mice. Br J Pharmacol. 2005 Jun; 145(3):293-300.

Wiley JL, Evans RL, Grainger DB, Nicholson KL. Age-dependent differences in sensitivity and sensitization to cannabinoids and 'club drugs' in male adolescent and adult rats. Addict Biol. 2008. 13, 277-86.

Wilson CA, Koenig JI. Social interaction and social withdrawal in rodents as readouts for investigating the negative symptoms of schizophrenia. Eur Neuropsychopharmacol. 2014; 24:759-773.

World Health Organization, The Health and Social Effects of Nonmedical Cannabis Use, 2016

1. Применение соединения формулы (I):

формула (I)

для лечения нарушения, связанного с каннабиноидами.

2. Применение соединения по п. 1, где связанное с каннабиноидами нарушение выбирают из нарушения, связанного с употреблением каннабиноидов; отравления каннабиноидами; синдрома отмены каннабиноидов; другого вызванного каннабиноидами нарушения; неуточненного, связанного с каннабиноидами нарушения; синдрома каннабиноидного гиперемезиса; вызванной каннабиноидами кататонии.

3. Применение соединения по п. 1 или 2, где связанное с каннабиноидами нарушение является нарушением, связанным с употреблением каннабиноидов.

4. Применение соединения по п. 1 или 2, где связанное с каннабиноидами нарушение является отравлением каннабиноидами.

5. Применение соединения по п. 1 или 2, где связанное с каннабиноидами нарушение является синдромом отмены каннабиноидов.

6. Применение соединения по п. 1 или 2, где связанное с каннабиноидами нарушение является другим, вызванным каннабиноидами нарушением, выбранным из вызванного каннабиноидами тревожного расстройства, вызванного каннабиноидами психотического нарушения, вызванного каннабиноидами нарушения сна, каннабиноидного интоксикационного делирия.

7. Применение соединения по п. 1 или 2, где связанное с каннабиноидами нарушение является неуточненным, связанным с каннабиноидами нарушением.

8. Применение соединения по п. 1 или 2, где связанное с каннабиноидами нарушение является синдромом каннабиноидного гиперемезиса.

9. Применение соединения по п. 1 или 2, где связанное с каннабиноидами нарушение является вызванной каннабиноидами кататонией.

10. Применение соединения по любому из предыдущих пунктов, где каннабиноиды получены из растения Cannabis L.

11. Применение соединения по любому из предыдущих пунктов, где каннабиноиды являются синтетическими соединениями с активностью агониста CB1.

12. Применение соединения по любому из предыдущих пунктов, где указанное соединение вводят субъекту пероральным путем.

13. Применение соединения по любому из предыдущих пунктов, где указанное соединение вводят субъекту парентеральным путем.

14. Применение соединения по любому из предыдущих пунктов, где указанное соединение вводят субъекту внутривенным путем, или подкожным путем, или внутримышечным путем.

15. Применение соединения по любому из предыдущих пунктов, где указанное соединение вводят интраназально, или путем ингаляции, или подъязычно, или наружно, или трансдермально, или в форме суппозитория или пессария.

16. Применение соединения по любому из предыдущих пунктов, где указанное соединение вводят субъекту в дозе, составляющей от 1 мкг до 1000 мг.

17. Применение соединения по любому из предыдущих пунктов, где указанное соединение вводят в масляном растворителе, таком как растительное масло с длинноцепочечными триглицеридами и предпочтительно кукурузное масло.