Рекомбинантный аналог домена б белка а bdpa-1, рекомбинантная плазмида для экспрессии белка bdpa-1, штамм-продуцент escherichia coli, продуцирующий белок bdpa-1, способ получения белка bdpa-1 и способ получения аффинного сорбента, содержащего bdpa-1 или его фрагмент в качестве лиганда
Владельцы патента RU 2789032:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН) (RU)
Общество с ограниченной ответственностью «ГРИНВЭН» (RU)
Изобретение относится к биотехнологии. Предложены гибридный белок BDPA-1, являющийся рекомбинантным аналогом домена Б белка А из Staphylococcus aureus и обладающий сорбционной активностью по отношению к иммуноглобулинам, и его фрагмент, нуклеиновая кислота, кодирующая гибридный белок BDPA-1, рекомбинантная плазмидная ДНК для экспрессии указанного гибридного белка, клетка, обеспечивающая продукцию гибридного белка BDPA-1, способ выделения BDPA-1, конъюгат сорбент-белок, а также способ получения сорбента. Изобретение позволяет получить гибридный белок BDPA-1 с электрофоретической чистотой не менее 96%, а также получить на основе указанного белка аффинного сорбента для выделения иммуноглобулинов класса G, обладающего динамической емкостью до 55 мг IgG на 1 мл сорбента и выдерживающего до 40 циклов использования и санации без существенной потери ёмкости, а именно менее 10%. 8 н. и 9 з.п. ф-лы, 25 ил., 3 табл., 7 пр.
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности, к генной и белковой инженерии. Настоящее изобретение относится к гибридному белку BDPA-1, являющемуся рекомбинантным аналогом домена Б белка А из Staphylococcus aureus, и его фрагменту, рекомбинантной плазмидной ДНК для экспрессии указанного гибридного белка и его фрагмента, штамму-продуценту, продуцирующему указанный гибридный белок и его фрагмент, способу получения, а также к способу выделения иммуноглобулинов класса G при помощи аффинного сорбента, содержащего гибридный белок BDPA-1 или его фрагмент в качестве лиганда.
Уровень техники
Иммуноглобулины представляют собой наиболее активно развивающийся на данный момент вид биофармацевтической продукции. Высокий коммерческий интерес к лекарственным средствам на основе иммуноглобулинов биотехнологий определяет высокую конкуренцию между биотехнологическими компаниями, что, в свою очередь, ведет к активному поиску решений, позволяющих снизить себестоимость препаратов, полученных на основе антител.
В качестве ключевого этапа производства таких препаратов следует выделить стадию очистки антител. Стандартным протоколом является применение методов аффинной хроматографии с использованием специфических сорбентов с конъюгированным белком А Staphylococcus aureus. Распространённость подхода объясняется его высокими показателями эффективности очистки, надёжности, селективности и возможности разработки общих платформ очистки антител из различных источников, включая культуры клеток млекопитающих, сыворотки крови или асцитных жидкостей.
Так, бактериальный белок А (Staphylococcus aureus) представляет собой наиболее часто используемый аффинный лиганд. Этот белок в своей структуре содержит домены, способные связываться с константными частями молекулы иммуноглобулина. Также разработаны модифицированные генноинженерные варианты лиганда на основе белка А, позволяющие увеличить значения рН при элюции IgG, увеличить динамические связывающие ёмкости сорбента и снизить диссоциацию лиганда с подложки сорбента.
Одной из проблем при использовании в хроматографии белка А является его ограниченная стабильность в сильно щелочных условиях, которые обычно используются для процедур очистки хроматографических колонок на месте в биотехнологической промышленности. Наиболее часто для санации сорбентов используют щелочные растворы, в особенности, раствор NaOH с концентрацией от 0,1 до 1 М, в зависимости от степени и характера загрязнения. Эта процедура подразумевает воздействие на матрицу растворов со значениями рН выше 13. Для многих матриц, содержащих белковые лиганды, это приводит к снижению емкости из-за нестабильности лиганда в условиях высоких рН.
В этой связи многочисленные исследования были сосредоточены на разработке модифицированных белковых лигандов, которые демонстрируют повышенную стабильность в условиях щелочных значений рН. Например, Гюлих и соавт. (Сюзанна Гюлих, Мартин Линхульт, Пер-Оке Нюгрен, Матиас Улен, София Хобер, Journal of Biotechnology 80 (2000), 169-178) использовали белковую инженерию для повышения стабильности стрептококкового альбумин-связывающего домена (ABD) в щелочных средах. Авторами указанной работы был создан мутант ABD, в котором все четыре остатка аспарагина были заменены лейцином (один остаток), аспартатом (два остатка) и лизином (один остаток). Далее, Гюлих и соавт. сообщают, что у данной мутантой формы не теряется связывающая способность, а аффинные сорбенты, содержащие сконструированный лиганд, демонстрируют более высокую ёмкость после многократного воздействия щелочных условий, чем сорбенты, полученные с использованием природного лиганда. Таким образом, был сделан вывод о том, что все четыре остатка аспарагина могут быть заменены без какого-либо существенного влияния на структуру и функции лиганда.
Недавно опубликованные данные позволяют предположить, что подобные замены также могут быть внесены в белок А (SpA), для достижения аналогичного результата. В работах показано что, когда по крайней мере один остаток аспарагина заменяется на аминокислоту, отличную от глутамина или аспарагиновой кислоты, лиганд приобретает повышенную химическую стабильность при значениях рН примерно до 13-14 (патент США 2005/0143566, B01D15/3809, опубл.16.11.2010), по сравнению с природным SpA, таким как B-домен SpA или белком Z, синтетическим аналогом B-домена SpA (патент США5,1 43,844, C07K 14/31, опубл. 01.09.1992). Авторы показывают, что, когда эти мутантные белки используются в качестве лигандов, аффинные матрицы на их основе, как и ожидалось, могут лучше выдерживать санацию с использованием щелочных агентов. Дальнейшие мутации доменов белка А с целью повышения стабильности при щелочных условиях также были опубликованы в работах /WO2008/039141, B01J20/24, опубл. 27.09.2007; JP2006304633A, B01J20/281, опубл. 09.11.2006; EP1992692A1, C07K16/00 опубл. 30.12.2009; EP2202310A2, C07K14/31, опубл. 30.06.2010; WO2010/110288, C07K14/47, опубл. 30.09.2010; WO2012/086660, C07K1/22, опубл. 2012-06-28.06.2012; WO2012/083425, C07K14/31, опубл. 28.06.2012, WO2012/087230, C07K1/22, опубл. 28.06.2012; WO2014/146350, C07K14/31, опубл 25.09.2014.
К общим недостаткам перечисленных методов относится невысокая продуктивность технологии получения белка А.
Известен гибридный белок, состоящий из соединённых между собой участков доменов E, C и Z SpA, причем все глицины были заменены на аланины для повышения устойчивости к щелочным условиям /патент CN111732642B, C07K 14/31, опубл. 02.10.2020/. Получившаяся на основе данного белка матрица имела ёмкость до 56 мг иммуноглобулинов на 1 мл сорбента и выдерживала до 24 часов обработки 0.5 М NaOH без существенной потери ёмкости. В указанном способе не проводилась проверка стабильности сорбента в ходе многократных циклов санации.
Известны различные мутантные варианты домена Z SpA /заявка на патент US20210032296A1, B01D 15/3809, опубл. 04.02.2021/. Полученные на их основе матрицы обеспечивают ёмкость до 65 мг иммуноглобулинов на 1 мл сорбента. Однако после 35 часов санации раствором 0.5 М NaOH ёмкость в самом лучшем случае составила 53 мг иммуноглобулинов на 1 мл сорбента, что соответствует потере в 18,5%.
Как можно заметить, имеющиеся в настоящее время мутанты все еще чувствительны к щелочному рН, а концентрация NaOH при санации обычно не превышает 0,1 М, что может приводить к неполной регенерации. Более высокие концентрации NaOH приводят к существенному снижению ёмкости матриц.
Таким образом, всё ещё существует потребность в получении аффинных матриц, содержащих белковые лиганды, обладающие повышенной стабильностью в щелочных средах. При этом именно стабильность аффинных матриц, а не их ёмкость, является ключевым параметром экономической эффективности продукта, поскольку стабильность в щелочных условиях позволяет многократно использовать сорбенты, подвергая их тщательной регенерации.
Технический результат настоящего изобретения состоит в получении препарата гибридного белка BDPA-1 с электрофоретической чистотой не менее 96%, а также в получении на основе указанного белка аффинного сорбента для выделения иммуноглобулинов класса G, обладающего динамической емкостью до 55 мг IgG на 1 мл сорбента и выдерживающий до 40 циклов использования и санации без существенной (менее 10%) потери ёмкости.
Для решения заявленной технической проблемы и достижения технического результата предлагается гибридный белок BDPA-1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1, представляющий собой рекомбинантный аналог домена Б белка А золотистого стафилококка (SpA), содержащий:
аминокислотный остаток МX1X2 YX3 с последовательностью SEQ ID NO: 2,
две копии последовательности модифицированного домена Б белка А с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3,
гибкий линкер
сайт расщепления X4X5 X6 X7 X8 X9,
гексагистидиновый домен (HS) с последовательностью SEQ ID NO: 4,
С-концевой цистеин,
где X1 — представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V, A, K;
X2—представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из K, N;
X3 — представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из H,Q,
X4 — представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, L, E;
X5 — представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, P;
X6 — представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, E, L;
X7 — представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, T, Y;
X8 — представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R, K, G, F;
X9 — может отсутствовать или представляет собой аминокислотный остаток Q.
где аминокислотный остаток МX1X2 YX3 - представляет собой MVKYH, или MVNYH, или MAKYH, или MANYH , или MVKYQ, или MVNYQ.
сайт расщепления X4X5 X6 X7 X8 X9 - представляет собой DDDDR, или DDDDK, или LPETG, или EDLYFQ, имеющие соответственно последовательности SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10.
Предлагается фрагмент гибридного белка BDPA-1, содержащий SEQ ID NO: 3 и любую из последовательностей SEQ ID NO: 5-8, связанные между собой гибким линкером,состоящим из трёх аминокислотных остатков.
Предлагается нуклеиновая кислота, имеющая последовательность SEQ ID NO: 6, кодирующая белок BDPA-1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1, или его фрагмент, и представляет собой любую последовательность SEQ ID NO: 10—65.
Предлагается рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая белок BDPA-1, состоящая из следующих ключевых генетических элементов:
промотора T7 и оператора lacO;
синтетической нуклеотидной последовательности;
ген β-лактамазы в качестве генетического маркера, детерминирующего устойчивость трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам;
ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);
ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI.
Предлагается штамм-продуцент, несущий нуклеиновую кислоту или рекомбинантную плазмидную ДНК.
Предлагается способ выделения гибридного белка, имеющего последовательность SEQ ID NO: 1, или его фрагмента, включающий в себя следующие стадии:
a) культивирования штамма-продуцента с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок BDPA-1;
b) выделения гибридного белка BDPA-1 из биомассы клеток штамма-продуцента, полученных на стадии а);
c) очистки гибридного белка BDPA-1.
На стадии c) очистку гибридного белка BDPA-1 осуществляют с использованием одной стадии хроматографии.
Также на стадии c) очистку гибридного белка BDPA-1 можно осуществлять с использованием нескольких стадий хроматографии.
Также на стадии c) очистку гибридного белка BDPA-1 можно осуществлять хроматографически на металл-хелатном сорбенте.
Также на стадии c) очистку гибридного белка BDPA-1 можно осуществлять хроматографически на анионообменном сорбенте.
Предлагается сорбент, представляющий собой твёрдую матрицу, к которой присоединён гибридный белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1 или его фрагмент. При этом твёрдая матрица сорбента состоит из кросс-сшитой агарозы или из полимеризованного метилметакрилата.
Предлагается способ получения сорбента, где гибридный белок, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1, или его фрагмент, присоединяется к твёрдой матрице химическими методами или ферментативными методами.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к гибридному белку BDPA-1, имеющему аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, содержащему стартовую последовательность SEQ ID NO: 2, две копии последовательности известного из уровня техники модифицированного домена Б белка А с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, гибкий линкер, сайт расщепления, гексагистидиновый домен (HS) SEQ ID NO: 4, и С-концевой цистеин.
Другим объектом изобретения является фрагмент гибридного белка BDPA-1 по пп.1-3, содержащий SEQ ID NO: 3 и любую из последовательностей SEQ ID NO: 5-9, связанные между собой гибким линкером, состоящим из трёх аминокислотных остатков.
Другим объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота SEQ ID NO: 6 или рекомбинантная плазмидная ДНК для экспрессии гибридного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
Кроме того, настоящее изобретение относится к штамму-продуценту, продуцирующий гибридный белок согласно настоящему изобретению, содержащему нуклеиновую кислоту или рекомбинантную плазмидную ДНК, как описано выше.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения гибридного белка BDPA-1, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, включающий стадии:
а) культивирования штамма-продуцента гибридного белка BDPA-1 с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок BDPA-1;
б) выделения гибридного белка BDPA-1 согласно настоящему изобретению из биомассы клеток штамма-продуцента, полученных на стадии а);
в) очистки гибридного белка BDPA-1.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения на стадии в) очистку гибридного белка BDPA-1 осуществляют с использованием одной стадии хроматографии.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения на стадии в) очистку гибридного белка BDPA-1 осуществляют с использованием нескольких стадий хроматографии.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения на стадии в) очистку гибридного белка BDPA-1 осуществляют хроматографически на металл-хелатном сорбенте.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения на стадии в) очистку гибридного белка BDPA-1 осуществляют с использованием анионообменной хроматографии.
Другим объектом настоящего изобретения является аффинный сорбент, который может быть получен посредством иммобилизации гибридного белка BDPA-1 или его фрагментов, содержащих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2 на поверхности твёрдой матрицы.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения аффинного сорбента.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения иммобилизациия гибридного белка BDPA-1 или его фрагментов на поверхности твёрдой матрицы проводится химически.
Согласно другому варианту осуществления настоящего изобретения иммобилизациия гибридного белка BDPA-1 или его фрагментов на поверхности твёрдой матрицы проводится ферментативно.
Подробное описание изобретения
Одним из объектов настоящего изобретения является гибридный белок BDPA-1, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, содержащий стартовую последовательность SEQ ID NO: 2, две копии последовательности известного из уровня техники модифицированного домена Б белка А с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3, гибкий линкер, сайт расщепления, гексагистидиновый домен (HS) SEQ ID NO: 4 и С-концевой цистеин. Каждая копия последовательности домена Б белка А имеет последовательность SEQ ID NO: 3. Гексагистидиновый домен необходим для выделения гибридного белка при помощи металл-хелатной хроматографии, а С-концевой остаток цистеина – для сайт-специфичной химической иммобилизации белка на твердой матрице через тиольные группы цистеинов. Сайт расщепления представлен аминокислотными остатками 125—130 и может использоваться для отщепления концевой последовательности, содержащей гексагистидиновый домен. Аминоксилотные последовательности, применявшиеся в качестве сайтов расщепления, перечислены в таблице 1.
Таблица 1. Сайты расщепления
| № | Сайт | SEQ ID |
| 1 | Энтеропептидазы | 6 |
| 2 | Энтеропептидазы | 7 |
| 3 | Сортазы А | 8 |
| 4 | TEV-протеиназы | 9 |
Стартовая последовательность SEQ ID NO: 2 представлена аминокислотными остатками 1-5, возможные аминокислотные остатки приведены в табл. 2.
Таблица 2. Варианты аминокислотных остатков стартовой последовательности
| Позиция | Варианты аминокислотных остатков |
| 2 | Любой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V, A, K |
| 3 | K, N |
| 5 | H, Q |
Таким образом, стартовая последовательность может представлять собой MVKYH, или MVNYH, или MAKYH, или MANYH, или MKNYH, или MKKYH, или MKNYQ, или MVKYQ, или MVNYQ, или MKNYQ, или MAKYQ, или MANYQ.
Специалисту понятно, что гибкий линкер может быть удалён или заменён на гибкий линкер с другой аминокислотной последовательностью.
Другим объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота с последовательностью SEQ ID NO: 5 или рекомбинантная плазмидная ДНК для экспрессии гибридного белка, имеющего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1. Таким образом, изобретение охватывает любую нуклеиновую кислоту (РНК или ДНК), кодирующую последовательность SEQ ID NO: 1. Указанная нуклеиновая кислота может использоваться сама по себе, а может входить в любой рекомбинантный вектор для экспрессии в различных штаммах-продуцентах.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, в качестве вектора используют рекомбинантную плазмидную ДНК pET-32b-pBDPA-1, в которую химико-ферментативным путем клонирована последовательность, кодирующая гибридный белок SEQ ID NO: 1.
Ещё одним объектом настоящего изобретения является соответствующий штамм-продуцент, несущий указанную нуклеиновую кислоту или рекомбинантный вектор, кодирующий гибридный белок SEQ ID NO: 1. Специалисту понятно, что в качестве штамма-продуцента может выступать грамм-положительная (например, Bacillus subtilis) или грамм-отрицательная бактерия (например, Escherichia coli), дрожжи (например, Pichia pastoris), или эукариотические клетки (например, CHO). Для трансформации нуклеиновой кислоты или рекомбинантного вектора, кодирующего гибридный белок SEQ ID NO: 1, могут использоваться любые методы трансформации, известные из уровня техники, например, метод с использованием полиэтиленгликоля, кальций-хлоридный метод, метод электропорации. Также для целей настоящего изобретения для введения в клетки могут использоваться и другие методы трансформации, не упомянутые в настоящем описании в явном виде, которые известны в уровне техники в настоящее время или будут созданы впоследствии. При осуществлении конкретных воплощений настоящего изобретения специалист, основываясь на существующем уровне знаний, может выбрать наиболее оптимальный метод трансформации клеток.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, в качестве штамма-продуцента используют штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/BDPA-1, созданный на основе коммерчески доступного штамма Е.coli BL21 (DE3).
Cпециалисту понятно, что в качестве штамма может быть взят любой другой известный из уровня техники в настоящее время или созданный впоследствии штамм E. Coli.
Для получения биомассы созданного штамма-продуцента осуществляют его культивирование, после чего доступными из уровня техники методами отделяют фракцию, содержащий целевой белок.
Специалисту понятно, что культивирование может осуществляться на орбитальном шейкере в колбах Эрленмейера, в ферментёрах различного объёма или любыми другими известными из уровня техники в настоящее время или созданными впоследствии способами.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, отделение культуральной жидкости от клеток осуществляют центрифугированием.
В предпочтительном воплощении, однако без ограничения, дезинтеграцию клеток осуществляют при помощи ультразвукового дезинтегратора.
Для получения гибридного белка SEQ ID NO: 1 применяют известные из уровня техники хроматографические методы. В более предпочтительных воплощениях, но без ограничения ими, выделение гибридного белка SEQ ID NO: 1 осуществляют при помощи нескольких стадий хроматографии.
В более предпочтительных воплощениях, но без ограничения ими, выделение гибридного белка SEQ ID NO: 1 осуществляют на металл-хелатном хроматографическом сорбенте.
В предпочтительном воплощении, однако также без ограничения, дальнейшую очистку гибридного белка SEQ ID NO: 1, осуществляют на анионообменном сорбенте.
Другим объектом настоящего изобретения является аффинный сорбент, который может быть получен посредством иммобилизации гибридного белка BDPA-1 или его фрагмента на поверхности твёрдой матрицы химическим или иным путем. Специалисту ясно, что в качестве твёрдой матрицы могут быть использованы различные хроматографические сорбенты, содержащие функциональные группы для иммобилизации лигандов на их поверхности.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, гибридный белок согласно данному изобретению, может быть иммобилизован на коммерчески доступный сорбент Sepharose FF.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, иммобилизуется полноразмерный гибридный белок BDPA-1.
В более предпочтительных воплощениях, но без ограничения ими, иммобилизуется фрагмент гибридного белка, у которого отщеплена С-концевая область после сайта расщепления.
Другим объектом настоящего изобретения является способ получения аффинного сорбента. Специалисту ясно, что для иммобилизации гибридного белка или его фрагмента согласно настоящему изобретению может быть использован любой доступный из уровня техники способ иммобилизации белковых лигандов на поверхности твёрдой матрицы.
В предпочтительном варианте, однако без ограничения, аффинный сорбент согласно данному изобретению может быть получен путём иммобилизации гибридного белка BDPA-1 через тиоэфирную связь С-концевого цистеина. Данный способ широко применяется для иммобилизации белков. Его главное преимущество заключается в специфичности иммобилизации. Присоединение через С-концевой цистеин обеспечивает пространственную доступность лиганда.
В более предпочтительных воплощениях, но без ограничения ими, аффинный сорбент согласно данному изобретению может быть получен путём иммобилизации фрагмента гибридного белка BDPA-1 на любой твёрдой матрице с первичными аминными группами с использованием сортазы А.
Определения и термины
Различные термины, относящиеся к объектам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения. Если иное не оговаривается, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же самое значение, которое понятно для специалистов в данной области. Ссылки на методики, используемые при описании данного изобретения, относятся к хорошо известным методам, включая изменения этих методов и замену их эквивалентными методами, известными специалистам.
В описании данного изобретения термины «включает» и «включающий» интерпретируются как означающие «включает, помимо всего прочего». Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».
Как используется в настоящем документе, термин «гибридный белок BDPA-1» относится к полипептиду, имеющему следующую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.
Как используется в настоящем документе, термины «твёрдая матрица», «подложка сорбента» относятся к нерастворимому материалу, предпочтительно, но без ограничения в форме сфер, мембран, пористых частиц, непористых частиц, волокон.
Как используется в настоящем документе, термин «хроматография» относится к методу разделения, использующему хроматографические принципы, предпочтительно, но без ограничения, реализованного в виде одноколоночной, многоколоночной и мембранной хроматографии.
Как используется в настоящем документе, термин «стартовая последовательность» означает аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2.
Как используется в настоящем документе, термин «сайт расщепления» означает любой из фрагментов аминокислотных последовательностей, распознаваемый известным из уровня техники протеолитическим ферментом, включая, но не ограничиваясь энтеропептидазой, TEV-протеиназой, сортазой А.
Как используется в настоящем документе, термин «энтеропептидаза» означает протеолитический фермент с шифром КФ 3.4.21.9, а также все его фрагменты и аналоги, обладающие специфической протеолитической активностью в отношении фрагментов аминокислотных последовательностей, включающих -Asp-Asp-Asp-Asp-Lys- (SEQ ID NO: 6) и -Asp-Asp-Asp-Asp-Arg- (SEQ ID NO: 7).
Как используется в настоящем документе, термин «Сортаза А» означает фермент с шифром КФ 3.4.22.70, а также все его фрагменты и аналоги, обладающие специфической протеолитической активностью в отношении фрагментов аминокислотных последовательностей, включающих -Glu-Pro-Xaa-Thr-Gly- (SEQ ID NO: 8).
Как используется в настоящем документе, термин «TEV-протеиназа» означает протеолитический фермент с шифром КФ 3.4.22.44, а также все его фрагменты и аналоги, обладающие специфической протеолитической активностью в отношении фрагментов аминокислотных последовательностей, включающих -Glu-Xaa-Leu-Tyr-Phe-Gln- (SEQ ID NO: 9).
Как используется в настоящем документе, термин «линкер» означает сегмент аминокислотных остатков, который соединяет различные области белка или сегмент аминокислотных остатков, располагающийся на концах белка.
Варианты осуществления настоящего изобретения
Далее будут приведены варианты осуществления изобретения в виде нескольких примеров. Каждый пример предоставлен посредством объяснения изобретения и не может являться ограничением изобретения. Фактически, специалистам в данной области техники будет понятно, что в изобретение могут быть внесены различные модификации и изменения без отступления от объёма или сущности изобретения. Например, признаки, показанные или описанные как один вариант осуществления, могут быть использованы в другом варианте осуществления для получения ещё одного варианта осуществления. Также нуклеотидные последовательности, кодирующие определённые аминокислотные последовательности, могут быть заменены на аналогичные нуклеотидные последовательности по таблице трансляции кодонов.
Специалисту понятно, что SEQ ID NO: 2 может быть заменён на любую другую последовательность, обеспечивающую высокий уровень биосинтеза белка в клетке-продуценте, известную из уровня техники или которая будет обнаружена впоследствии. Также специалисту понятно, что гибкий линкер может быть удалён или заменён на линкер, состоящий из других аминокислотные остатков, обеспечивая гибкую связь указанных областей гибридного белка.
Таким образом, предполагается, что модификации и изменения, подпадающие под объём прилагаемых пунктов формулы изобретения и их эквивалентов, охватываются настоящим изобретением. В случае предоставление диапазонов для параметров, предполагается, что в данный диапазон также включается каждая из конечных точек такого диапазона. Специалисту в данной области техники следует понимать, что настоящее исполнение представляет собой описание только приведённых в качестве примера вариантов осуществления и не предполагается в качестве ограничения более широких аспектов настоящего изобретения, более широкие аспекты которого являются осуществленными приведёнными в качестве примера схемами, конструкциями, техниками и процедурами.
Примеры
Пример 1. Конструирование вариантов экспрессионной плазмиды pET32a-BDPA1
Химический синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфоамидитным методом на ДНК-синтезаторе ASM-102U (БИОССЕТ, Новосибирск) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3'-конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов – 5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3'-O-(β-цианэтил-диизопропиламино)-фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 Å), к которому через 3'-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл стандартного фосфоамидитного метода.
Для приготовления вектора ДНК плазмиды pET32a (180 мкг, 60 пмоль) обрабатывают в 2.4 мл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (600 ед. акт.), а затем — в 2.4 мл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (600 ед. акт.) в течение 1 ч при 37°С. Векторный фрагмент после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 12 мл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 3 мл буфера NE.
Варианты олигонуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 5, кодирующей гибридный белок SEQ ID NO: 1, получают в соответствии с табл. 3 полным нуклеотидным синтезом. Полученные синтетические последовательности SEQ ID NO: 5 обрабатывают в 40 мкл буфера 20 мМ Трис-ацетата, 10 мМ ацетата магния, 50 мМ ацетатат калия, 100 мкг/мл БСА рестриктазой XhoI (10 ед. акт.), а затем - в 40 мкл буфера 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 100 мкг/мл БСА рестриктазой NdeI (10 ед.акт.) в течение 1 ч при 37°С. Синтетические фрагменты после электрофореза в 15% агарозном геле вырезают из геля и переносят в 200 мкл буфера NT, растворяют при 50°С в течение 5-10 мин и наносят на колонку NucleoSpinExtractII. Промывают буфером NT 3 и элюируют 50 мкл буфера NE.
Таблица 3. Варианты нуклеотидной последовательности синтетической вставки SEQ ID NO: 5
| № | Нуклеотиды поз. 1-15 | Нуклеотиды поз. 373-387 | Последовательность |
| atggtgaaatatcat | gatgatgatgataga | SEQ ID NO: 10 | |
| atggtgaaatatcat | gatgatgatgataaa | SEQ ID NO: 11 | |
| atggtgaaatatcat | gaagatctgtattttcag | SEQ ID NO: 12 | |
| atggtgaaatatcat | gaaaatctgtattttcag | SEQ ID NO: 13 | |
| atggtgaaatatcat | ctgccggaaactggt | SEQ ID NO: 14 | |
| atggtgaaatatcat | ctgccgaatactggt | SEQ ID NO: 15 | |
| atggtgaaatatcat | ctgccggcgactggt | SEQ ID NO: 16 | |
| atggtgaattatcat | gatgatgatgataga | SEQ ID NO: 17 | |
| atggtgaattatcat | gatgatgatgataaa | SEQ ID NO: 18 | |
| atggtgaattatcat | gaagatctgtattttcag | SEQ ID NO: 19 | |
| atggtgaattatcat | gaaaatctgtattttcag | SEQ ID NO: 20 | |
| atggtgaattatcat | ctgccggaaactggt | SEQ ID NO: 21 | |
| atggtgaattatcat | ctgccgaatactggt | SEQ ID NO: 22 | |
| atggtgaattatcat | ctgccggcgactggt | SEQ ID NO: 23 | |
| atggcgaaatatcat | gatgatgatgataga | SEQ ID NO: 24 | |
| atggcgaaatatcat | gatgatgatgataaa | SEQ ID NO: 25 | |
| atggcgaaatatcat | gaagatctgtattttcag | SEQ ID NO: 26 | |
| atggcgaaatatcat | gaaaatctgtattttcag | SEQ ID NO: 27 | |
| atggcgaaatatcat | ctgccggaaactggt | SEQ ID NO: 28 | |
| atggcgaaatatcat | ctgccgaatactggt | SEQ ID NO: 29 | |
| atggcgaaatatcat | ctgccggcgactggt | SEQ ID NO: 30 | |
| atggcgaattatcat | gatgatgatgataga | SEQ ID NO: 31 | |
| atggcgaattatcat | gatgatgatgataaa | SEQ ID NO: 32 | |
| atggcgaattatcat | gaagatctgtattttcag | SEQ ID NO: 33 | |
| atggcgaattatcat | gaaaatctgtattttcag | SEQ ID NO: 34 | |
| atggcgaattatcat | ctgccggaaactggt | SEQ ID NO: 35 | |
| atggcgaattatcat | ctgccgaatactggt | SEQ ID NO: 36 | |
| atggcgaattatcat | ctgccggcgactggt | SEQ ID NO: 37 | |
| atgaaaaaatatcat | gatgatgatgataga | SEQ ID NO: 38 | |
| atgaaaaaatatcat | gatgatgatgataaa | SEQ ID NO: 39 | |
| atgaaaaaatatcat | gaagatctgtattttcag | SEQ ID NO: 40 | |
| atgaaaaaatatcat | gaaaatctgtattttcag | SEQ ID NO: 41 | |
| atgaaaaaatatcat | ctgccggaaactggt | SEQ ID NO: 42 | |
| atgaaaaaatatcat | ctgccgaatactggt | SEQ ID NO: 43 | |
| atgaaaaaatatcat | ctgccggcgactggt | SEQ ID NO: 44 | |
| atgaaaaattatcat | gatgatgatgataga | SEQ ID NO: 45 | |
| atgaaaaattatcat | gatgatgatgataaa | SEQ ID NO: 46 | |
| atgaaaaattatcat | gaagatctgtattttcag | SEQ ID NO: 47 | |
| atgaaaaattatcat | gaaaatctgtattttcag | SEQ ID NO: 48 | |
| atgaaaaattatcat | ctgccggaaactggt | SEQ ID NO: 49 | |
| atgaaaaattatcat | ctgccgaatactggt | SEQ ID NO: 50 | |
| atgaaaaattatcat | ctgccggcgactggt | SEQ ID NO: 51 | |
| atgaataaatatcat | gatgatgatgataga | SEQ ID NO: 52 | |
| atgaataaatatcat | gatgatgatgataaa | SEQ ID NO: 53 | |
| atgaataaatatcat | gaagatctgtattttcag | SEQ ID NO: 54 | |
| atgaataaatatcat | gaaaatctgtattttcag | SEQ ID NO: 55 | |
| atgaataaatatcat | ctgccggaaactggt | SEQ ID NO: 56 | |
| atgaataaatatcat | ctgccgaatactggt | SEQ ID NO: 57 | |
| atgaataaatatcat | ctgccggcgactggt | SEQ ID NO: 58 | |
| atgaataattatcat | gatgatgatgataga | SEQ ID NO: 59 | |
| atgaataattatcat | gatgatgatgataaa | SEQ ID NO: 60 | |
| atgaataattatcat | gaagatctgtattttcag | SEQ ID NO: 61 | |
| atgaataattatcat | gaaaatctgtattttcag | SEQ ID NO: 62 | |
| atgaataattatcat | ctgccggaaactggt | SEQ ID NO: 63 | |
| atgaataattatcat | ctgccgaatactggt | SEQ ID NO: 64 | |
| atgaataattatcat | ctgccggcgactggt | SEQ ID NO: 65 |
Каждый из описанных выше полученных синтетических фрагментов в количестве 2 пмоль прибавляют к раствору 1 мкг, полученного из ДНК плазмиды pET32a, описанного выше векторного фрагмента в 10 мкл буфера (20 мМ трис-HCl, рН 7,56, 10 мМ MgCl2, 0,2 мМ rATP, 10 мМ дитиотреитол) и лигируют с помощью 10 ед.акт. Т4-ДНК-лигазы в течение 12 ч при 10°С.
Помещают на лёд пробирки с компетентными клетками (XL1-Blue, Евроген) до полного размораживания содержимого из расчёта одна пробирка на трансформацию. Аккуратно перемешивают суспензию клеток легким встряхиванием. Добавляют в каждую пробирку полученные после обработки Т4-ДНК-лигазой аликвоты реакционных смесей, аккуратно перемешивают содержимое лёгким встряхиванием. Инкубируют пробирки во льду в течение 20-30 мин. Переносят пробирки в водяную баню (42 °C) на 30-45 сек. Быстро переносят пробирки из водяной бани в лёд и инкубируют в течение 3-5 мин. Добавляют не менее 3-х объёмов предварительно подогретой до 37-42°C среды SOB или SOC (Becton Dickinson), перемешивают содержимое и инкубируют при 37°C в течение 40-60 мин в орбитальном шейкере-инкубаторе (Multitron, Infors) при скорости 225-250 об/мин. Высеивают содержимое пробирок на чашки Петри диаметром 60 мм (Перинт).
Аликвоты полученных плазмидных ДНК используют для трансформации компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3). Трансформанты высевают на чашки с агаризованной средой LB, в которую добавляют ампициллин до конечной концентрации ампициллина 50 мкг/мл. Из клонов выделяют ДНК плазмиды pET32a-BDPA1. Скрининг рекомбинантов проводят с помощью секвенирования.
Пример 2. Получение штамма-продуцента Е.coli BL21 (DE3)/BDPA1 и характеристика его продуктивности
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/BDPA1 получают трансформацией компетентных клеток Е.coli BL21 (DE3) любой из вариантов плазмиды (1-56), получение которых описано в примере 1.
Штамм-продуцент Е.coli BL21 (DE3)/BDPA1 культивируют при 37°С в 100 мл жидкой питательной среды LB с добавкой ампициллина до конечной концентрации ампициллина 100 мкг/мл в течение 3 ч в колбах Эрленмейера (1л, Corning) в орбитальном шейкере-инкубаторе со скоростью вращения 220 об/мин до достижения оптической плотности культуральной жидкости при длине волны 600 нм 0,7-0,8 ед. Затем осуществляют индукцию биосинтеза рекомбинантного белка прибавлением изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида до конечной концентрации изопропил-β-D-1-тиогалактоприанозида 0,5 мМ и инкубируют в течение 4 ч. Каждый час отбирают пробу по 2 мл, количество культуры, соответствующее 1 мл, центрифугируют в течение 10 мин при 6000 об/мин. Осаждённые клетки переносят в 100 мкл лизирующего буфера с красителем бромфеноловым синим, с добавлением 2-меркаптоэтонола, инкубируют 5 мин при 98°С, аликвоты по 3 мкл используют для электрофореза в 14% SDS-ПААГ. Гель окрашивают добавлением 0,1% раствора Кумасси R-250 и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Результаты для всех вариантов (1—56) представлены на Фиг. 2 (А)-(З). Выход гибридного белка BDPA-1 по результатам денситометрического анализа составляет не менее 5% относительно суммарного белка клетки.
Пример 3. Получение BDPA-1 и его вариантов
После окончания культивирования по примеру 2 клетки продуцента рекомбинантного белка (биомассу) в любом из вариантов 1—56 отделяют центрифугированием (5000g, 20 мин, 4°С), разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе (Elma) в буферном растворе (50 мМ Tрис/HCl, 5 мМ ЭДТА, рН 8). Добавляют мочевину до конечной концентрации 4 М, перемешивают, фильтруют на водоструйном насосе через фильтр 0,45 мкм (МЕ 25, Schleicher and Schuell), после чего разбавляют буфером 50 мМ Tрис/HCl, рН 8 до концентрации мочевины 1М. Раствор белка наносят на ионообменный сорбент (DEAE Sepharose, GE Healthcare) и элюируют белок градиентом буферного раствора 50 мМ Tрис/HCl, 1М NaCl, рН 8. Из фракций после хроматографии отбирают пробы в количестве 30 мкл и с красителем бромфеноловым синим инкубируют 3 мин при 100°С. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Отбирают фракции, содержащие целевой белок, наносят на металл-хелатный сорбент (Profinity IMAC, Ni-charged, Bio-Rad) и элюируют белок градиентом буферного раствора 0,5 M имидазол, 50 мМ Трис, 0,3 M NaCl, pH 8. Из фракций после хроматографии отбирают пробы в количестве 30 мкл и с красителем бромфеноловым синим инкубируют 3 мин при 100°С. Пробы по 4 мкл используют для электрофореза в 15% SDS-ПААГ. Гель прокрашивают кумасси R-250 по стандартной методике и сканируют с помощью денситометра Shimadzu CS-930. Отбирают фракции, содержащие целевой белок с максимальной степенью чистоты и обессоливают на колонке с сорбентом G-25 Sepharose (GE Healthcare) в буфере 100 мМ NaHCO3 pH 8.5. Чистота препарата составляет не менее 96% согласно электрофореграмме на фиг. 3.
Пример 4. Методика получения сорбента на основе гибридного белка BDPA-1 и его вариаций химическим способом
Для активации матрицы 10 грамм навески отфильтрованной твёрдой матрицы, в качестве которой может выступать кросс-сшитая агароза или полимер акриловой кислоты или её модификаций, переносят в пробирку. Добавляют к твёрдой матрице 4 мл диглицидилового эфира 1,4-бутандиола, 4 мл 0.5М NaOH и 1 мл диметилформамида. Пробирку помещают на орбитальный шейкер (Biosan) на 8-12 часов при скорости 80-100 об/мин и температуре 25°С. Готовый носитель последовательно отмывают на стеклянном фильтре 25% этанолом в Н2О, затем 100 мМ NaHCO3 pH 8.5. Переносят эпокси-активированную сефарозу обратно в пластиковые пробирки. Добавляют к носителю 10 мл раствора гибридного белка BDPA-1 в любом из вариантов 1—55 с концентрацией 0.68 мг/мл, предварительно добавив к раствору гибридного белка BDPA-1 меркаптоэтанол до 14 мМ. Для блокировки остаточных эпоксидных групп к носителю добавляют 2 мл 1М раствора этаноламина в 100 мМ NaHCO3, pH 8.4. Пробирку помещают на вращающуюся платформу 4-8 часов при температуре 25°С. По окончании реакции на стеклянном фильтре промывают носитель буферным раствором 100 мМ NaHCO3 pH 8.5, затем буферным раствором PBS (137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1.8 мМ KH2PO4, pH 7.4).
Пример 5. Методика получения сорбента на основе гибридного белка BDPA-1 и его вариаций ферментативным способом
Твёрдую матрицу с первичными аминогруппами на поверхности отмывают последовательно:
100 мМ NaHCО3 рН 8.43 - трёхкратно,
50 мМ Трис, рН 8.0 - двухкратно,
100 мМ ацетат натрия pH 4.5 - двухкратно,
50 мМ Трис, рН 8.0 - трёхкратно,
в соотношении 1:15 на стеклянном фильтре при помощи водоструйного насоса. Доводят значение pH до 8.0. Полученный сорбент помещают в центрифужную пробирку на 50 мл и добавляют на 10 мл сорбента последовательно: 200 мг гибридного белка BDPA-1 в люом из вариантов 5, 6, 7, 12, 13, 14, 19, 20, 21, 26, 27, 28, 33, 34, 35, 40, 41, 42, 47, 48, 49, 54, 55 или 56 (9.5 мл белка с концентрацией 21 мг/мл), 1.25 мл раствора NaCl с исходной концентрацией 4 М, 15.3 мл раствора Сортазы А с исходной концентрацией 5.9 мг/мл. Далее доводят общий объём до 50 мл буфером 50 мМ Трис с рН 8.0. Проверяют значение рН, при необходимости доводят до 8.0. Полученный раствор белка с сорбентом помещают в термостатируемый орбитальный шейкер на 3 часа при температуре 37°С и скорости 80—100 об/мин.
Пример 6. Измерение динамической ёмкости полученного сорбента и его вариантов
Используемые растворы:
Раствор для уравновешивания: 137 мМ NaCl, 2.7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1.8 мМ KH2PO4, pH 7.4.
Раствор гуманизированных моноклональных антител класса G с концентрацией 2 мг/мл в растворе для уравновешивания.
Раствор для элюции: 100 мМ глицин, pH 3.5.
2 мл сорбента, полученного в примерах 4 и 5, упаковывают в хроматографическую колонку С10/10 (Cytiva, США), затем промывают 10 мл раствора для уравновешивания и наносят раствор иммуноглобулинов класса G со скоростью, обеспечивающей время контакта с сорбентом 3 минуты (время контакта рассчитывают, как отношение высоты слоя сорбента к линейной скорости потока, умноженное на 60). Нанесение прекращают, когда концентрация белка в проскоке достигает 10% от исходной, после чего элюируют иммуноглобулины класса G буфером для элюции. Учитывая исходную концентрацию целевого вещества, рассчитывают количество белка, нанесенного на сорбент до момента фиксации 10%-проскока. Зная объём сорбента, рассчитывают емкость на 1 мл сорбента. Полученного значение принимают за динамическую ёмкость при 10%-проскоке (DBC10) при времени контакта 3 минуты. Изменяя линейную скорость, повторяют эксперимент, вычисляя динамическую емкость при различном времени контакта с сорбентом (1 минута, 6 минут, 10 минут). Полученные результаты представлены для химического способа получения на Фиг. 4, а для ферментативного - на Фиг. 5. В соответствии с этими данными, динамическая ёмкость всех представленных сорбентов при ферментативном способе получения составляет до 55 мг на 1 мл.
Пример 7. Тестирование стабильности сорбента на основе гибридного белка BDPA-1 и его вариантов после многократной регенерации щелочью
Используя растворы, указанные в примере 6, проводят следующий цикл регенерации сорбента. Сорбент при линейной скорости 74 см/час промывают последовательно: 10 мл раствора для уравновешивания, 10 мл раствора для элюции, 10 мл раствора для уравновешивания, 20 мл раствора 0.1 М NaOH, 10 мл раствора для уравновешивания. Данный цикл повторяют до 40 раз, при этом рассчитывают DBC10 при времени контакта 3 минуты после циклов № 1, 10, 20, 30, 44. Результаты представлены на Фиг. 5 (А)-(Е). Варианты гибридного белка BDPA-1 приведены согласно табл. 3. В соответствии с этими данными, динамическая ёмкость всех представленных сорбентов теряет не более 10% ёмкости при 40 циклах регенерации.
Перечень последовательностей, представленных в описании изобретения
SEQ ID NO: 1. Аминокислотная последовательность гибридного белка BDPA-1
SEQ ID NO: 2. Аминокислотная последовательность стартовой части
SEQ ID NO: 3. Аминокислотная последовательность домена B белка A.
SEQ ID NO: 4. Аминокислотная последовательность гексагистидинового домена
SEQ ID NO: 5. Нуклеотидная последовательность синтетической вставки
SEQ ID NO:6. Аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания энтеропептидазы
SEQ ID NO: 7. Оптимизированная аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания энтеропептидазы
SEQ ID NO: 8. Аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания Сортазы А
SEQ ID NO: 9. Аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания TEV-протеиназы
SEQ ID NO: 10. Нуклеотидная последовательность 1 варианта белка
SEQ ID NO: 11. Нуклеотидная последовательность 2 варианта белка
SEQ ID NO: 12. Нуклеотидная последовательность 3 варианта белка
SEQ ID NO: 13. Нуклеотидная последовательность 4 варианта белка
SEQ ID NO: 14. Нуклеотидная последовательность 5 варианта белка
SEQ ID NO: 15. Нуклеотидная последовательность 6 варианта белка
SEQ ID NO: 16. Нуклеотидная последовательность 7 варианта белка
SEQ ID NO: 17. Нуклеотидная последовательность 8 варианта белка
SEQ ID NO: 18. Нуклеотидная последовательность 9 варианта белка
SEQ ID NO: 19. Нуклеотидная последовательность 10 варианта белка
SEQ ID NO: 20. Нуклеотидная последовательность 11 варианта белка
SEQ ID NO: 21. Нуклеотидная последовательность 12 варианта белка
SEQ ID NO: 22. Нуклеотидная последовательность 13 варианта белка
SEQ ID NO: 23. Нуклеотидная последовательность 14 варианта белка
SEQ ID NO: 24. Нуклеотидная последовательность 15 варианта белка
SEQ ID NO: 25. Нуклеотидная последовательность 16 варианта белка
SEQ ID NO: 26. Нуклеотидная последовательность 17 варианта белка
SEQ ID NO: 27. Нуклеотидная последовательность 18 варианта белка
SEQ ID NO: 28. Нуклеотидная последовательность 19 варианта белка
SEQ ID NO: 29. Нуклеотидная последовательность 20 варианта белка
SEQ ID NO: 30. Нуклеотидная последовательность 21 варианта белка
SEQ ID NO: 31. Нуклеотидная последовательность 22 варианта белка
SEQ ID NO: 32. Нуклеотидная последовательность 23 варианта белка
SEQ ID NO: 33. Нуклеотидная последовательность 24 варианта белка
SEQ ID NO: 34. Нуклеотидная последовательность 25 варианта белка
SEQ ID NO: 35. Нуклеотидная последовательность 26 варианта белка
SEQ ID NO: 36. Нуклеотидная последовательность 27 варианта белка
SEQ ID NO: 37. Нуклеотидная последовательность 28 варианта белка
SEQ ID NO: 38. Нуклеотидная последовательность 29 варианта белка
SEQ ID NO: 39. Нуклеотидная последовательность 30 варианта белка
SEQ ID NO: 40. Нуклеотидная последовательность 31 варианта белка
SEQ ID NO: 41. Нуклеотидная последовательность 32 варианта белка
SEQ ID NO: 42. Нуклеотидная последовательность 33 варианта белка
SEQ ID NO: 43. Нуклеотидная последовательность 34 варианта белка
SEQ ID NO: 44. Нуклеотидная последовательность 35 варианта белка
SEQ ID NO: 45. Нуклеотидная последовательность 36 варианта белка
SEQ ID NO: 46. Нуклеотидная последовательность 37 варианта белка
SEQ ID NO: 47 Нуклеотидная последовательность 38 варианта белка
SEQ ID NO: 48. Нуклеотидная последовательность 39 варианта белка
SEQ ID NO: 49. Нуклеотидная последовательность 40 варианта белка
SEQ ID NO: 50. Нуклеотидная последовательность 41 варианта белка
SEQ ID NO: 51. Нуклеотидная последовательность 42 варианта белка
SEQ ID NO: 52. Нуклеотидная последовательность 43 варианта белка
SEQ ID NO: 53. Нуклеотидная последовательность 44 варианта белка
SEQ ID NO: 54. Нуклеотидная последовательность 45 варианта белка
SEQ ID NO: 55. Нуклеотидная последовательность 46 варианта белка
SEQ ID NO: 56. Нуклеотидная последовательность 47 варианта белка
SEQ ID NO: 57. Нуклеотидная последовательность 48 варианта белка
SEQ ID NO: 58. Нуклеотидная последовательность 49 варианта белка
SEQ ID NO: 59. Нуклеотидная последовательность 50 варианта белка
SEQ ID NO: 60. Нуклеотидная последовательность 51 варианта белка
SEQ ID NO: 61. Нуклеотидная последовательность 52 варианта белка
SEQ ID NO: 62. Нуклеотидная последовательность 53 варианта белка
SEQ ID NO: 63. Нуклеотидная последовательность 54 варианта белка
SEQ ID NO: 64. Нуклеотидная последовательность 55 варианта белка
SEQ ID NO: 65. Нуклеотидная последовательность 56 варианта белка
Краткое описание чертежей
Фигура 1. Карта плазмиды; обозначения:
f1 ori - ориджин репликации бактериофага f1,
AmpR - ген резистентности к ампициллину (ген бета-лактамазы),
ori — ориджин репликации colE1,
T7 promoter - промотор бактериофага T7,
BDPA-1 - ген гибридного белка BDPA-1.
T7 terminator - терминатор бактериофага T7.
RBS – сайт связывания рибосомы.
Фигура 2. Электрофоретические анализы тотального клеточного лизата. Электрофореграммы. 12%-SDS-ПААГ.
(А) 1 — 25 вариант гибридного белка до индукции
2 — 26 вариант гибридного белка до индукции
3 — 25 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
4 — 26 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
5 — 24 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
6 — 23 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
7 — 22 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
8 — 15 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
9 — Стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610
(Б) 1 — 17 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
2 — 18 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
3 — 19 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
4 — 20 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
5 — 21 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
6 — 27 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
7 — 28 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
8 — 29 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
9 — 30 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
10 — Стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610
(В) 1 — 11 вариант гибридного белка до индукции
2 — 10 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
3 — 11 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
4 — 12 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
5 — 13 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
6 — Стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610
7 — 14 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
8 — 3 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
9 — 4 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
(Г) 1 — 6 вариант гибридного белка до индукции
2 — 9 вариант гибридного белка до индукции
3 — 6 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
4 — 7 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
5 — 8 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
6 — 5 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
7 — 9 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
8 — Стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610
(Д) 1 — 31 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
2 — 32 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
3 — 33 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
4 — 34 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
5 — 35 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
6 — 1 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
7 — 2 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
8 — Стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610
(Е) 1 — 16 вариант гибридного белка до индукции
2 — 36 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
3 — 37 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
4 — 43 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
5 — 16 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
6 — Стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610
(Ж) 1 — 56 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
2 — 55 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
3 — 54 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
4 — 53 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
5 — 52 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
6 — 45 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
7 — 46 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
8 — 38 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
9 — 39 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
10 — Стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610
(З) 1 — 40 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
2 — 41 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
3 — 42 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
4 — 47 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
5 — 48 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
6 — 49 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
7 — 50 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
8 — 51 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
9 — 44 вариант гибридного белка, 4ч после индукции
10 — Стандарты молекулярных масс, Pierce Unstained Protein MW Marker, Thermo, cat # 26610
Фигура 3. Анализ чистоты белка BDPA-1. Электрофореграмма. 15 %-SDS-ПААГ.
1 — Проба раствора целевого белка
2 — Маркер молекулярных масс (14.4, 18.4, 25, 35, 65, и 110 кДа)
Фигура 4. Анализ ёмкости сорбента в зависимости от времени контакта для химического способа получения. (А)—(Е) — различные варианты гибридного белка BDPA-1 в соответствии с Табл. 3.
Фигура 5. Анализ ёмкости сорбента в зависимости от времени контакта для ферментативного способа получения. (А)—(В) — различные варианты гибридного белка BDPA-1 в соответствии с Табл. 3.
Фигура 6. Изменение ёмкости сорбента в зависимости от количества циклов регенерации. Время контакта 3 минуты. (А)—(Е) — различные варианты гибридного белка BDPA-1 в соответствии с Табл. 3.
Название проекта: protein A
Статус: modified
Дата создания: 2021-10-14
Общая информация
Текущая заявка
Номер заявки: before
Название изобретения
| Язык | Имя изобретателя |
| ru | РЕКОМБИНАНТНЫЙ АНАЛОГ ДОМЕНА Б БЕЛКА А BDPA-1, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА BDPA-1, ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ ESCHERICHIA COLI, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ БЕЛОК BDPA-1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКА BDPA-1 И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АФФИННОГО СОРБЕНТА, СОДЕРЖАЩЕГО BDPA-1 ИЛИ ЕГО ФРАГМЕНТ В КАЧЕСТВЕ ЛИГАНДА |
Заявитель и изобретатель:
Имя заявителя: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук (ИБХ РАН)
Язык: ru
Название или имя и фамилия латиницей: Federal State Budgetary Institution of Science Institute of Bioorganic Chemistry named after Academicians M.M. Shemyakina and Yu.A. Ovchinnikov Russian Academy of Sciences (IBCh RAS)
Адрес места жительства: Российская Федерация , 117997 , Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 16/10
Адрес для переписки: Российская Федерация , 117997 , г. Москва, ГСП-7, В-437, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10, ИБХ РАН, патентный отдел
Последовательности
SEQ ID NO 1: "Аминокислотная последовательность гибридного белка BDPA-1"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 140 | AA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| SOURCE | 1..140 | MOL_TYPE = protein ORGANISM = |
| VARIANT | 2 | NOTE = X can be any amino acid |
| VARIANT | 3 | NOTE = X can be N or K |
| VARIANT | 5 | NOTE = X can be H or Q |
Последовательность
MXXYXVDAKF DKEQQNAFYE ILHLPNLTEE QRNAFIQSLK DDPSQSANLL AEAKKLNDAQ 60
APKVDAKFDK EQQNAFYEIL HLPNLTEEQR NAFIQSLKDD PSQSANLLAE AKKLNDAQAP 120
KAQAXXXXXX EAHHHHHHGC 140
SEQ ID NO 2: "Аминокислотная последовательность стартовой части"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 5 | AA | Нет | Да |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| SOURCE | 1..5 | MOL_TYPE = protein ORGANISM = |
Последовательность
MXXYX 5
SEQ ID NO 3: "Аминокислотная последовательность домена B белка A"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 58 | AA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| SOURCE | 1..58 | MOL_TYPE = protein ORGANISM = |
Последовательность
VDAKFDKEQQ NAFYEILHLP NLTEEQRNAF IQSLKDDPSQ SANLLAEAKK LNDAQAPK 58
SEQ ID NO 4: "Аминокислотная последовательность гексагистидинового домена"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 6 | AA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| SOURCE | 1..6 | MOL_TYPE = protein ORGANISM = |
Последовательность
HHHHHH 6
SEQ ID NO 5: "Нуклеотидная последовательность гибридного белка BDPA-1"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 417 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..417 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgnnnnnnt atnnngtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctnnnnnnnn nnnnnnngaa gcacatcatc accaccatca tggctgc 417
SEQ ID NO 6: "Аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания энтеропептидазы"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 5 | AA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| SOURCE | 1..5 | MOL_TYPE = protein ORGANISM = |
Последовательность
DDDDK 5
SEQ ID NO 7: "Оптимизированная аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания энтеропептидазы"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 5 | AA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| SOURCE | 1..5 | MOL_TYPE = protein ORGANISM = |
Последовательность
DDDDR 5
SEQ ID NO 8: "Аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания Сортазы А"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 5 | AA | Нет | Да |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| SOURCE | 1..5 | MOL_TYPE = protein ORGANISM = |
Последовательность
LPXTG 5
SEQ ID NO 9: "Аминокислотная последовательность специфического сайта узнавания TEV- протеиназы"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 6 | AA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| SOURCE | 1..6 | MOL_TYPE = protein ORGANISM = |
Последовательность
EXLYFQ 6
SEQ ID NO 10: "Нуклеотидная последовательность 1 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgatagagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 11: "Нуклеотидная последовательность 2 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgataaagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 12: "Нуклеотидная последовательность 3 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaagatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 13: "Нуклеотидная последовательность 4 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaaaatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 14: "Нуклеотидная последовательность 5 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgga aactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 15: "Нуклеотидная последовательность 6 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgaa tactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 16: "Нуклеотидная последовательность 7 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccggc gactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 17: "Нуклеотидная последовательность 8 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgatagagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 18: "Нуклеотидная последовательность 9 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgataaagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 19: "Нуклеотидная последовательность 10 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaagatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 20: "Нуклеотидная последовательность 11 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = |
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| organism = |
Последовательность
atggtgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaaaatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 21: "Нуклеотидная последовательность 12 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgga aactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 22: "Нуклеотидная последовательность 13 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgaa tactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 23: "Нуклеотидная последовательность 14 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggtgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccggc gactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 24: "Нуклеотидная последовательность 15 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgatagagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 25: "Нуклеотидная последовательность 16 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgataaagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 26: "Нуклеотидная последовательность 17 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaagatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 27: "Нуклеотидная последовательность 18 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaaaatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 28: "Нуклеотидная последовательность 19 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgga aactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 29: "Нуклеотидная последовательность 20 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgaa tactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 30: "Нуклеотидная последовательность 21 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccggc gactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 31: "Нуклеотидная последовательность 22 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgatagagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 32: "Нуклеотидная последовательность 23 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgataaagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 33: "Нуклеотидная последовательность 24 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaagatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 34: "Нуклеотидная последовательность 25 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaaaatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 35: "Нуклеотидная последовательность 26 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgga aactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 36: "Нуклеотидная последовательность 27 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgaa tactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 37: "Нуклеотидная последовательность 28 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atggcgaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccggc gactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 38: "Нуклеотидная последовательность 29 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgatagagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 39: "Нуклеотидная последовательность 30 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgataaagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 40: "Нуклеотидная последовательность 31 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaagatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 41: "Нуклеотидная последовательность 32 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaaaatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 42: "Нуклеотидная последовательность 33 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgga aactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 43: "Нуклеотидная последовательность 34 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgaa tactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 44: "Нуклеотидная последовательность 35 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccggc gactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 45: "Нуклеотидная последовательность 36 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgatagagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 46: "Нуклеотидная последовательность 37 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgataaagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 47: "Нуклеотидная последовательность 38 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaagatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 48: "Нуклеотидная последовательность 39 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = |
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| organism = |
Последовательность
atgaaaaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaaaatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 49: "Нуклеотидная последовательность 40 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgga aactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 50: "Нуклеотидная последовательность 41 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgaa tactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 51: "Нуклеотидная последовательность 42 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaaaaatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccggc gactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 52: "Нуклеотидная последовательность 43 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgatagagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 53: "Нуклеотидная последовательность 44 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgataaagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 54: "Нуклеотидная последовательность 45 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaagatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 55: "Нуклеотидная последовательность 46 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaaaatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 56: "Нуклеотидная последовательность 47 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgga aactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 57: "Нуклеотидная последовательность 48 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgaa tactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 58: "Нуклеотидная последовательность 49 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataaat atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccggc gactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 59: "Нуклеотидная последовательность 50 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgatagagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 60: "Нуклеотидная последовательность 51 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgatgatga tgataaagaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 61: "Нуклеотидная последовательность 52 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaagatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 62: "Нуклеотидная последовательность 53 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 423 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..423 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctgaaaatct gtattttcag gaagcacatc atcaccacca tcatggctgc 420
taa 423
SEQ ID NO 63: "Нуклеотидная последовательность 54 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgga aactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 64: "Нуклеотидная последовательность 55 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccgaa tactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
SEQ ID NO 65: "Нуклеотидная последовательность 56 варианта белка"
| Длина | Тип молекулы | Организм | Содержит фрагменты ДНК и РНК | Пропущенная последова тельность |
| 420 | DNA | Нет | Нет |
Характеристики
| Ключ характерист ики | Местополож ение характерист ики | Квалификаторы |
| source | 1..420 | mol_type = organism = |
Последовательность
atgaataatt atcatgtgga tgcgaagttt gataaagaac aacagaatgc gttctatgag 60
attcttcact taccgaacct gactgaagag caacgcaatg cgttcattca gagtctgaaa 120
gatgatccga gccagtctgc gaacctgttg gctgaagcga agaaactgaa cgatgcacaa 180
gcaccgaaag tggatgcgaa gtttgataaa gaacaacaga atgcgttcta tgagattctt 240
cacttaccga acctgactga agagcaacgc aatgcgttca ttcagagtct gaaagatgat 300
ccgagccagt ctgcgaacct gttggctgaa gcgaagaaac tgaacgatgc acaagcaccg 360
aaagcacaag ctctgccggc gactggtgaa gcacatcatc accaccatca tggctgctaa 420
1. Гибридный белок BDPA-1, имеющий последовательность SEQ ID NO: 1, представляющий собой рекомбинантный аналог домена Б белка А золотистого стафилококка (SpA) и обладающий сорбционной активностью по отношению к иммуноглобулинам, содержащий:
- аминокислотный остаток МX1X2YX3 с последовательностью SEQ ID NO: 2,
- две копии последовательности модифицированного домена Б белка А с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 3,
- гибкий линкер,
- сайт расщепления X4X5X6X7X8X9,
- гексагистидиновый домен (HS) с последовательностью SEQ ID NO: 4,
- С-концевой цистеин,
где X1 - представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из V, A, K;
X2 - представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из K, N;
X3 - представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из H, Q;
X4 - представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, L, E;
X5 - представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, P;
X6 - представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, E, L;
X7 - представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из D, T, Y;
X8 - представляет собой аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из R, K, G, F;
X9 - может отсутствовать или представляет собой аминокислотный остаток Q.
2. Белок по п. 1, отличающийся тем, что МX1X2YX3 - представляет собой MVKYH, или MVNYH, или MAKYH, или MANYH, или MKNYH, или MKKYH, или MKNYQ, или MVKYQ, или MVNYQ, или MKNYQ, или MAKYQ, или MANYQ.
3. Белок по пп. 1, 2, отличающийся тем, что сайт расщепления X4X5X6X7X8X9 - представляет собой DDDDR, или DDDDK, или LPETG, или EDLYFQ, имеющие соответственно последовательности SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9.
4. Фрагмент гибридного белка BDPA-1 по пп. 1-3, содержащий SEQ ID NO: 3 и любую из последовательностей SEQ ID NO: 6-9, связанные между собой гибким линкером, состоящим из трёх аминокислотных остатков, и обладающий сорбционной активностью по отношению к иммуноглобулинам.
5. Нуклеиновая кислота, кодирующая белок BDPA-1 по пп. 1-3.
6. Рекомбинантная плазмидная ДНК, кодирующая белок BDPA-1 по пп. 1-3, состоящая из следующих ключевых генетических элементов:
- промотора T7 и оператора lacO;
- синтетической нуклеотидной последовательности по п. 5, кодирующей гибридный белок BDPA-1 по п. 1;
- ген β-лактамазы в качестве генетического маркера, детерминирующего устойчивость трансформированных рекомбинантной плазмидной ДНК клеток Е.coli к пенициллиновым антибиотикам;
- ориджина репликации бактериофага f1 (f1 ori);
- ДНК фрагмент, кодирующий последовательность лактозного репрессора LacI;
- ori - ориджин репликации colE1;
- T7 terminator - терминатор бактериофага T7;
- RBS - сайт связывания рибосомы.
7. Клетка, несущая нуклеиновую кислоту по п. 5 или рекомбинантную плазмидную ДНК по п. 6, обеспечивающая продукцию гибридного белка BDPA-1 по пп. 1-3.
8. Способ выделения гибридного белка BDPA-1 по пп. 1-3, включающий в себя следующие стадии:
a) культивирования штамма-продуцента с получением биомассы клеток штамма-продуцента, продуцирующего гибридный белок BDPA-1 по пп. 1-3;
b) выделения гибридного белка BDPA-1 из биомассы клеток штамма-продуцента, полученных на стадии а);
c) очистки гибридного белка BDPA-1.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что на стадии c) очистку гибридного белка BDPA-1 осуществляют с использованием одной стадии хроматографии.
10. Способ по п. 8, отличающийся тем, что на стадии c) очистку гибридного белка BDPA-1 осуществляют с использованием нескольких стадий хроматографии.
11. Способ по п. 9, отличающийся тем, что на стадии c) очистку гибридного белка BDPA-1 осуществляют хроматографически на металл-хелатном сорбенте.
12. Способ по п. 8, отличающийся тем, что на стадии c) очистку гибридного белка BDPA-1 осуществляют хроматографически на анионообменном сорбенте.
13. Конъюгат сорбент-белок, представляющий собой твёрдую матрицу, к которой присоединён гибридный белок по пп. 1-3 или его фрагмент по п. 4, предназначенный для очистки иммуноглобулинов.
14. Конъюгат по п. 13, отличающийся тем, что твёрдая матрица состоит из кросс-сшитой агарозы.
15. Конъюгат по п. 13, отличающийся тем, что твёрдая матрица состоит из амино-активированного полимера акриловой кислоты или её производных.
16. Способ получения сорбента по пп. 13-15, где гибридный белок по пп. 1-3 или его фрагмент по п. 4 присоединяют к твёрдой матрице химическими или ферментативными методами.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что фрагмент гибридного белка по п. 4, содержащий SEQ ID NO: 3, гибкий линкер и SEQ ID NO: 8, присоединяют к твёрдой матрице с использованием сортазы А.
