Коррекция овуляторного цикла у самок реципиентов кролика для трансплантации эмбрионов, измененных методами генной инженерии

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и может быть использовано для подготовки самок реципиентов кролика с целью создания трансгенных животных. Коррекцию осуществляют внутримышечным введением самкам кроликов суспензии на основе прогестерона в дозе 11,5 мг/кг вне зависимости от фазы эстрального цикла, а через 4 дня после введения суспензии прогестерона осуществляют внутримышечное введение простагландина F2α в дозе 0,083 мг/кг с последующей хирургической трансплантацией генномодифицированных эмбрионов через 24-48 ч после наступления овуляции. Предлагаемая схема гормональной коррекции овуляторного цикла у самок реципиентов кролика для трансплантации эмбрионов, измененных методами генной инженерии, достоверно повышает количество имплантируемых эмбрионов при их трансплантации хирургическим методом. 1 табл., 1 пр.

 

Изобретение относится к экспериментальной фармакологии и генной инженерии и может быть использовано для подготовки самок реципиентов кролика с целью создания трансгенных животных.

В настоящее время, увеличивается темп работы лабораторий, занимающихся генным редактированием репродуктивного материала разных видов с целью воспроизведения более близкой к реальности модели заболевания в эксперименте или создания животных продуцентов лекарственных белков, которые могут стать биореакторами, многократно превышающими количественные характеристики производства и делающие процесс многократно выгоднее экономически. Кролик как биологический вид, становится все более привлекательным для исследователей из-за своих природных особенностей. В связи с чем становится все более актуальной разработка технологий воспроизведения репродуктивного материала, измененного методами генной инженерии.

Известно применение простагландина F2α, который способствует овуляции у телок препубертатного возраста (C.E.P. Leonardi L.F.M., Pfeifer M.I.B., Rubin J., SinghR.J., Mapletoft G.A., Pessoa A.M., Bainy C.A.M. Silva. Prostaglandin F2α promotes ovulation in prepubertal heifers Theriogenology. 2012. V. 78, N 7. P. 1578–82. DOI:10.1016/j.theriogenology), которое заключалось в том, чтобы определить влияние экзогенного простагландина F (2α) (PGF) с или без лечения прогестероном на первую овуляцию у телок препубертатного возраста. Телкам вводили интравагинальную вставку, высвобождающую прогестерон (CIDR; Pfizer Animal Health, Монреаль, Квебек, Канада), и вызывали фолликулярную волну с помощью 50 мг прогестерона + 2 мг эстрадиолбензоата внутримышечно, а также вводили аналог PGF. Время удаления CIDR, на 5 день фолликулярной волны (в среднем 8,6 ± 0,5 дня после введения CIDR); и (3) телки контрольной группы не получали лечения (N = 14).Телок обследовали ежедневно с помощью трансректального ультразвукового исследования с начала эксперимента для подтверждения того, что овуляция произошла, или до 5 дней после инъекции PGF (группы PG и PPG) или до тех пор, пока доминантные фолликулы следующей фолликулярной волны не достигли 8 мм (контрольная группа).

Данные способы гормональной коррекции овуляторного цикла невозможно применить на кроличьей модели в производстве, так как эстральный цикл крупного рогатого скота, в частности коров, существенно отличается от такового у кроликов. Так у крупного рогатого скота эстральный цикл длится от 18 до 24 дней, кролики (Oryctolagus cuniculus) обладают индуцированной овуляцией (Ramirez and Beyer, 1988) с нерегулярными и неопределенными циклами течки; поэтому на ферме (и в лаборатории) они могут размножаться в течение всего года при изобилии питательных кормов.( G. González-Mariscal; J.I. McNitt; S.D. Lukefahr (2007).Maternal care of rabbits in the lab and on the farm: Endocrine regulation of behavior and productivity. , 52(1), 0–91.doi:10.1016/j.yhbeh.2007.03.028)

Задачей изобретения является создание эффективного способа гормональной коррекции овуляторного цикла самок кроликов реципиентов для дальнейшего воспроизводства ими генномодифицированного потомства.

Технический результат заключается в повышении количества и качества имплантируемых генномодифицированных эмбрионов, с определенными необходимыми признаками.

Задача решается с помощью предлагаемого способа, включающего внутримышечное введение самкам кроликов суспензию на основе прогестерона в дозе 11,5 мг/кг вне зависимости от фазы эстрального цикла, а через 4 дня после введения суспензии прогестерона, осуществляют внутримышечное введение простагландина F2α в дозе 0,083 мг/кг, с последующей хирургической трансплантацией генномодифицированных эмбрионов через 24-48 часов после наступления овуляции.

Таким образом, поставленная задача решена. За счет предлагаемой гормональной коррекции овуляторного цикла самок кроликов с известным гормональным статусом повышается эффективность проведения успешной трансплантации репродуктивного материала, в результате чего повышается количество и качество имплантируемых генномодифицированных эмбрионов, что позволит самке кролика производить большее количество потомства, а это позволит увеличить темп генно-инженерного процесса в получении особей с определенными необходимыми признаками.

Способ осуществляется следующим образом.

Для исследования были выбраны самки кролика породы ХИКОЛЬ массой 3000-3200 г.

20 животным экспериментальной группы была осуществлена гормональная коррекция овуляторного цикла (n=20). Животные в контрольной группе были выбраны в эксперимент методом визуального определения эструса (n=20). У самок кролика экспериментальной группы предварительной выборки не проводилось.

Животные были распределены на 4 группы (N=10).

После проведения 20 животным из экспериментальной группы гормональной коррекции овуляторного цикла: 10 из них были оплодотворены искусственным осеменением, а 10 проводилась трансплантация генномодифицированных эмбрионов.

Остальные 20 животных были распределены по 10 животных в аналогичные группы без проведения гормональной коррекции овуляторного цикла.

Для осуществления первого этапа гормональной коррекции овуляторного цикла у самок кроликов внутримышечно вводилась суспензия прогестерона в дозе 11,25/кг вне зависимости от фазы эстрального цикла самок. Через 4 дня после введения прогестерона, осуществлялось внутримышечное введение простагландина F2α (ЗАО «Мосагроген», РФ) в дозе 0,083 мг/кг. Предполагаемое время наступления овуляции – 24-48 часов после введения второго препарата.

Пример конкретного выполнения.

Для исследования были выбраны самки кролика породы ХИКОЛЬ массой 3000-3200 г.

Животные были разделены на 4 группы:

1. Искусственное осеменение самок с предварительной гормональной коррекцией овуляторного цикла (ОГКЦ) (n=10).

2. Трансплантация эмбрионов хирургическим способом после предварительной гормональной коррекцией овуляторного цикла (ТГКЦ) (n=10).

3. Искусственное осеменение самок без предварительной гормональной коррекции овуляторного цикла (ОК) (n=10).

4. Трансплантация генномодифицированных эмбрионов хирургическим путем без предварительной коррекции овуляторного цикла (ТК) (n=10).

Для подготовки групп с предварительной гормональной коррекцией овуляторного цикла у самок кроликов внутримышечно вводился прогестерон (суспензия для инъекций, ЗАО «Мосагроген», РФ «Прогестомаг» рег. 32-3-4.15-2649 № ПВР-3-4.15/03139 от 27.06.2018) в дозе 11,25 мг/кг вне зависимости от фазы эстрального цикла самок. Для удобства введения препарата прогестерон на масляной основе готовили раствора суспензии прогестерона по известному способу, описанному в патенте № 2761137 публ. 06.12.2021 «В предварительно подготовленную стерильную пластиковую или стеклянную объёмом не более 100 мл ёмкость с крышкой помещается 9,95 мл дистиллированной воды. Далее данная ёмкость нагревается на водяной бане до 40°С, после чего в неё помещается с помощью инсулинового шприца 0,05 мл полисорбата Твин-80 и перемешивается стеклянной палочкой до полного растворения. Полученный раствор охлаждают до температуры ниже 25°С для того, чтобы избежать разрушение гормона, оптимальная температура (20-23°С). После охлаждения, струйно, вводим в раствор 1 мл препарата прогестерона. Добиваются гомогенности среды с помощью размешивания стеклянной палочкой или быстрого взбалтывания закрытой ёмкости. Используется непосредственно после приготовления в объеме индивидуальном для каждой особи из расчёта 4,5мг/100г. Хранению и повторному использованию полученная суспензия не подлежит во избежание потери гомогенности и распада среды на фазы, потери специфических свойств гормоном, а также развитии патогенной флоры». Через 4 суток после введения прогестерона, осуществлялось внутримышечное введение простагландина F2α (ЗАО «Мосагроген», РФ «Магестрофан» рег. 32- 3-4.15-2649 № ПВР-3-4.15/03139 от 11.06.15) в дозе 0,083 мг/кг. Предполагаемое время наступления овуляции – 24-48 часов после введения второго препарата. Запланированной датой родов считались 35 сутки с начала оплодотворения. Количество генномодифицированных эмбрионов, трансплантируемых самкам в исследуемых группах, составляло 15-18 штук.

После окрола был проведен подсчет потомства у самок кролика из разных исследуемых групп. Результаты эффективности предварительной гормональной коррекции овуляторного цикла представлены в Таблице 1.

Индекс эффективности имплантации рассчитывался путем отношения количества потомства к количеству беременных самок в группе.

Таблица 1

В ходе исследования было установлено, что гормональная коррекция овуляторного цикла группы самок при искусственном осеменении увеличивает количество оплодотворенных особей на 30% (р<0,05) относительно контрольной группы. Количество животных которым проводили трансплантацию генномодифицированных эмбрионов после гормональной коррекции овуляторного цикла по факту регистрации окрола на 35 сутки составило на 20% (р<0,05) больше в сравнении с контрольной группой которой проводили трансплантацию без коррекции. Индекс эффективности имплантации при применении препаратов по указанной схеме был выше на 58% у группы ТГКЦ в сравнении с ТК и на 17% больше у группы ОГКЦ в сравнении с ОК.

Таким образом, предлагаемая схема гормональной коррекции овуляторного цикла у самок реципиентов кролика для трансплантации эмбрионов, измененных методами генной инженерии, достоверно повышает количество и качество имплантируемых эмбрионов при их трансплантации хирургическим методом.

Способ коррекции овуляторного цикла у самок реципиентов кролика в эксперименте, характеризующийся тем, что осуществляют внутримышечное введение самкам кроликов суспензию на основе прогестерона в дозе 11,5 мг/кг вне зависимости от фазы эстрального цикла, а через 4 дня после введения суспензии прогестерона осуществляют внутримышечное введение простагландина F2α в дозе 0,083 мг/кг, с последующей хирургической трансплантацией генномодифицированных эмбрионов через 24-48 ч после наступления овуляции.