Способы доставки нейропротективного полипептида в центральную нервную систему

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к составам с контролируемым высвобождением нейропротективного полипептида, и может быть использовано в медицине для лечения или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с центральной нервной системой (ЦНС), где заболевание, связанное с ЦНС, выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции или их комбинации. Предложенный способ лечения включает использование состава с контролируемым высвобождением, который содержит микросферу, включающую ядро с нейропротективным полипептидом, выбранным из GLP-1, эксендина-4 или их терапевтически эффективных аналогов, и биоразлагаемым полимером, а также слой покрытия, состоящий из основных аминокислот, полипептидов и органических азотсодержащих соединений, который покрывает ядро. Изобретение позволяет улучшить доставку через гематоэнцефалический барьер нейропротективного полипептида, контролируя его высвобождение из микросфер и снижая первоначальный выброс. 15 з.п. ф-лы, 15 ил., 2 табл., 15 пр.

 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Эта заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент США с № 62/410748, поданной 20 октября 2016 года, содержание которой полностью включено сюда посредством ссылки.

ПРАВИТЕЛЬСТВЕННОЕ ФИНАНСИРОВАНИЕ

Исследования в поддержку этой заявки были проведены Соединенными Штатами Америки в лице секретаря Министерства здравоохранения и социальных служб. Правительство имеет определенные права на это изобретение.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

В соответствии с 1.52(e)(5) 37 C.F.R., информация о последовательности, содержащаяся в электронном файле с именем: 1568390_100WO2_Sequence_Listing_ST25.txt; размером 24,4 Кбайт; созданном 3 сентября 2017 года с использованием Patent-In 3.5, и Checker 4.4.0, полностью включена сюда посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим терапевтический полипептид с нейропротективным действием (нейропротективный полипептид, полипептид-нейропротектор), такой как, например, глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), эксендин-4 и/или их пептидные аналоги. В частности, настоящее изобретение относится к способам поддержания в плазме стационарного уровня нейропротективного терапевтического полипептида для облегчения доставки в головной мозг через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) для лечения нейродегенеративного состояния.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Глюкагоноподобный пептид-1 (GLP-1), гормон, обычно секретируемый нейроэндокринными клетками кишечника в ответ на пищу, был предложен в качестве нового средства лечения диабета 2 типа (Gutniak et al., 1992; Nauck et al., 1993). Он увеличивает выброс инсулина бета-клетками даже у субъектов с длительно текущим диабетом 2 типа (Nauck et al., 1993). Лечение GLP-1 имеет преимущество перед инсулинотерапией, поскольку GLP-1 стимулирует эндогенную секрецию инсулина, которая выключается при снижении уровня глюкозы в крови (Nauck et al., 1993; Elahi et al., 1994). GLP-1 способствует эугликемии путем увеличения выброса и синтеза инсулина, ингибирования выброса глюкагона и уменьшения опорожнения желудка (Nauck et al., 1993; Elahi et al., 1994; Wills et al., 1996; Nathan et al., 1992; De Ore et al., 1997). GLP-1 является продуктом посттрансляционной модификации проглюкагона. Последовательности GLP-1 и его активных фрагментов амида GLP-1 (7-37) и GLP-1 (7-36) известны в данной области техники (Fehmann et al., 1995). Хотя GLP-1 был предложен в качестве терапевтического средства при лечении диабета, он имеет короткий период полувыведения из организма (De Ore et al., 1997), даже когда он вводится болюсно подкожно (Ritzel et al., 1995). Расщепление GLP-1 (и амида GLP-1 (7-36)), частично, происходит из-за фермента дипептидилпептидазы (DPP 1V), который расщепляет полипептид между аминокислотами 8 и 9 (аланином и глутаминовой кислотой).

Эксендин-4 представляет собой полипептид, продуцируемый в слюнных железах ящерицы Гила-монстра (Goke et al., 1993). Аминокислотная последовательность для эксендина-4 известна в данной области техники (Fehmann et al. 1995). Хотя он является продуктом уникального гена не млекопитающего и, по-видимому, экспрессируется только в слюнной железе (Chen and Drucker, 1997), эксендин-4 гомологичен по аминокислотной последовательности на 52% GLP-1, и у млекопитающих он взаимодействует с рецептором для GLP-1 (Goke et al., 1993; Thorens et al., 1993). In vitro было показано, что эксендин-4 стимулирует секрецию инсулина продуцирующими инсулин клетками, и, при введении в эквимолярных количествах, является более сильным, чем GLP-1, в плане вывоза выброса инсулина из продуцирующих инсулин клеток. Кроме того, эксендин-4 мощно стимулирует выброс инсулина для снижения уровней глюкозы в плазме как у грызунов, так и у людей и действует дольше, чем GLP-1. Однако, поскольку эксендин-4 не встречается в природе у млекопитающих, он обладает некоторыми потенциальными антигенными свойствами у млекопитающих, у которых отсутствует GLP-1.

В дополнение к снижению продукции инсулина, которое происходит при диабете, диабет обычно сопровождается периферической нейропатией. У двадцати-тридцати процентов всех субъектов, страдающих диабетом, в конечном итоге развивается периферическая нейропатия. Кроме того, имеются сообщения о повышенном риске развития болезни Альцгеймера с заболеванием сердечнососудистой системы, инсультом, гипертонией и диабетом (Moceri et al., 2000; Ott et al., 1999). Таким образом, диабет является заболеванием, которое также сопровождается нейродегенеративными заболеваниями.

Рецептор для GLP-1 присутствует в головном мозге как грызунов (Jin et al. 1988, Shughrue et al. 1996, Jia et al. 2015), так и человека (Wei and Mojsov 1995, Satoh et al. 2000). Хемоархитектура распределения, по-видимому, в значительной степени ограничивается гипоталамусом, таламусом, стволом головного мозга, латеральной перегородкой, субфорникальным органом и самым задним полем, всеми околожелудочковыми областями, где обычно находится большое количество рецепторов для пептидов. Однако сайты специфического связывания для GLP-1 были также обнаружены по всему дорсолатеральному отделу полосатого тела, коре головного мозга и мозжечку (Campos et al. 1994, Calvo et al. 1995 и Goke et al. 1995), хотя и в более низких плотностях. Например, Lu и др. (2014) продемонстрировали, что рецептор GLP-1 экспрессируется в миндалине, мозжечке, лобной коре, гиппокампе, гипоталамусе, среднем мозге, мозговом веществе, мостах, полосатом теле, таламусе и височной коре Mustela putorius furo (хорьков). Уровень экспрессии рецептора GLP-1 в головном мозге не зависит от старения.

Кроме того, было установлено, что GLP-1 имеет отношение к познанию и поведению (During et al. 2003). На самом деле, в ряде исследований агонисты рецептора GLP-1 были предложены в качестве нового средства лечения нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, болезнь Хантингтона, черепно-мозговые травмы, инсульт и периферическую нейропатию. Однако доставка лекарственных средств в центральную нервную систему (ЦНС) через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) является существенным препятствием для лечения заболеваний, связанных с ЦНС. Например, GLP-1 имеет короткий период полужизни, равный 1-2 минутам, а слитый белок GLP-1-трансферрин (GLP-1-Tf), который был получен для противодействия инактивации и, таким образом, для увеличения периода полужизни GLP-1 до приблизительно 2 дней, неспособен пересечь BBB (Kim et al. 2010 и Martin et al. 2012).

Кроме того, хотя было установлено, что эксендин-4 улучшает выполнение теста вращающегося стержня по сравнению с GLP-1-Tf (Martin et al. 2012) и, как известно, проникает в головной мозг из крови, скорость проникновения ограничена (Kastin AJ and Akeerstrom V, International Journal of Obesity (2003) 27, 313-318). Кроме того, было установлено, что эксенатид неэффективен в обеспечении нейропротекции в модели на мыши для болезни Паркинсона в результате воздействия MPTP, когда он предоставляется после воздействий, ежедневно в течение семи дней (Liu et al. 2015).

Таким образом, в данной области техники существует потребность в способе лечения нейродегенеративных состояний, а также в способе поддержания стационарного уровня в плазме нейропротективного агониста рецептора GLP-1, тем самым облегчая и стимулируя доставку лекарственного средства в центральную нервную систему через BBB.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, при этом нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или замедленное высвобождение нейропротективного полипептида усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, причем нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или устройство усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением в системный кровоток субъекта. В одном варианте осуществления нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина (например, аналога эксендина-4), причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина (такого как эксендин-4) или их комбинации, и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.

В некоторых вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением представляет собой состав нейропротективного полипептида длительного действия.

В других вариантах осуществления состав длительного действия включает депо-состав для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.

В конкретных вариантах осуществления состав длительного действия включает композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.

В дополнительных вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени.

В конкретных вариантах осуществления нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает: микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро.

В одном варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.

В дальнейших вариантах осуществления связанное с ЦНС состояние выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии (CTE), заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.

В некотором варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением.

В дополнительных вариантах осуществления инъекция нейропротективного состава с контролируемым высвобождением представляет собой подкожную инъекцию. Например, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением может включать подкожную инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением.

В другом варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.

В других вариантах осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в спинномозговой жидкости (CSF), головном мозге или их комбинации у субъекта.

В конкретных вариантах осуществления концентрация нейропротективного полипептида в CSF находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 400 пг/мл (например, от приблизительно 10 до приблизительно 400 пг/мл).

В дополнительном аспекте предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с ЦНС, или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества нейропротективного состава с контролируемым высвобождением в системный кровоток субъекта. Нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина (такого как эксендин-4) или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина (такого как эксендин-4); нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или их комбинации; и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через BBB субъекта по меньшей мере в часть ЦНС по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.

В некоторых вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением представляет собой состав нейропротективного полипептида длительного действия.

В других вариантах осуществления состав длительного действия включает депо-состав для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.

В дополнительных вариантах осуществления состав длительного действия включает композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.

В дополнительных вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени.

В конкретных вариантах осуществления нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает: микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро.

В конкретном варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.

В одном варианте осуществления связанное с ЦНС состояние выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.

В дальнейших вариантах осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту.

В некоторых вариантах осуществления инъекция нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту представляет собой подкожную инъекцию.

В дополнительных вариантах осуществления введение состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.

В некоторых вариантах осуществления введение состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.

В дальнейшем аспекте предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.

В еще одном аспекте предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.

В одном варианте осуществления обеспечение нейропротективного полипептида или полипептидов с замедленным высвобождением включает введение полипептида(ов) с помощью устройства (например, насоса, мини-насоса, осмотического насоса, осмотического устройства доставки, инфузионного насоса, устройство для внутривенного введения, перистальтического насоса, миниатюрного инфузионного насоса или т.п.).

В некоторых вариантах осуществления нейропротективный полипептид или полипептиды вводят со скоростью от приблизительно 1 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин (например, от приблизительно 3 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин).

В других вариантах осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением или обеспечение долговременной доставки нейропротективного полипептида ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.

В конкретных вариантах осуществления связанное с ЦНС состояние выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.

В одном варианте осуществления введение состава с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.

В некоторых вариантах осуществления введение состава с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.

В еще одном варианте осуществления концентрация нейропротективного полипептида в CSF находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 400 пг/мл.

В некоторых вариантах осуществления отношение стационарной концентрации полипептида в CFS к таковой в плазме находится в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%.

В дальнейших вариантах осуществления нейропротективный полипептид выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-55. Например, нейропротективный полипептид может включать аминокислотную последовательность, выбираемую из SEQ ID NO:1-55.

В других вариантах осуществления аналог эксендина-4 представлен химической формулой I или его фармацевтически приемлемой солью:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28-Z₁, (Химическая формула I),

где:

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;

Xaa2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;

Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu;

Xaa4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;

Xaa6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;

Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr;

Xaa9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицин или Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;

Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val, или Met;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;

Xaa21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg или С1-С10 алканоил с прямой или разветвленной цепью;

Xaa22 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa23 представляет собой Ile, Val, Leu, пентилглицин, трет-бутилглицин или Met;

Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp;

Xaa25 представляет собой Ala, Trp, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;

Xaa27 представляет собой Ala или Lys;

Xaa28 представляет собой Ala или Asn; и

Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂,

Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, 3Hyp, 4Hyp, тиопролина, N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина или N-алкилаланина, Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser), и

Z₂ представляет собой -OH или -NH₂,

при условии, что:

не более трех из Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 и Xaa28 представляют собой Ala; и

когда Xaa1 представляет собой His, Arg или Tyr, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 представляет собой Ala.

В других вариантах осуществления аналог эксендина-4 представлен химической формулой II или его фармацевтически приемлемой солью:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 X₁-Z₁, (Химическая формула II)

где:

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;

Xaa2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;

Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu;

Xaa4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;

Xaa6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;

Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr;

Xaa9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицин или Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;

Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val, или Met;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;

Xaa21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NHε-R (где R представляет собой Lys, Arg, C1-C10 алканоил с прямой или разветвленной цепью или циклоаллеил-алканоил);

Xaa22 представляет собой Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa23 представляет собой Ile, Val, Leu, пентилглицин, трет-бутилглицин или Met;

Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp;

Xaa25 представляет собой Ala, Trp, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;

X₁ представляет собой Lys Asn, Asn Lys, Lys-NHε-R Asn, Asn Lys-NHε-R, Lys-NHε-R Ala, Ala Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg, C1-C10 алканоил с прямой или разветвленной цепью или циклоалкилалканоил;

Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂;

Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, 3Hyp, 4Hyp, тиопролина, N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина или N-алкилаланина, Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser), и

Z₂ представляет собой -OH или -NH₂,

при условии, что:

не более трех из Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25 и Xaa26 представляют собой Ala; и

когда Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr или 4-имидазопропионил, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 представляет собой Ala.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Прилагаемые чертежи, которые включены в это описание и составляют его часть, иллюстрируют (один) несколько вариантов осуществления настоящего изобретения и вместе с описанием служат для объяснения принципов настоящего изобретения.

Фиг. 1А. График, иллюстрирующий зависимые от времени уровни эксенатида (эксендина-4) в плазме в результате однократного подкожного введения 2 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302) взрослым (возрастом 9 недель) самцам крыс Sprague-Dawley.

Фиг. 1B. График, иллюстрирующий зависимые от времени уровни эксенатида (эксендина-4) в плазме в результате однократного подкожного введения 2,4 мг/кг, 4,8 мг/кг или 9,6 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302) взрослым (возрастом 9 недель) самцам крыс Sprague-Dawley.

Фиг. 2. График, иллюстрирующий зависимые от времени уровни эксендина-4 в плазме в результате однократной подкожной инъекции эксенатида с замедленным высвобождением (PT304) в количестве 4,0 мг/кг взрослым (возрастом 9 недель) самцам крыс Sprague-Dawley.

Фиг. 3. График, иллюстрирующий зависимые от времени уровни эксендина-4 в плазме в течение 10-недельного периода у самцов крыс Sprague-Dawley, которым вводили либо PT302, либо PT304 в указанных количествах и периоды времени.

Фиг. 4А. Схема плана исследования из примера 2, в котором крысам Sprague-Dawley вводили PT302 перед односторонним поражением с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга.

Фиг. 4B. График, иллюстрирующий метамфетамин-индуцированное (мет-индуцированное) вращательное поведение крыс с поражением с помощью 6-OHDA, предварительно подвергнутых лечению PT302.

Фиг. 4C. График, иллюстрирующий уровни в плазме эксендина-4 у крыс с поражением с помощью 6-OHDA, которые были предварительно подвергнутых лечению PT302.

Фиг. 5А. Схема плана исследования из примера 3, в котором крысам Sprague-Dawley вводили PT302 после одностороннего поражения, вызванного 6-OHDA, медиального пучка переднего мозга.

Фиг. 5B. График, иллюстрирующий метамфетамин-индуцированное вращательное поведение крыс с поражением с помощью 6-OHDA, которые получают последующее лечение PT302.

Фиг. 5С. Репрезентативные микроскопические изображения иммуногистохимического анализа тирозингидроксилазы (ТН) в полосатом теле, сделанные у крыс с односторонним поражением с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга, получающих носитель (контроль; крысы #866, #883 и #886) и PT302 (крысы #881, #875, #882). Концентрации эксендина-4 в плазме (нг/мл) отмечены для каждого животного.

Фиг. 5D. График, иллюстрирующий ТН-иммунореактивность с количественным анализом, наблюдаемую при иммуногистохимическом анализе, описанном и связанным с фиг. 5C.

Фиг. 5Е. Репрезентативные микроскопические изображения иммуногистохимического анализа ТН в черной субстанции, сделанные у крыс с односторонним поражением с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга, получавших носитель (контроль; крысы #866, #883 и #886) и PT302 (крысы #881, #875, #882). Концентрации эксендина-4 в плазме (нг/мл) отмечены для каждого животного.

Фиг. 5F. График, иллюстрирующий ТН-иммунореактивность с количественным анализом, наблюдаемую при иммуногистохимическом анализе, описанном и связанным с фиг. 5E.

Фиг. 5G и 5H. Репрезентативные микроскопические изображения ТН+ нейронов, наблюдаемых на непораженной стороне головного мозга крысы.

Фиг. 5I. Репрезентативное микроскопическое изображение отсутствия ТН+ нейронов, присутствующих в черной субстанции на пораженной стороне головного мозга крысы с односторонним поражением с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга.

Фиг. 5J, 5K и 5L. Репрезентативные изображения головного мозга подвергнутых лечению PT302 крыс с вызванным 6-OHDA поражением.

Фиг. 5M. График, иллюстрирующий значимую корреляцию, наблюдаемую между приведенной TH-иммунореактивностью и уровнями эксендина-4 в плазме в полосатом теле.

Фиг. 5N. График, иллюстрирующий значимую корреляцию, наблюдаемую между уровнями эксендина-4 в плазме и TH-иммунореактивностью в черной субстанции.

Фиг. 6А. Схема плана исследования из примера 4.

Фиг. 6B. Лечение эксендином-4 и PT302 уменьшает вращение у крыс с односторонним поражением 6-OHDA медиального пучка переднего мозга.

Фиг. 6C. Репрезентативные микроскопические изображения черной субстанции у крыс - ложных контролей, у крыс с вызванным 6-OHDA поражением, у подвергнутых лечению эксендином-4 крыс с вызванным 6-OHDA поражением и у подвергнутых лечению PT302 крыс с вызванным 6-OHDA поражением.

Фиг. 6D. График, иллюстрирующий количественные данные на фиг. 6C.

Фиг. 7А. Схема плана исследования из примера 5.

Фиг. 7B. PT302 значительно снижал вращательное поведение у крыс с вызванным 6-OHDA односторонним поражением, в то время как эксендин-4 не уменьшал вращательное поведение у крыс с вызванным 6-OHDA односторонним поражением.

Фиг. 8А. Схема плана исследования из примера 6.

Фиг 8B. График, иллюстрирующий, что PT302 значительно увеличивает время до падения с проволоки у мышей, получавших MPTP, в то время как эксендин-4 не увеличивает время до падения с проволоки.

Фиг. 9А. Схема плана исследования из примера 8.

Фиг. 9B. График, иллюстрирующий, что эксенатид с замедленным высвобождением значительно увеличивал распознавание новых объектов у мышей с легкими черепно-мозговыми травмами (mTBI).

Фиг. 10А. График, иллюстрирующий, что уровни эксендина-4 в плазме поддерживаются в течение семи дней после введения PT302 и, кроме того, зависят от дозы.

Фиг. 10B. График, иллюстрирующий, что значимая разница в уровнях эксендина-4 в плазме, обусловленная введением PT302, не наблюдалась между нормальными/контрольными мышами и мышами с нанесенной mTBI.

Фиг. 10C. График, иллюстрирующий, что три разные дозы эксенатида с замедленным высвобождением (PT302: 0,024, 0,12 и 0,6 мг/кг) были способны накапливаться и поддерживаться в зависимости от времени в плазме.

Фиг. 11А. График, иллюстрирующий, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302: 0,024, 0,12 и 0,6 мг/кг) приводил к высокому предпочтению новых объектов у мышей с нанесенной mTBI по сравнению с не подвергнутыми лечению мышами с нанесенной mTBI, которые страдали от дефицита зрительной памяти и проводили меньше времени возле новых объектов; как оценено через 7 дней после нанесения mTBI с помощью парадигмы распознавания новых объектов.

Фиг. 11B. График, иллюстрирующий, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302: 0,024, 0,12 и 0,6 мг/кг) уменьшал дефицит пространственной памяти у мышей с нанесенной mTBI, наблюдаемый у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI; по оценкам с помощью Y-лабиринта через 7 дней после нанесения mTBI.

Фиг. 11C. График, иллюстрирующий, что результаты, представленные на фиг. 11А и 11В, не были результатом поведения, подобного тревоге.

Фиг. 12А. График, иллюстрирующий, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302: 0,12 и 0,6 мг/кг) приводит к высокому предпочтению новых объектов у мышей с нанесенной mTBI по сравнению с не подвергнутыми лечению мышами с вызовом mTBI, которые страдали от дефицита зрительной памяти и проводили меньше времени возле новых объектов; как оценено через 30 дней после нанесения mTBI с помощью парадигмы распознавания новых объектов.

Фиг. 12B. График, иллюстрирующий, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302: 0,12 и 0,6 мг/кг) уменьшал дефицит пространственной памяти у мышей с mTBI, наблюдаемый у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI; по оценкам с помощью Y-лабиринта через 30 дней после mTBI.

Фиг. 12C. График, иллюстрирующий, что результаты, представленные на фиг. 12А и 12В, не были результатом поведения, подобного тревоге.

Фиг. 13А. Репрезентативные изображения, иллюстрирующие, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302 0,6 мг/кг) был способен предотвращать снижение нейронов, наблюдаемое в коре головного мозга, CA3 и зубчатой извилине мышей с нанесенной mTBI.

Фиг. 13B. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по коре головного мозга данных, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 13А, которые демонстрируют, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302 0,6 мг/кг) был способен предотвращать снижение нейронов, наблюдаемое в коре головного мозга мышей с нанесенной mTBI.

Фиг. 13C. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по CA3, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 13A, которые демонстрируют, что эксенатид с замедленным высвобождением (PT302 0,6 мг/кг) был способен предотвращать снижение нейронов, наблюдаемое в области CA3 гиппокампа у мышей с нанесенной mTBI.

Фиг. 13D. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по зубчатой извилине, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 13А, которые демонстрируют, что эксенатид с замедленным высвобождением был способен предотвращать снижение нейронов, наблюдаемое в области зубчатой извилины гиппокампа мышей с нанесенной mTBI.

Фиг. 14А. Репрезентативные изображения окрашивания с помощью Fluoro-Jade® C в качестве маркера потери нейронов из-за повреждения головного мозга у контрольных (CTRL) мышей и мышей с нанесенной mTBI, которые получали носитель или эксенатид с замедленным высвобождением в дозе 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг (PT302).

Фиг. 14B. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по области СА1 гиппокампа, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 14А, и сильное увеличение потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы в СА1 у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, которое было значительно снижено при введении 0,6 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).

Фиг. 14C. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по области СА3 гиппокампа, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 14А, и сильное увеличение потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы в СА3 у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, которое было значительно снижено при введении 0,6 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).

Фиг. 14D. График, иллюстрирующий количественную оценку данных области по зубчатой извилине, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 14А, и сильное увеличение потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы в зубчатой извилине у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, которое было значительно снижено при введении 0,6 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).

Фиг. 14E. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по коре головного мозга, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 14А, и сильное увеличение потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы в коре головного мозга у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, которое было значительно снижено при введении 0,6 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).

Фиг. 15А. Репрезентативные изображения окрашивания на связывающую ионизованный кальций адаптерную молекулу 1 (IBA1) в качестве маркера активации микроглии и нейровоспаления вследствие черепно-мозговой травмы у контрольных мышей и мышей с нанесенной mTBI, которые получали носитель или эксенатид с замедленным высвобождением (PT302) в дозе 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг.

Фиг. 15B. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по СА1, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 15А, и того, что провоспалительный цитокин TNF-α был значительно увеличен в IBA1+ клетках в СА1 у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, который значительно уменьшался при введении 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).

Фиг. 15C. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по СА3, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 15А, и того, что провоспалительный цитокин TNF-α был значительно увеличен в IBA1+ клетках в СА3 у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, который значительно уменьшался при введении 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).

Фиг. 15D. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по зубчатой извилине, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 15А, и того, что провоспалительный цитокин TNF-α был значительно увеличен в IBA1+ клетках в зубчатой извилине у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, который значительно уменьшался при введении 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).

Фиг. 15E. График, иллюстрирующий количественную оценку данных по коре головного мозга, связанных с репрезентативными изображениями на фиг. 15А, и того, что провоспалительный цитокин TNF-α был значительно увеличен в IBA1+ клетках в коре головного мозга у не подвергнутых лечению мышей с нанесенной mTBI, который значительно уменьшался при введении 0,6 мг/кг или 0,12 мг/кг эксенатида с замедленным высвобождением (PT302).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на поразительном и неожиданном усилении доставки активных ингредиентов, описанных здесь (например, GLP-1, эксендина и биологически активных аналогов или производных GLP-1 и эксендина). Настоящее изобретение можно легче понять при ссылке на следующее подробное описание предпочтительных вариантов осуществления настоящего описания и включенных в него примеров, а также на чертежи и их предшествующее и последующее описание.

Прежде чем соединения, композиции, изделия, устройства и/или способы настоящего изобретения будут раскрыты и описаны, следует понять, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными способами синтеза, конкретными схемами лечения или конкретными процедурами очистки, поскольку таковые могут, конечно, меняться. Также следует понять, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения.

Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, упомянутые здесь, включены посредством ссылки во всей их полноте, в том числе, например, каждый из патента США с № 8853160, патента США с № 8278272, патента США с № 7557050, патента США с № 9155702, публикации международной заявки на патент WO/2003/011892 и Gu et al. (Clinical Therapeutics. 36 (1): 101-114 (2014)) включен сюда посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей.

Используемые в описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа «а», «an» и «the» включают множественные ссылки, если контекст явно не предписывает иное. Таким образом, например, ссылка на «полипептид» включает смеси полипептидов, ссылка на «фармацевтический носитель» включает смеси двух или более таких носителей и т.п.

Диапазоны могут быть представлены здесь как от «приблизительно» одного конкретного значения и/или до «приблизительно» другого конкретного значения. Когда такой диапазон представлен, другой вариант осуществления включает от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Так же, когда значения представлены в виде приближенных значений, с использованием предшествующего «приблизительно», будет понятно, что конкретное значение образует другой вариант осуществления. Кроме того, будет понятно, что конечные точки каждого из диапазонов являются значимыми как по отношению к другой конечной точке, так и независимо от другой конечной точки. Используемый здесь термин «приблизительно» относится к данному значению ± 10%.

В этом описании и в последующей формуле изобретения будет сделана ссылка на ряд терминов, которые должны иметь следующие значения:

«Необязательный» или «необязательно» означает, что впоследствии описанное событие или обстоятельство может произойти или может не произойти, и что описание включает случаи, когда указанное событие или обстоятельство происходит, и случаи, когда оно не происходит.

Как используется повсеместно, под «субъектом» подразумевается индивидуум. В некоторых вариантах осуществления субъектом является млекопитающее, такое как примат. В конкретном варианте субъектом является человек. Таким образом, «субъект» может включать домашних животных, таких как кошки, собаки и т.д., домашний скот (например, крупный рогатый скот, лошади, свиньи, овцы, козы и т.д.), и лабораторных животных (например, мышь, кролика, крысу, морскую свинку и т.д.).

Термины «полипептид» и «пептид», как правило, используются взаимозаменяемо, если в контексте не указано иное. Если не указано иное, как «полипептид», так и «пептид» могут относиться к встречающимся в природе или не встречающимся в природе аминокислотам, связанным пептидными связями.

Термин «стационарное состояние» используется в его обычном значении в фармакокинетике. Вкратце, стационарная концентрация, например, в плазме или спинномозговой жидкости (CSF) представляет собой концентрацию в плазме и CSF, когда скорость введения нейропротективного полипептида(ов) равна скорости, с которой нейропротективный полипептид(ы) элиминируется организмом субъекта. Определение стационарной концентрации нейропротективного полипептида(ов) настоящего изобретения является обычным для специалиста со средним уровнем компетентности в данной области техники.

Под «выделенным полипептидом» или «очищенным полипептидом» подразумевается полипептид, который по существу не содержит веществ, с которыми полипептид обычно ассоциируется в природе или в культуре. Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены, например, путем экстракции из природного источника, если он доступен (например, клеток млекопитающего), путем экспрессии рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, (например, в клетке или в бесклеточной системе трансляции) или путем химического синтеза полипептида. Кроме того, полипептид может быть получен путем расщепления полноразмерных полипептидов. Когда полипептид представляет собой фрагмент более крупного встречающегося в природе полипептида, выделенный полипептид короче и исключает полноразмерный встречающийся в природе полипептид, фрагментом которого он является.

Настоящее изобретение относится к способам доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением в системный кровоток субъекта, причем: нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина (такого как аналог эксендина-4); нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или их комбинации; и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.

Как показано на фиг. 1А, 1В, 2 и 3, нейропротективный состав с контролируемым высвобождением приводит к большему поддержанию уровней эксенатида в плазме в модели на животном. Кроме того, фиг. 7В и 8В демонстрируют, что состав с эксенатидом с контролируемым высвобождением является более эффективным нейропротектором и более эффективным нейрорепаративным составом/терапевтическим составом, чем один эксенатид.

Настоящее изобретение относится к способам доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ может включать: введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, при этом нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или замедленное высвобождение нейропротективного полипептида усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.

Настоящее изобретение также относится к способам лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ может включать: введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, при этом нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или устройство усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.

В некоторых вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением представляет собой состав нейропротективного полипептида длительного действия. состав длительного действия может включать депо-состав для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида. Например, состав длительного действия может включать композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида (более подробно описанную ниже). В дополнительных вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени. В дополнительных вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени без начального выброса (например, без начального выброса, такого как вредный начальный выброс, активного ингредиента) активного ингредиента. В конкретных вариантах осуществления нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает: микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро.

В одном варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта. Например, связанное с ЦНС состояние может быть выбрано из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.

Введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением может включать инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением. Например, нейропротективный состав с контролируемым высвобождением может быть инъецирован подкожно.

В другом варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл. Например, стационарная концентрация нейропротективного полипептида в плазме может находиться в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 1250 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 1000 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 750 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 500 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 1250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 1000 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 750 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 500 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 1250 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 1000 пг/мл, от приблизительно 500 до приблизительно 750 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 1250 пг/мл, от приблизительно 750 до приблизительно 1000 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 1000 до приблизительно 1250 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 1250 до приблизительно 1500 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 1500 до приблизительно 1750 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 1750 до приблизительно 2000 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 2000 до приблизительно 2250 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 2250 до приблизительно 2500 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 2500 до приблизительно 2750 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 2750 до приблизительно 3000 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 3000 до приблизительно 3250 пг/мл, от приблизительно 3250 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 3250 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 3250 до приблизительно 4000 пг/мл, от приблизительно 3250 до приблизительно 3750 пг/мл, от приблизительно 3250 до приблизительно 3500 пг/мл, от приблизительно 3500 до приблизительно 4500 пг/мл, от приблизительно 3500 до приблизительно 4250 пг/мл, от приблизительно 3500 до приблизительно 4000 пг/мл или от приблизительно 3500 до приблизительно 3750 пг/мл.

Устойчивая стационарная концентрация нейропротективного полипептида в плазме, как описано выше, приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в спинномозговой жидкости (CSF), головном мозге или их комбинации у субъекта. Например, концентрация нейропротективного полипептида в CSF может находиться в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 400 пг/мл или от приблизительно 10 до приблизительно 400 пг/мл. Т.е. концентрация нейропротективного полипептида в CSF может находиться в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 200 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 150 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 100 пг/мл, от приблизительно 10 до приблизительно 50 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 200 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 150 пг/мл, от приблизительно 50 до приблизительно 100 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 200 пг/мл, от приблизительно 100 до приблизительно 150 пг/мл, от приблизительно 150 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 150 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 150 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 150 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 150 до приблизительно 200 пг/мл, от приблизительно 200 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 200 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 200 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 200 до приблизительно 250 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 350 пг/мл, от приблизительно 250 до приблизительно 300 пг/мл, от приблизительно 300 до приблизительно 400 пг/мл, от приблизительно 300 до приблизительно 350 пг/мл или от приблизительно 350 до приблизительно 400 пг/мл.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, отношение стационарной концентрации полипептида в CFS к таковой в плазме может находиться в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%. Например, отношение стационарной концентрации в CSF к стационарной концентрации полипептида в плазме может составлять, в любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, по меньшей мере приблизительно 0,1%, по меньшей мере приблизительно 0,3%, по меньшей мере приблизительно 0,5%, по меньшей мере приблизительно 0,7%, по меньшей мере приблизительно 0,9%, по меньшей мере приблизительно 1%, по меньшей мере приблизительно 1,1%, по меньшей мере приблизительно 1,2%, по меньшей мере приблизительно 1,5%, по меньшей мере приблизительно 2,0%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 4%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 3%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 5%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 4%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 3%, от приблизительно 0,5% до приблизительно 2%, от приблизительно 1% до приблизительно 5%, от приблизительно 1% до приблизительно 4%, от приблизительно 1% до приблизительно 3%, от приблизительно 1% до приблизительно 2%, от приблизительно 2% до приблизительно 5%, от приблизительно 2% до приблизительно 4%, от приблизительно 2% до приблизительно 3%, от приблизительно 3% до приблизительно 5%, от приблизительно 3% до приблизительно 4% или от приблизительно 4% до приблизительно 5%.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, процентное изменение стационарного уровня концентрации нейропротективного полипептида в плазме (т.е., процентное изменение после достижения стационарного состояния) может составлять не более приблизительно 80% (например, не более приблизительно 50%). Например, процентное изменение концентрации нейропротективного полипептида в плазме может составлять не более приблизительно 80% (например, не более приблизительно 50%) при повторном введении после достижения стационарного уровня/концентрации в плазме (например, концентрация нейропротективного полипептида в плазме может находиться в стационарном состоянии через приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5 или приблизительно 6 недель после первого введения). Например, процентное изменение стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме после достижения стационарного состояния составляет не более приблизительно 80%, приблизительно 79%, приблизительно 78%, приблизительно 77%, приблизительно 76%, приблизительно 75%, приблизительно 74%, приблизительно 73%, приблизительно 72%, приблизительно 71%, приблизительно 70%, приблизительно 69%, приблизительно 68%, приблизительно 67%, приблизительно 66%, приблизительно 65%, приблизительно 64%, приблизительно 63%, приблизительно 62%, приблизительно 61%, приблизительно 60%, приблизительно 59%, приблизительно 58%, приблизительно 57%, приблизительно 56%, приблизительно 55%, приблизительно 54%, приблизительно 53%, приблизительно 52%, приблизительно 51%, приблизительно 50%, приблизительно 49%, приблизительно 48%, приблизительно 47%, приблизительно 46%, приблизительно 45%, приблизительно 44%, приблизительно 43%, приблизительно 42%, приблизительно 41%, приблизительно 40%, приблизительно 39%, приблизительно 38%, приблизительно 37%, приблизительно 36%, приблизительно 35%, приблизительно 34%, приблизительно 33%, приблизительно 32%, приблизительно 31%, приблизительно 30%, приблизительно 29%, приблизительно 28%, приблизительно 27%, приблизительно 26%, приблизительно 25%, приблизительно 24%, приблизительно 23%, приблизительно 22%, приблизительно 21%, приблизительно 20%, приблизительно 19%, приблизительно 18%, приблизительно 17%, приблизительно 16%, приблизительно 15%, приблизительно 14%, приблизительно 13%, приблизительно 12%, приблизительно 11%, приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно 6% или приблизительно 5%, например, когда нейропротективный полипептид повторно вводят в пределах приблизительно 28 дней (например, в пределах приблизительно 7, 14 или приблизительно 21 дня) от предшествующего введения нейропротективного полипептида (например, вводят через приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27 или приблизительно 28 дней после предшествующего введения нейропротективного полипептида(ов)).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав вводят один раз каждые приблизительно 7-28 дней (например, приблизительно 7-21 день или приблизительно 7-14 дней). Например, состав может вводиться множество раз, причем каждое введение с интервалом от приблизительно 7 до приблизительно 28 дней (например, один раз каждые приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 25, приблизительно 26, приблизительно 27 или приблизительно 28 дней) друг от друга (например, последующее введение через приблизительно 7-28 дней после предшествующего введения). состав можно вводить в любом аспекте или варианте осуществления настоящего изобретения множество раз, причем состав вводят с интервалом от приблизительно 7 до приблизительно 28 дней (например, с интервалом, составляющим приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20 или приблизительно 21 дня (т.е. один раз каждые приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20, приблизительно 21, приблизительно 22, приблизительно 23, приблизительно 24, приблизительно 26, приблизительно 27 или приблизительно 28 дней).

В дополнительном аспекте предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение субъекту терапевтически эффективного количества нейропротективного состава с контролируемым высвобождением в системный кровоток субъекта, причем: нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина (например, эксендина-4); нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина (например, эксендина-4) или их комбинации; и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с одним нейропротективным полипептидом.

В конкретном варианте осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта. Например, состояние ЦНС выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.

В дальнейших вариантах осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту. Например, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает подкожную инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту. В дополнительных вариантах осуществления состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени. В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением обладает биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени без начального выброса (например, вредного начального выброса) активного ингредиента. В конкретных вариантах осуществления нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает: микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро.

В дополнительных вариантах осуществления введение состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации в плазме нейропротективного полипептида, которая находится в диапазоне, описанном выше, например, от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.

В некоторых вариантах осуществления введение состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.

В дальнейшем аспекте в настоящем описании предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть ЦНС по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.

В еще одном аспекте в настоящем описании предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с ЦНС, или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через BBB субъекта по меньшей мере в часть ЦНС по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида. В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида или полипептидов включает введение нейропротективного полипептида или полипептидов с помощью устройства (например, насоса, мини-насоса, осмотического насоса, осмотического устройства для доставки, инфузионного насоса, устройства для внутривенного введения, перистальтического насоса, миниатюрного инфузионного насоса или т.п.).

Нейропротективный полипептид или полипептиды (например, в нейропротективном составе с контролируемым высвобождением) можно вводить со скоростью от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин (например, от приблизительно 3 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин). Например, нейропротективный полипептид или полипептиды можно вводить со скоростью от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 22,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 20 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 15 пМ/кг/мин, от приблизительно 0,5 пМ/кг/мин до приблизительно 12,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 0.5 пМ/кг/мин до приблизительно 10 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 22,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 20 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 15 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 12,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 1,5 пМ/кг/мин до приблизительно 10 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 22,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 20 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 15 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 12,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 2,5 пМ/кг/мин до приблизительно 10 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 22,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 20 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 15 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 12,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 5 пМ/кг/мин до приблизительно 10 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 22,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 20 пМ/кг/мин, от приблизительно 10 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 27,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 15 пМ/кг/мин до приблизительно 25 пМ/кг/мин, от приблизительно 20 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 20 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин, от приблизительно 20 пМ/кг/мин до приблизительно 32,5 пМ/кг/мин, от приблизительно 20 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин или от приблизительно 25 пМ/кг/мин до приблизительно 35 пМ/кг/мин.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением или нейропротективный полипептид или полипептиды можно вводить с помощью устройства. Например, устройство может представлять собой имплантируемое устройство, которое содержит и доставляет состав с контролируемым высвобождением или нейропротективный полипептид или полипептиды. Устройством может быть насос, мини-насос, осмотический насос, осмотическое устройство доставки, инфузионный насос, устройство для внутривенного введения, перистальтический насос, миниатюрный инфузионный насос или т.п. В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, устройство может представлять собой имплантируемое устройство, которое может обеспечивать постоянную подачу, регулируемую подачу или программируемую подачу состава с контролируемым высвобождением или нейропротективного полипептида или полипептидов. Например, осмотическое устройство доставки описано в патенте США с № 8298561 В2 или патенте США с № 8940316 В2, оба из которых включены сюда посредством ссылки во всей их полноте.

Используемый здесь термин «осмотическое средство доставки» относится к устройству, используемому для доставки одного или более полезных агентов (например, нейропротективного полипептида или полипептидов или состава с контролируемым высвобождением) субъекту, причем устройство включает, например, резервуар (изготовленный, например, из титанового сплава), имеющий полость, которая содержит суспензионный состав (например, содержащий нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением) и состав осмотического агента. Поршень в сборе, расположенный в полости, отделяет суспензионный состав от состава осмотического агента. Полупроницаемая мембрана расположена на первом дистальном конце резервуара рядом с составом осмотического агента, а модулятор подачи (который определяет выпускное отверстие, через которое суспензионный состав выходит из устройства), расположен на втором дистальном конце резервуар рядом с суспензионным составом. Осмотическое устройство доставки или осмотический насос могут быть имплантированы субъекту, например, подкожно (например, внутри, снаружи или сзади плеча или в область живота).

Нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением, описанный здесь, можно вводить с помощью устройства для обеспечения долговременной доставки нейропротективного полипептида или полипептида или состава с контролируемым высвобождением в течение продолжительного периода времени, например в течение нескольких недель, месяцев или до приблизительно одного года. Такое устройство, которое может представлять собой имплантируемое устройство, способно доставлять нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением с желаемой скоростью подачи в течение требуемого периода времени. Нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением могут быть загружены в имплантируемое устройство доставки лекарственного средства обычными способами.

Нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением могут быть доставлены, например, с использованием осмотически, механически, электромеханически или химически управляемого устройства. В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением доставляются со скоростью подачи, которая является терапевтически эффективной для субъекта, нуждающегося в лечении, с помощью нейропротективного полипептида(ов).

Нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением может доставляться в течение периода времени, составляющего от более чем приблизительно одной недели до приблизительно одного года или более (например, от приблизительно одного месяца до приблизительно одного года или более или в течение от приблизительно трех месяцев до приблизительно одного года или более). Устройство может включать резервуар, имеющий по меньшей мере одно отверстие, через которое доставляется нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением. Нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением может храниться в резервуаре. В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, устройство представляет собой осмотическое устройство доставки, которое может быть имплантируемым устройством, причем доставка нейропротективного полипептида или полипептидов или состава с контролируемым высвобождением осуществляется осмотически. Некоторые осмотические устройства доставки или осмотические насосы и их составные части, например, устройство доставки DUROS® или аналогичные устройства, были описаны (смотрите, например, патенты США с № 5609885; 5728396; 5985305; 5997527; 6113938; 6132420; 6156331; 6217906; 6261584; 6270787; 6,287,295; 6375978; 6395292; 6508808; 6544252; 6635268; 6682522; 6923800; 6939556; 6976981; 6997922; 7014636; 7207982; 7112335; 7163688; публикацию заявки на патент США с № 2005-0175701, 2007-0281024 и 2008-0091176, все из которых включены сюда посредством ссылки во всей их полноте).

Устройство доставки DUROS®, как правило, состоит из цилиндрического резервуара, который содержит осмотический двигатель, поршень и лекарственный состав. Резервуар закрывается на одном конце водопроницаемой мембраной с регулируемой скоростью, а на другом конце - диффузионным замедлителем, через который лекарственный состав высвобождается из резервуара для лекарственного средства. Поршень отделяет лекарственный состав от осмотического двигателя, и в нем используется уплотнение для предотвращения попадания воды из отсека осмотического двигателя в резервуар с лекарственным средством. Диффузионный замедлитель предназначен в сочетании с лекарственным составом (например, нейропротективным полипептидом или полипептидами или составом с контролируемым высвобождением) для предотвращения попадания жидкости организма в резервуар с лекарственным средством через отверстие.

Устройство DUROS® выпускает терапевтический агент с заранее определенной скоростью, основанной на принципе осмоса. Экстраклеточная жидкость поступает в устройство DUROS® через полупроницаемую мембрану непосредственно в солевой двигатель, который расширяется с приведением поршня в движение с низкой и равномерной скоростью доставки. Движение поршня заставляет лекарственный состав (например, нейропротективный полипептид или полипептиды или состав с контролируемым высвобождением) высвобождаться через отверстие или выходное отверстие с заданной скоростью сдвига. В любом аспекте или варианте осуществления настоящего изобретения резервуар устройства DUROS® загружают нейропротективным полипептидом(ами) или составом с контролируемым высвобождением, причем устройство способно доставлять нейропротективный полипептид(ы) или состав с контролируемым высвобождением субъекту в течение длительного периода времени (например, приблизительно 1, приблизительно 2, приблизительно 3, приблизительно 4, приблизительно 5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 или приблизительно 12 месяцев) с заранее определенной, терапевтически эффективной скоростью доставки.

Любое имплантируемое устройство может использоваться при осуществлении на практике настоящего раскрытия и может включать имплантируемые насосы регуляторного типа, которые обеспечивают постоянную подачу, регулируемую подачу или программируемую подачу соединения.

Количество нейропротективного полипептида(ов) или состава с контролируемым высвобождением, применяемое в устройстве для доставки настоящего изобретения, является таким количеством, которое необходимо для доставки терапевтически эффективного количества агента для достижения желаемого терапевтического результата. На практике оно будет варьировать в зависимости от таких переменных, например, как конкретный агент, место доставки, тяжесть состояния и желаемый терапевтический эффект. Как правило, в случае осмотического устройства доставки объем камеры для полезного агента, содержащей нейропротективный полипептид(ы) или состав с контролируемым высвобождением, составляет от приблизительно 100 мкл до приблизительно 1000 мкл (например, от приблизительно 120 мкл до приблизительно 500 мкл или от приблизительно 150 мкл до приблизительно 200 мкл).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, осмотическое устройство доставки имплантируется субъекту, например, подкожно. Устройство(а) может быть вставлено в одно или оба плеча (например, внутрь, снаружи или сзади плеча) или в брюшную полость. Например, устройство может быть имплантировано под кожу живота в области, простирающейся ниже ребер и выше линии пояса. Чтобы обеспечить ряд мест для вставки одного или более осмотических устройств доставки в брюшную полость, брюшную стенку можно разделить на 4 квадрата следующим образом: верхний правый квадрат, простирающийся на 5-8 сантиметров ниже правых ребер и приблизительно на 5-8 сантиметров правее срединной линии, нижний правый квадрат простирается на 5-8 сантиметров выше линии пояса и на 5-8 сантиметров правее срединной линии, верхний левый квадрат простирается на 5-8 сантиметров ниже левых ребер и приблизительно на 5-8 сантиметров левее срединной линии, а нижний левый квадрат простирается на 5-8 сантиметров выше линии пояса и на 5-8 сантиметров левее срединной линии. Это обеспечивает множество доступных мест для имплантации одного или более устройств в одном или более случаях.

В других вариантах осуществления введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением или обеспечение долговременной доставки нейропротективного полипептида ослабляет у субъекта по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния, выбираемого из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение состава с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение состава с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.

НЕЙРОПРОТЕКТИВНЫЕ ПОЛИПЕПТИДЫ

Нейропротективный полипептид может иметь аминокислотную последовательность, выбираемую из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:35, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:37, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:43, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:45, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50,. SEQ ID NO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54 или SEQ ID NO:55. Нейропротективный полипептид может включать аминокислотную последовательность, выбираемую из SEQ ID NO:1-55. Кроме того, нейропротективный полипептид может состоять из аминокислотной последовательности, выбираемой из SEQ ID NO:1-55.

Под «аналогом GLP-1 или эксендина-4» подразумеваются модифицированные аминокислотные последовательности GLP-1 и/или эксендина, которые проявляют свойства агониста (т.е. проявляют одну или более биологических активностей GLP-1 или эксендина-4). Такие модификации включают химерные полипептиды, которые включают один или более аминокислотных остатков, присутствующих в GLP-1, и один или более аминокислотных остатков, присутствующих в эксендине-4. Модификации также включают усечения либо GLP-1, либо эксендина-4, либо химерных полипептидов. Например, укороченный химерный полипептид представляет собой эксендин-4 7-36, где G в положении 36 заменен на R в положении 36 GLP-1. Полипептиды настоящего изобретения включают одну или более дополнительных аминокислот (т.е. вставок или добавлений), делеции аминокислот или замены в аминокислотной последовательности GLP-1 или эксендина-4 без заметной потери функциональной активности по сравнению с GLP-1 или эксендином-4. Например, делеция может состоять из аминокислот, которые не являются необходимыми для определяемой в настоящее время дифференцирующей активности, и замена(ы) может быть консервативной (т.е. основной, гидрофильной или гидрофобной аминокислотой, замещенной такой же аминокислотой) или неконсервативной. Консервативная замена представляет собой замену, в которой замещенная аминокислота имеет сходные структурные или химические свойства с соответствующей аминокислотой в контрольной последовательности. В качестве примера, консервативные аминокислотные замены включают замену одной алифатической или гидрофобной аминокислоты, например аланина, валина, лейцина и изолейцина, другой; замену одной гидроксилсодержащей аминокислоты, например, серина и треонина, другой; замену одного кислотного остатка, например глютаминовой кислоты или аспарагиновой кислоты, другим; замену одного амидсодержащего остатка, например, аспарагина и глютамина, другим; замену одного ароматического остатка, например фенилаланина и тирозина, другим; замену одного основного остатка, например лизина, аргинина и гистидина, другим; и замену одной небольшой аминокислоты, например аланина, серина, треонина, метионина и глицина, другой. Таким образом, следует понимать, что при желании могут быть сделаны модификации и изменения в аминокислотной последовательности GLP-1 и эксендина-4, и все еще может быть получен белок, имеющий сходные характеристики. Различные изменения могут быть сделаны в аминокислотной последовательности GLP-1 или аминокислотной последовательности эксендина-4 (или исходной последовательности нуклеиновой кислоты) без заметной потери биологической полезности или активности и, возможно, с увеличением такой полезности или активности.

Термин «фрагменты» или «усечения», как он используется здесь в отношении GLP-1 или эксендина-4, или полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, по существу, гомологичные им, означает полипептидную последовательность из по меньшей мере 5 следующих друг за другом аминокислот либо GLP-1, эксендина-4, либо полипептидов, имеющих аминокислотные последовательности, по существу, гомологичные им, причем полипептидная последовательность обладает инсулинотропной функцией.

Другие модификации включают D-энантиомеры, в которых по меньшей мере одна встречающаяся в природе L-конфигурация аминокислотного остатка заменена D-конфигурацией аминокислотного остатка.

В настоящем изобретении предусматривается использование спейсера, такого как латеральный спейсер. Термин «латеральный спейсер» определяется как соединение, которое включено в аминокислотную последовательность с помощью химических связей, в результате чего соединение увеличивает расстояние между двумя или более аминокислотными остатками, чтобы уменьшить или исключить расщепление (например, с помощью DPP 1V) аминокислотной последовательности в этом положении или вблизи него. Например, в последовательности A-X-B, где A и B представляют собой аминокислотные остатки, а X представляет собой латеральный спейсер, расщепление последовательности ферментом уменьшается или исключается по сравнению с последовательностью в отсутствие латерального спейсера (A-B). Например, от 1 до 4 соединений могут быть включены в аминокислотную последовательность в качестве латерального спейсера. Таким образом, 1, 2, 3 или 4 соединения вставляются в различных вариантах.

В общем, латеральный спейсер представляет собой любое соединение, которое может образовывать пептидную связь с аминокислотой, т.е. содержит по меньшей мере одну аминогруппу и по меньшей мере одну карбоксильную группу (CO₂), где карбоксильная группа может представлять собой карбоновую кислоту или ее сложный эфир или соль. В одном варианте осуществления латеральный спейсер имеет формулу H₂N-R¹-CO₂H (I), где R¹ включает замещенную или незамещенную C₁-C₂₀ алкильную группу, алкенильную группу или алкинильную группу с разветвленной или неразветвленной цепью; замещенную или незамещенную С₃-С₈ циклоалкильную группу; замещенную или незамещенную С₆-С₂₀ арильную группу; или замещенную или незамещенную С₄-С₂₀ гетероарильную группу. В другом варианте осуществления R¹ может быть представлен формулой (CH₂)_n, где n равно от 1 до 10. В одном варианте осуществления R¹ представляет собой (CH₂)³(3-аминопропионовую кислоту) или (CH₂)₅(6-аминокапроновую кислоту)).

В настоящем описании предложен способ, который включает введение состава с контролируемым высвобождением, содержащего по меньшей мере один нейропротективный полипептид. Полипептид может включать модифицированную последовательность GLP-1 или эксендина (например, эксендина-4), или его аналог или производное, со спейсером между аминокислотными остатками, сравнимыми с остатками 7 и 8 (согласно обозначению в случае GLP-1 со спейсером Aha, например, «GLP-1Aha⁸») или остатками 8 и 9 (согласно обозначению в случае GLP-1 со спейсером Aha, например, «GLP-1Aha⁹») GLP-1. Латеральный спейсер, в одном варианте осуществления, представляет собой один или более остатков аминопропионовой кислоты. В одном варианте осуществления спейсер представляет собой спейсер в виде 6-аминокапроновой кислоты, и спейсер в виде 6-аминокапроновой кислоты включает менее четырех остатков 6-аминокапроновой кислоты. Полипептид, например, может включать GLP-1 7-36 с одним или более остатками 6-аминокапроновой кислоты между остатками 7 и 8 (т.е. GLP-1 Aha⁸) или может включать GLP-1 7-36 с одним или более остатками 6- аминокапроновой кислоты между остатками 8 и 9. Полипептид может включать GLP-1 7-36 с двумя или более остатками 6-аминокапроновой кислоты между остатками 7 и 8 (т.е. GLP-1 Aha⁸) или может включать GLP-1 7- 36 с двумя или более остатками 6- аминокапроновой кислоты между остатками 8 и 9. Например, полипептид может включать GLP-1 7-36 с тремя или более остатками 6-аминокапроновой кислоты между остатками 7 и 8 (т.е. GLP-1 Aha⁸) или может включать GLP-1 7-36 с тремя или более остатками 6- аминокапроновой кислоты между остатками 8 и 9.

В других вариантах осуществления полипептид настоящего изобретения обладает инсулинотропным эффектом, сравнимым с эффектом эквимолярного количества GLP-1, или, в одном варианте осуществления, инсулинотропным эффектом, сравнимым с эффектом эквимолярного количества эксендина-4. Под «сравнимым с эффектом» подразумевается эффект, который находится в пределах приблизительно 10-15% от эффекта GLP-1 или эксендина-4. В другом варианте осуществления полипептид обладает инсулинотропным эффектом, который превышает инсулинотропный эффект как GLP-1, так и эксендина-4. Под «превышением эффекта» GLP-1 или эксендина-4 подразумевается увеличение инсулинотропного эффекта по сравнению с GLP-1 или эксендином-4, такое как увеличение, превышающее приблизительно 10% от GLP-1 или эксендина-4. Таким образом, в одном варианте осуществления полипептид настоящего изобретения является таким же сильным, как GLP-1 или эксендин-4, а в другом варианте осуществления полипептид настоящего изобретения является более сильным, чем GLP-1, и, необязательно, более сильным, чем эксендин-4. В других вариантах осуществления полипептид настоящего изобретения действует дольше, чем GLP-1. В дальнейшем варианте осуществления полипептид действует по меньшей мере так же долго, как и эксендин-4. В других вариантах осуществления полипептид действует дольше, чем эксендин-4. Под «более длительным действием» подразумевается, что полипептид является более устойчивым, чем GLP-1 или эксендин-4, к по меньшей мере одному расщепляющему ферменту. Например, полипептид настоящего изобретения является более устойчивым к расщеплению ферментом дипептидилпептидазой-4 (DPPIV), чем GLP-1, и, необязательно, более устойчивым, чем эксендин-4. Такая устойчивость к одному или более расщепляющих ферментов может быть оценена непосредственно путем определения количества продуктов расщепления (например, количества продуктов N-концевого отщепления) или количества нерасщепленного полипептида. Альтернативно, устойчивость к одному или более расщепляющих ферментов может быть обнаружена косвенно путем оценки снижения инсулинотропного эффекта с течением времени после введения полипептида настоящего изобретения. Например, когда расщепляющие ферменты расщепляют полипептиды настоящего изобретения, уровни инсулина в плазме должны снижаться после однократного введения. В дополнительных вариантах осуществления это снижение будет медленнее, чем в случае GLP-1, и/или, возможно, даже медленнее, чем в случае эксендина-4.

Полипептиды настоящего изобретения могут быть получены с использованием любого из ряда методов химического синтеза полипептидов, хорошо известных специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники, включая методы получения в растворе и твердофазные методы. Твердофазный синтез, в котором С-концевая аминокислота полипептидной последовательности присоединяется к нерастворимому носителю с последующим последовательным добавлением оставшихся аминокислот в последовательности, является одним из синтетических способов получения полипептидов. Методы твердофазного синтеза описаны в Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963). Многие автоматизированные системы для проведения твердофазного пептидного синтеза являются коммерчески доступными.

Твердофазный синтез начинают с карбоксильного конца (т.е. C-конца) полипептида путем присоединения защищенной аминокислоты через ее карбоксильную группу к подходящему твердому носителю. Используемый твердый носитель не является критической характеристикой при условии, что он способен связываться с карбоксильной группой, оставаясь по существу инертным по отношению к реагентам, используемым в процедуре синтеза пептидов. Например, исходный материал может быть получен путем присоединения аминозащищенной аминокислоты через бензилэфирную связь к хлорметилированной смоле или гидроксиметиловой смоле или через амидную связь к бензгидриламинной смоле (ВНА) или к пара-метилбензгидриламинной смоле (MBHA). Материалы, подходящие для использования в качестве твердых носителей, хорошо известны специалистам в данной области техники и включают, но без ограничения ими, следующие: галогенметиловые смолы, такие как хлорметиловая смола или бромметиловая смола; гидроксиметиловые смолы; фенольные смолы, такие как 4-(a-[2,4-диметоксифенил]-Fmoc-аминометил)фенокси-смола; трет-алкилоксикарбонилгидразидированные смолы; и т.п. Такие смолы являются коммерчески доступными, и способы их получения известны специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники.

Кислотная форма пептидов может быть получена с помощью процедуры твердофазного синтеза пептидов с использованием смолы на основе бензилового эфира в качестве твердого носителя. Соответствующие амиды могут быть получены с использованием бензгидриламинной или метилбензгидриламинной смолы в качестве твердого носителя. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что при использовании смолы ВНА или МВНА обработка безводной фтористоводородной кислотой для отщепления пептида от твердого носителя дает пептид, имеющий концевую амидную группу.

α-аминогруппа каждой аминокислоты, используемой в синтезе, должна быть защищена во время реакции конденсации, чтобы предотвратить побочные реакции, вовлекающие реакционноспособную функциональную α-аминогруппу. Некоторые аминокислоты также содержат реакционноспособные функциональные группы боковых цепей (например, сульфгидрильную, аминогруппу, карбоксильную, гидроксильную и т.д.), которые также должны быть защищены соответствующими защитными группами, чтобы предотвратить протекание химических реакций в этих сайтах во время синтеза пептида. Защитные группы хорошо известны специалистам в данной области техники. Смотрите, например, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Vol. 3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis (Gross and Meienhofer (eds.), Academic Press, N.Y. (1981)).

Правильно выбранная α-аминозащитная группа сделает функциональную α-аминогруппу инертной во время реакции конденсации, будет легко удаляться после конденсации в условиях, которые не удаляют защитные группы боковых цепей, не будет изменять структуру пептидного фрагмента и предотвратит рацемизацию при активации непосредственно перед конденсацией. Аналогично, защитные группы для боковой цепи должны быть выбраны для придания функциональной группе боковой цепи инертности во время синтеза, они должны быть стабильными в условиях, используемых для удаления α-аминозащитной группы, и должны быть удаляемыми после завершения пептидного синтеза в условиях, которые не будут изменять структуру пептида.

Конденсация аминокислот может быть осуществлена различными способами, известными специалистам в данной области техники. Типичные подходы включают либо превращение аминокислоты в производное, которое сделает карбоксильную группу более чувствительной к реакции со свободной N-концевой аминогруппой пептидного фрагмента, либо использование подходящего связующего средства, такого как, например, N,N'-дициклогексилкарбодимид (DCC) или N,N'-диизопропилкарбодиимид (DIPCDI). Часто гидроксибензотриазол (HOBt) используют в качестве катализатора в этих реакциях конденсации.

Как правило, синтез пептида начинается с первого присоединения С-концевой аминокислоты, которая защищена в положении N-аминогруппы защитной группой, такой как флуоренилметилоксикарбонил (Fmoc), к твердому носителю. Перед присоединением Fmoc-Asn остаток Fmoc должен быть удален из полимера. Fmoc-Asn может, например, быть присоединен к 4-(a-[2,4-диметоксифенил-1]-Fmoc-аминометил)фенокси-смоле с использованием N,N'-дициклогексилкарбодимида (DCC) и гидроксибензотриазола (HOBt) при приблизительно 25°С в течение приблизительно двух часов при перемешивании. После присоединения Fmoc-защищенной аминокислоты к носителю в виде смолы α-аминозащитную группу удаляют с использованием 20% пиперидина в DMF при комнатной температуре.

После удаления α-аминозащитной группы оставшиеся аминокислоты, защищенные Fmoc, поэтапно присоединяют в желаемом порядке. Подходящим образом защищенные аминокислоты коммерчески доступны от ряда поставщиков (например, Novartis (Швейцария) или Bachem (Torrance, CA)). В качестве альтернативы поэтапному добавлению отдельных аминокислот, соответствующим образом защищенные пептидные фрагменты, состоящие из более чем одной аминокислоты, также могут быть присоединены к «растущему» пептиду. Выбор подходящего связующего реагента, как объяснено выше, хорошо известен специалистам в данной области техники.

Каждая защищенная аминокислота или аминокислотная последовательность вводится в твердофазный реактор в избытке, и конденсация проводится в среде диметилформамида (DMF), метиленхлорида (CH₂Cl₂) или их смесей. Если конденсация является неполной, реакцию конденсации можно повторить перед снятием защиты с N-аминогруппы и добавлением следующей аминокислоты. Эффективность конденсации можно контролировать с помощью ряда средств, хорошо известных специалистам в данной области техники. Методом контроля эффективности конденсации может быть нингидриновая реакция. Реакции синтеза пептидов могут выполняться автоматически с использованием ряда коммерчески доступных пептидных синтезаторов, таких как синтезатор Biosearch 9500™ (Biosearch, San Raphael, CA).

Пептид может быть отщеплен, и защитные группы могут быть удалены путем перемешивании нерастворимого носителя или твердого носителя в безводном жидком фторводороде (HF) в присутствии анизола и диметилсульфида при температуре приблизительно 0°C в течение приблизительно 20-90 минут, например, 60 минут; путем непрерывного барботирования бромистого водорода (HBr) через 1 мг/10 мл суспензию смолы в трифторуксусной кислоте (TFA) в течение 60-360 минут при комнатной температуре, в зависимости от выбранных защитных групп; или путем инкубирования твердого носителя внутри реакционной колонки, используемой для твердофазного синтеза, с 90% трифторуксусной кислоты, 5% воды и 5% триэтилсилана в течение приблизительно 30-60 минут. Также могут использоваться другие способы снятия защиты, хорошо известные специалистам в данной области техники.

Пептиды могут быть выделены и очищены из реакционной смеси с помощью очистки пептидов, хорошо известной специалистам в данной области техники. Например, пептиды могут быть очищены с использованием известных хроматографических процедур, таких как HPLC c обращенной фазой, гель-хроматография, ионноообменная, эксклюзионная, аффинная, распределительная хроматография или противоточное распределение.

Нейропротективные полипептиды также могут быть получены другими способами, включая, например, рекомбинантные методы. Примеры подходящих методов клонирования и секвенирования, а также инструкции, достаточные для того, чтобы направить специалистов по множеству действий по клонированию, можно найти в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd ed.) Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Press, NY, (Sambrook).

Например, производное или производные эксендина, используемые в составе с контролируемым высвобождением, может представлять собой соединение, представленное химической формулой I, или его фармацевтически приемлемую соль:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28-Z₁, (Химическая формула I),

где:

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;

Xaa2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;

Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu;

Xaa4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;

Xaa6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;

Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr;

Xaa9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицин или Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;

Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val, или Met;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;

Xaa21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg или С1-С10 алканоил с прямой или разветвленной цепью;

Xaa22 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa23 представляет собой Ile, Val, Leu, пентилглицин, трет-бутилглицин или Met;

Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp;

Xaa25 представляет собой Ala, Trp, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;

Xaa27 представляет собой Ala или Lys;

Xaa28 представляет собой Ala или Asn; и

Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂,

Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, 3Hyp, 4Hyp, тиопролина, N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина или N-алкилаланина, Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser), и

Z₂ представляет собой -OH или -NH₂,

при условии, что:

не более трех из Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 и Xaa28 представляют собой Ala; и

когда Xaa1 представляет собой His, Arg или Tyr, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 представляет собой Ala.

В некоторых вариантах осуществления N-алкильные группы для N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина и N-алкилаланина могут включать низшие алкильные группы, такие как состоящие из от 1 до приблизительно 6 атомов углерода или от 1 до 4 атомов углерода. Соединение, представленное химической формулой I, может включать соединения, указанные в примерах 1-89 (соединения 1-89 соответственно), и соответствующие соединения, указанные в примерах 104 и 105 в PCT-заявке с серийным № PCT/US98/24273, поданной 13 ноября 1998, озаглавленный «Novel Exendin Agonist Compounds», которая тем самым включена посредством ссылки во всей своей полноте для любых целей.

В конкретном варианте осуществления производные эксендина химической формулы I могут включать те, в которых Xaa1 в химической формуле I представляет собой His, Ala, Norval или 4-имидазопропионил. В другом варианте Xaa1 в химической формуле I представляет собой His, Ala или 4-имидазопропионил. В дополнительном варианте осуществления Xaa1 в химической формуле I представляет собой His или 4-имидазопропионил.

Производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa2 представляет собой Gly.

Производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa3 представляет собой Ala.

Производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa4 представляет собой Ala.

Производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa9 представляет собой Ala.

Производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa14 представляет собой Leu, пентилглицин или Met.

Производными эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa21 представляет собой Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg или C₁-C₁₀ алканоил с прямой или разветвленной цепью.

В одном варианте осуществления производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa25 представляет собой Trp или Phe.

В другом варианте осуществления производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa6 представляет собой Ala, Phe или нафтилаланин, Xaa22 представляет собой Phe или нафтилаланин, и Xaa23 представляет собой Ile или Val. Кроме того, производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых: Хаа31, Хаа36, Хаа37 и Хаа38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, тиопролина и N-алкилаланина; Z₁ может представлять собой -NH₂; и Z₂ может представлять собой -NH₂.

В других вариантах осуществления производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa1 представляет собой Ala, His или Tyr (например, Ala или His); Xaa2 представляет собой Ala или Gly; Xaa6 представляет собой Phe или нафтилаланин; Xaa14 представляет собой Ala, Leu, пентилглицин или Met; Xaa22 представляет собой Phe или нафтилаланин; Xaa23 представляет собой Ile или Val; Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, тиопролина и N-алкилаланина; Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser); и Z₁ может представлять собой -NH₂.

В соответствии с одним вариантом осуществления, производные эксендина химической формулы I могут быть такими, в которых Xaa1 представляет собой His или Ala; Xaa2 представляет собой Gly или Ala; Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu; Xaa4 представляет собой Ala или Gly; Xaa5 представляет собой Ala или Thr; Xaa6 представляет собой Phe или нафтилаланин; Xaa7 представляет собой Thr или Ser; Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr; Xaa9 представляет собой Ala, Asp или Glu; Xaa10 представляет собой Ala, Leu или пентилглицин; Xaa11 представляет собой Ala или Ser; Xaa12 представляет собой Ala или Lys; Xaa13 представляет собой Ala или Gln; Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Met или пентилглицин; Xaa15 представляет собой Ala или Glu; Xaa16 представляет собой Ala или Glu; Xaa17 представляет собой Ala или Glu; Xaa19 представляет собой Ala или Val; Xaa20 представляет собой Ala или Arg; Xaa21 представляет собой Ala или Leu; Xaa22 представляет собой Phe или нафтилаланин; Xaa23 представляет собой Ile, Val или трет-бутилглицин; Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp; Xaa25 представляет собой Ala, Trp или Phe; Xaa26 представляет собой Ala или Leu; Xaa27 представляет собой Ala или Lys; и Xaa28 представляет собой Ala или Asn; Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂; Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо представляют собой Pro, гомопролин, тиопролин или N-метилаланин; Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser); и Z₂ представляет собой -OH или -NH₂, при условии, что не более трех из Xaa3, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 и Xaa28 представляют собой Ala, и когда Xaa1 представляет собой His, Arg или Tyr, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 может быть Ala.

В дальнейших вариантах осуществления соединения химической формулы I могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO:5-93, указанные в PCT-заявке с серийным номером PCT/US98/25728, или соединения, указанные в предварительной заявке на патент США 60/066,029, которая тем самым включена посредством ссылки.

В соответствии с одним вариантом осуществления предоставлены соединения, в которых Xaa14 представляет собой Leu, Ile, Val или пентилглицин (например, Leu или пентилглицин); и Xaa25 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин (например, Phe или нафтилаланин). Эти соединения будут менее подвержены окислительному расщеплению, как in vitro, так и in vivo, а также во время синтеза соединения.

В другом аспекте производные эксендина могут включать соединения, представленные химической формулой II, или их фармацевтически приемлемые соли:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 X₁-Z₁, (Химическая формула II)

где:

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;

Xaa2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;

Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu;

Xaa4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;

Xaa6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;

Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr;

Xaa9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицин или Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;

Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val, или Met;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;

Xaa21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NHε-R (где R представляет собой Lys, Arg, C1-C10 алканоил с прямой или разветвленной цепью или циклоаллеил-алканоил);

Xaa22 представляет собой Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa23 представляет собой Ile, Val, Leu, пентилглицин, трет-бутилглицин или Met;

Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp;

Xaa25 представляет собой Ala, Trp, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;

X₁ представляет собой Lys Asn, Asn Lys, Lys-NHε-R Asn, Asn Lys-NHε-R, Lys-NHε-R Ala, Ala Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg, C1-C10 алканоил с прямой или разветвленной цепью или циклоалкилалканоил;

Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂;

Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, 3Hyp, 4Hyp, тиопролина, N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина или N-алкилаланина, Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser), и

Z₂ представляет собой -OH или -NH₂,

при условии, что:

не более трех из Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25 и Xaa26 представляют собой Ala; и

когда Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr или 4-имидазопропионил, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 представляет собой Ala.

В некоторых вариантах осуществления производные эксендина химической формулы II могут включать те, в которых Xaa1 представляет собой His, Ala, Norval или 4-имидазопропионил (например, Xaa1 включает His, 4-имидазопропионил или Ala, или Xaa1 включает His или 4-имидазопропионил).

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa2 представляет собой Gly.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa4 представляет собой Ala.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa9 представляет собой Ala.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa14 представляет собой Leu, пентилглицин или Met.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa25 представляет собой Trp или Phe.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa6 представляет собой Ala, Phe или нафтилаланин, Xaa22 представляет собой Phe или нафтилаланин, и Xaa23 представляет собой Ile или Val.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Z₁ представляет собой -NH₂.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Хаа31, Хаа36, Хаа37 и Хаа38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, тиопролина и N-алкилаланина.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser). Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Z₂ представляет собой -NH₂.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Z₁ представляет собой -NH₂.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых Xaa21 представляет собой Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg или C₁-C₁₀ алканоил с прямой или разветвленной цепью.

Производные эксендина химической формулы II могут быть такими, в которых X1 представляет собой Lys Asn, Lys-NHε-R Asn или Lys-NHε-R Ala, где R представляет собой Lys, Arg или C₁-C₁₀ алканоил с прямой или разветвленной цепью.

В дальнейших вариантах осуществления производные эксендина химической формулы II могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности, идентифицированные как SEQ ID NO:95-110, указанные в WO 99/025728. Производные эксендина химической формулы II могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности, идентифицированные как SEQ ID NO:5-93, как описано в PCT-заявке PCT/US98/24210, поданной 13 ноября 1998 г., под названием «Novel Exendin Agonist Compounds». В другом аспекте производные эксендина химической формулы II могут включать соединения, имеющие аминокислотные последовательности, идентифицированные как SEQ ID NO:37-40, указанные в WO 99/007404. Указанные документы тем самым включены посредством ссылки.

Сокращения, используемые в химической формуле I и II, обозначают следующее.

«ACN» и «CH₃CN» относятся к ацетонитрилу.

«Boc», «tBoc» и «Tboc» относятся к трет-бутоксикарбонилу.

«DCC» относится к N,N'-дициклогексилкарбодиимиду.

«Fmoc» относится к флуоренилметоксикарбонилу.

«HBTU» относится к гексафторфосфату 2-(1H-бензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилурония.

«HOBt» относится к моногидрату 1-гидроксибензотриазола.

«homoP» и «hPro» относятся к гомопролину.

«MeAla» и «Nme» относятся к N-метилаланину.

«naph» относится к нафтилаланину.

«pG» и «pGly» относятся к пентилглицину.

«tBuG» относится к трет-бутилглицину.

«ThioP» и «tPro» относятся к тиопролину.

«3Hyp» относится к 3-гидроксипролину.

«4Hyp» относится к 4-гидроксипролину.

«NAG» относится к N-алкилглицину.

«NAPG» относится к N-алкилпентилглицину.

«Norval» относится к норвалину.

В одном варианте осуществления фрагменты или производные эксендина могут иметь С-конец, замещенный или незамещенный амидной группой, и могут быть выбраны из группы, состоящей из эксендина-4 (1-28) (SEQ ID NO:15), амида эксендина-4 (1-28), эксендина-4 (1-30) (SEQ ID NO:7), амида эксендина-4 (1-30), эксендина-4 (1-31) (SEQ ID NO:54), амида эксендина-4 (1-31), ¹⁴Leu²⁵Phe-эксендина-4 (SEQ ID NO: 55), амида ¹⁴Leu²⁵Phe-эксендина-4 и их фармацевтически приемлемых солей.

СОСТАВ С КОНТРОЛИРУЕМЫМ ВЫСВОБОЖДЕНИЕМ

В соответствии с другими вариантами осуществления композиция или микросферы с контролируемым высвобождением могут содержать эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина в качестве активного ингредиента в количестве от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 весовых частей (вес.ч.) (например, от приблизительно 0,8 до приблизительно 6 вес.ч.) в расчете на 100 вес.ч. композиции или микросферы, содержащей: эксендин (такой как эксендин-4), GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина (такой как аналог эксендина-4); биоразлагаемые полимеры; и материалы для покрытия. Например, композиция или микросферы с контролируемым высвобождением могут включать от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 4 частей, от приблизительно 0,1 до приблизительно 3 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 4 частей, от приблизительно 0,5 до приблизительно 3 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 5 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 4 частей, от приблизительно 1 до приблизительно 3 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 5 частей, от приблизительно 2 до приблизительно 4 частей, от приблизительно 3 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 3 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 3 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 3 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 3 до приблизительно 6 частей, от приблизительно 4 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 4 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 4 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 4 до приблизительно 7 частей, от приблизительно 5 до приблизительно 10 частей, от приблизительно 5 до приблизительно 9 частей, от приблизительно 5 до приблизительно 8 частей, от приблизительно 6 до приблизительно 10 частей, приблизительно 6 до приблизительно 9 частей или от приблизительно 7 до приблизительно 10 частей эксендина или терапевтически эффективного аналога и/или GLP-1 или его терапевтически эффективного аналога в весовом отношении, в расчете на 100 весовых частей композиции или микросферы, содержащей эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина; биоразлагаемые полимеры; и материалы для покрытия. Когда количество эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина, содержащегося в композиции или микросферах в соответствии с настоящим изобретением, ниже вышеуказанного диапазона, эффективное действие эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина не может быть достигнуто, а когда количество эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина выше указанного диапазона, начальный выброс эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина увеличивается, вызывая тем самым побочные эффекты вследствие начального выброса, и, таким образом, предпочтительно, чтобы количество эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина находилось в вышеуказанном диапазоне.

Биоразлагаемый полимер относится ко всем полимерам, которые не наносят вреда человеку, поскольку при его введении в организм он может медленно разлагаться и выводиться из организма. Биоразлагаемый полимер может включать один или более (например, один, два, три, четыре, пять, шесть или более), выбираемых из группы, состоящей из полилактида (PLA), полигликолида (PGA), сополимера лактида и гликолида (PLGA), полиортоэфира, полиангидрида, полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона и полиалкилкарбоната, и сополимеров одного или нескольких полимеров и полиэтиленгликоля (PEG), причем один или несколько полимеров могут быть в форме сополимера или простой смеси.

Например, биоразлагаемый полимер может быть одним или несколькими, выбираемыми из группы, состоящей из сополимеров лактида и гликолида (PLGA), состоящих из RG502H (IV (характеристическая вязкость)=0,16-0,24 дл/г), RG503H (IV=0,32-0,44 дл/г) и RG504H (IV=0,45-0,60 дл/г) с соотношением лактид:гликолид 1:1 и RG752H (IV=0,14-0,22 дл/г) с соотношением лактид:гликолид 75:25, полилактидов (PLA), R202H (IV=0,16-0,24 дл/г) и R203H (IV=0,25-0,35 дл/г), которые предоставляются Evnik, Германия; сополимеров лактида и гликолида, 5050DL 2A (IV=0,15-0,25 дл/г), 5050DL 3A (IV=0,25-0,43 дл/г) и 5050DL 4A (IV=0,38-0,48 дл/г), которые представляют собой сополимеры, предоставляемые Evonik (Parsippany, NJ), США, с отношением лактид:гликолид 1:1; и т.п., но эквивалентные полимеры могут быть предоставлены/получены из любого подходящего источника.

В дальнейших вариантах осуществления биоразлагаемый полимер может представлять собой комплекс полимер-сахар, в котором сахар связан с: (1) полимером, выбираемым из группы, состоящей из полилактидов (PLA), полигликолидов (PGA), сополимеров лактида и гликолида (PLGA), полиортоэфиров, полиангидридов, полигидрокси-масляных кислот, поликапролактонов и полиалкилкарбонатов; (2) сополимером по меньшей мере двух полимерных групп; или (3) сополимером полиэтиленгликоля (ПЭГ) и одной полимерной группы.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения комплекс полимер-сахар может относиться к комплексу, в котором полимер является замещенным гидроксильной группой сахара. Сахар может включать моносахариды и полисахариды, которые включают от 1 до 8 сахаридных звеньев, причем каждое сахаридное звено включает от 3 до 6 гидроксильных групп, и сахароспирты с прямой цепью, включающие от 3 до 6 гидроксильных групп и имеющие молекулярную массу 20000 или менее. Сахароспирты могут включать маннит, пентаэритрит, сорбит, рибит и ксилит. Полимер соединяется с сахаром по трем или более гидроксильным группам, присутствующим в сахаре.

Комплекс полимер-сахар в соответствии с вышеуказанным вариантом осуществления обладает свойствами in vivo, подобными таковым полимера, который связан с сахаром, имеет различные скорости разложения в зависимости от типа используемого полимера и разлагается на безвредный полимер и сахар в организме, и, следовательно, он может быть подходящим для биоразлагаемого полимера. В одном варианте осуществления комплекс полимер-сахар может представлять собой комплекс PLA-глюкоза, комплекс PGA-глюкоза или комплекс PLGA-глюкоза, где комплекс PLGA-глюкоза может представлять собой комплекс, имеющий следующую структуру:

В микросферах с контролируемым высвобождением в соответствии с настоящим изобретением слой покрытия, сформированный на их поверхности, позволяет эффективно контролировать начальный выброс эксендина или GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина, предотвращая тем самым побочные эффекты, вызываемые чрезмерным начальным выбросом. Биоразлагаемый полимер может использоваться без какого-либо ограничения вязкости.

В композиции/ составе с контролируемым высвобождением в соответствии с настоящим изобретением биоразлагаемый полимер играет роль матрицы для сохранения активного ингредиента (эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина), причем недостаточно низкая вязкость полимера не позволяет эффективно сохранять активный ингредиент, тем самым увеличивая начальный выброс, а чрезмерно высокая вязкость полимера вызывает уменьшение общего высвобождаемого количества активного ингредиента, тем самым уменьшая его биодоступность. В настоящем изобретении не только биоразлагаемый полимер, но также материалы покрытия, содержащиеся в композиции, играют роль контроля высвобождения лекарственного средства, и, таким образом, можно использовать биоразлагаемый полимер, имеющий относительно низкую вязкость. Следовательно, чтобы эффективно контролировать начальный выброс лекарственного средства и улучшить биодоступность, характеристическая вязкость (IV) биоразлагаемого полимера, которая измеряется для биоразлагаемого полимера, растворенного в хлороформе в концентрации 1% (в отношении веса к объему) при 25°С±0,1°C с использованием вискозиметра Уббелоде, может составлять от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,6 дл/г (например, от приблизительно 0,15 до приблизительно 0,31 дл/г или от приблизительно 0,16 до приблизительно 0,24 дл/г).

В композиции, составе или микросферах настоящего изобретения биоразлагаемый полимер играет роль матрицы для сохранения активного ингредиента во время высвобождения и контроля скорости высвобождения, причем его содержание в композиции или микросферах может составлять от приблизительно 85 до приблизительно 99,89 вес.ч. (например, от приблизительно 91 до приблизительно 99 вес.ч.) в расчете на 100 вес.ч. композиции/ состава или микросфер, содержащих активный ингредиент (эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина), биоразлагаемый полимер(ы) и материал(ы) покрытия.

Материал покрытия используется для предотвращения чрезмерного начального выброса и увеличения биодоступности активного ингредиента, и в микросферах настоящего изобретения он может быть в форме слоя покрытия на их поверхности. Материал покрытия может быть одним или несколькими (например, одним, двумя или тремя), выбираемыми из основных аминокислот, полипептидов и органических азотсодержащих соединений. Основная аминокислота может включать аргинин, лизин, гистидин и их производные. Полипептид может включать от 2 до 10 аминокислот (например, от 2 до 5 аминокислот), включая одну или более (например, одну, две или три), выбираемых из аргинина, лизина и гистидина. Полипептид может включать больше основных аминокислот, чем кислых аминокислот, тем самым проявляя основное свойство. Например, полипептид может представлять собой L-Ala-L-His-L-Lys, L-Arg-L-Phe, Gly-L-His, Gly-L-His-Gly, Gly-L-His-L-Lys L-His-Gly, L-His-Leu, L-Lys-L-Tyr-L-Lys, L-His-L-Val, L-Lys-L-Lys, L-Lys-L-Lys-L-Lys, L-Lys-L-Thr-L-Thr-L-Lys-L-Ser и т.п. Кроме того, органическое азотсодержащее соединение может представлять собой креатин, креатинин, мочевину и т.п.

Содержание материала покрытия, содержащегося в композиции настоящего изобретения или нанесенного на микросферы, может составлять от приблизительно 0,01 до приблизительно 5 весовых частей (например, от приблизительно 0,015 до приблизительно 3 частей, от приблизительно 0,01 до приблизительно 4, от приблизительно 0,01 до приблизительно 3, от приблизительно 0,01 до приблизительно 2, от приблизительно 0,01 до приблизительно 4, от приблизительно 0,01 до приблизительно 2, от приблизительно 0,015 до приблизительно 5, от приблизительно 0,015 до приблизительно 4, от приблизительно 0,015 до приблизительно 2, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5, от приблизительно 0,05 до приблизительно 4, от приблизительно 0,05 до приблизительно 3, от приблизительно 0,05 до приблизительно 2, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5, от приблизительно 0,1 до приблизительно 4, от приблизительно 0,1 до приблизительно 3, от приблизительно 0,1 до приблизительно 2, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5, от приблизительно 0,05 до приблизительно 4, от приблизительно 0,05 до приблизительно 3, от приблизительно 0,05 до приблизительно 2, от приблизительно 1 до приблизительно 5, от приблизительно 1 до приблизительно 4, от приблизительно 1 до приблизительно 3, от приблизительно 1,5 до приблизительно 5, от приблизительно 1,5 до приблизительно 4, от приблизительно 1,5 до приблизительно 3, от приблизительно 2 до приблизительно 5, от приблизительно 2 до приблизительно 4, от приблизительно 3 до приблизительно 5, от приблизительно 3 до приблизительно 4 или от приблизительно 4 до приблизительно 5) по весу, в расчете на 100 вес.ч. композиции или микросфер, содержащих эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина, биоразлагаемый полимер(ы) и материал(ы) покрытия. Эффективный контроль высвобождения лекарственного средства не может быть достигнут, если содержание материала покрытия ниже вышеуказанного диапазона, тогда как эффект контроля начального выброса дополнительно не увеличивается, даже если содержание материала покрытия увеличивается до более высокого значения, чем вышеуказанный диапазон.

Каждая микросфера с контролируемым высвобождением в соответствии с настоящим изобретением может иметь гладкую поверхность, покрытую материалом покрытия, и средний размер от приблизительно 1 до приблизительно 50 мкм (например, от приблизительно 5 до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 1 до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 1 до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 1 до приблизительно 20 мкм, от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкм, от приблизительно 5 до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 5 до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 5 до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 5 до приблизительно 20 мкм, от приблизительно 5 до приблизительно 10 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 10 до приблизительно 20 мкм, от приблизительно 20 до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 20 до приблизительно 40 мкм, от приблизительно 20 до приблизительно 30 мкм, от приблизительно 30 до приблизительно 50 мкм, от приблизительно 30 до приблизительно 40 мкм или от приблизительно 40 до приблизительно 50 мкм). Гладкая поверхность микросферы позволяет достичь эффективного контроля начального выброса и превосходной биодоступности.

В отличие от традиционной формы, микросфера с контролируемым высвобождением или микросфера, приготовленная из композиции/ состава настоящего изобретения, покрыта материалом покрытия, что позволяет предотвратить чрезмерный/вредный начальный выброс и увеличение биодоступности, что не может быть достигнуто в случае традиционной микросферы, содержащей эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина. В частности, чрезмерный/вредный начальный выброс эксендина, GLP-1 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина вызывает различные побочные эффекты, такие как рвота, тошнота, головная боль и т.п., и, таким образом, очень важно снизить начальную величину выброса до 5% или ниже. Микросфера с контролируемым высвобождением или микросфера, приготовленная из композиции (или состава) настоящего изобретения, снижает высвобождаемое количество в течение первых 24 часов до 5% или ниже. Чтобы уменьшить побочные эффекты, вызываемые введением содержащей эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина микросферы с контролируемым высвобождением, начальная величина выброса в течение первого часа может составлять приблизительно 5% или ниже (например, приблизительно 4% или ниже, приблизительно 3% или ниже, приблизительно 2% или ниже, или приблизительно 1% или ниже. Микросферы настоящего изобретения содержат покровный слой из материала покрытия на их поверхности, что позволяет эффективно контролировать начальный выброс, чтобы устранить побочные эффекты, вызываемые чрезмерным/вредным начальным выбросом, и получить длительное и достаточное высвобождение лекарственного средства для достижения превосходной биодоступности.

В варианте осуществления настоящего изобретения состав или микросферы могут, кроме того, содержать наполнители, такие как защитные коллоиды и/или стабилизаторы.

Композиция или микросферы могут, кроме того, содержать один или более защитных коллоидов, выбираемых из поливиниловых спиртов, альбуминов, поливинилпирролидонов, желатинов и т.п. Хотя защитный коллоид не имеет особого эффекта для предотвращения чрезмерного/вредного начального выброса активного ингредиента, содержащегося в микросферах, он играет роль в предотвращении агрегации между микросферами и улучшении диспергируемости. Учитывая такую роль, содержание защитного коллоида может составлять от приблизительно 0,02% (в весовом отношении) до приблизительно 1,0% (в весовом отношении) (например, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,02% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 0,04% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,5%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,3%, от приблизительно 0,05% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,3%, от приблизительно 0,1% до приблизительно 0,2%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,4%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 0,8%, от приблизительно 0,4% до приблизительно 0,6%, от приблизительно 0,6% до приблизительно 1,0%, от приблизительно 0,6% до приблизительно 0,8% или от приблизительно 0,8% до приблизительно 1,0%) в расчете на вес композиции, состава или микросфер, содержащих эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина, биоразлагаемый полимер(ы) и материал(ы) покрытия.

Кроме того, для улучшения стабильности микросфер во время лиофилизации композиция/ состав или микросферы настоящего изобретения могут дополнительно содержать наполнители, выбираемые из маннита, трегалозы, сахарозы, натрий-карбоксиметилцеллюлозы и т.п. в количестве от приблизительно 5% (в весовом отношении) до приблизительно 30% (в весовом отношении), например от приблизительно 10% (в весовом отношении) до приблизительно 20% (в весовом отношении) в расчете на вес композиции или микросфер, содержащих эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина, биоразлагаемый полимер(ы) и материал(ы) покрытия.

Кроме того, композиция, состав или микросфера настоящего изобретения могут дополнительно содержать любые добавки и наполнители, обычно используемые при приготовлении лекарственного средства, вид и содержание которых могут быть легко определены специалистом в соответствующей области техники.

Содержащие эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина микросферы с контролируемым высвобождением, используемые в способах настоящего изобретения, могут быть приготовлены различными способами, например, путем нанесения покрытия на поверхность микросфер путем суспендирования микросфер в растворе материала покрытия во время или после приготовления микросфер, чтобы приготовить микросферы с контролируемым высвобождением. Способ приготовления микросфер может быть выполнен методом двойной эмульсии (W/O/W-методом), методом одной (единственной) эмульсии (O/W методом), методом разделения фаз, методом распылительной сушки и т.п.

В частности, способ приготовления содержащих эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина микросфер с контролируемым высвобождением может включать стадии: смешивания активного(ых) агента(ов) и биоразлагаемого полимера(ов) для получения эмульсия типа «вода в масле» (W/O-типа); или гомогенной смеси; и эмульгирование путем добавления эмульсии или гомогенной смеси в водный раствор материала покрытия для формирования слоя покрытия.

Конкретнее, в случае использования метода двойной эмульсии, способ может включать стадии эмульгирования путем смешивания водного раствора активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера, растворенного в органическом растворителе, с образованием первичной эмульсии (типа «вода в масле», W/O-типа); суспендирования эмульсии в водном растворе материала покрытия для образования эмульсии W/O/W-типа; нагревания эмульсии W/O/W-типа для удаления растворителя и отверждения полученных микросфер; сбора и промывки отверженных микросфер; и лиофилизации микросфер. Органический растворитель может быть любым органическим растворителем, который способен образовывать эмульсию при растворении биоразлагаемого полимера и затем быть смешанным с водным раствором, и, например, он может быть одним или несколькими, выбираемыми из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метиленхлорида и метилэтилкетона (например, метиленхлорида). В этом случае материал покрытия содержится во вторичной водной фазе (внешняя водная фаза эмульсии W/O/W-типа), чтобы сформировать слой покрытия на внешней стороне микросфер, включающих по меньшей мере один активный ингредиент (например, эксендин, GLP-1 или терапевтически эффективный аналог GLP-1 или эксендина-4 или их комбинацию) и биоразлагаемый полимер при удалении органического растворителя.

В качестве альтернативы, если используется метод одной эмульсии, он может включать стадии растворения активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера в органическом растворителе с образованием гомогенной смеси; добавления водного раствора, содержащего материал покрытия, к полученной смеси для образования эмульсии; нагревания эмульсии для удаления растворителя и отверждения полученных микросфер; сбора и промывки отверженных микросфер; и лиофилизации микросфер. Органический растворитель может представлять собой любой органический растворитель, который способен полностью смешиваться с активным ингредиентом(ами) и биоразлагаемым полимером(ами) с образованием гомогенной смеси и смешиваться с водным раствором с образованием эмульсии. Например, органический растворитель может представлять собой смешанный растворитель, в котором смешаны один или несколько, выбираемых из группы, состоящей из спиртов, содержащих от 1 до 5 атомов углерода, ледяной уксусной кислоты, муравьиной кислоты, диметилсульфоксида и н-метилпирролидона, и один или несколько, выбираемых из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метилэтилкетона и метиленхлорида, и, например, в котором смешаны метанол и метиленхлорид. В этом случае, эмульгируя гомогенную смесь биоразлагаемого полимера и активного ингредиента(ов) и добавляя материал покрытия в водный раствор для удаления органического растворителя, на поверхности окончательно полученных микросфер содержится слой покрытия.

Способ приготовления микросфер с контролируемым высвобождением может включать стадии смешивания активного(ых) ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера с образованием эмульсии или гомогенной смеси; затвердевания полученной эмульсии или гомогенной смеси для приготовления первичных микросфер; и суспендирования полученных первичных микросфер в водном растворе материала покрытия для образования слоя покрытия на каждой микросфере.

Способ отверждения не ограничивается и может представлять собой любой способ отверждения, обычно используемый в соответствующей области техники, например метод разделения фаз или метод распылительной сушки. Конкретнее, если на стадии отверждения используется метод разделения фаз, он может включать следующие стадии: смешивания водного раствора активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера, растворенного в органическом растворителе, с образованием эмульсии, или смешивания активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера в смешанном растворителе с образованием гомогенного раствора - смеси; добавления масла, такого как силиконовое масло, к полученной эмульсии или раствору для приготовления первичных микросфер; добавления нерастворителя для биоразлагаемого полимера, такого как смешанный растворитель из спирта, содержащего от 1 до 5 атомов углерода, и алкана, содержащего от 1 до 12 атомов углерода, такого как смешанный растворитель из этанола и гептана, для удаления органического растворителя из микросфер и отверждения микросфер; суспендирования полученных микросфер в водном растворе материала покрытия с образованием слоя покрытия на каждой микросфере; и сбора, промывки и лиофилизации микросфер со сформированным слоем покрытия.

Органический растворитель может быть одним или несколькими (например, одним, двумя, тремя или четырьмя), выбираемыми из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метиленхлорида и метилэтилкетона (например, метиленхлорида). Смешанный растворитель может представлять собой растворитель, в котором смешаны один или несколько (например, один, два, три, четыре, пять или более), выбираемых из группы, состоящей из по меньшей мере одного спирта, содержащего от 1 до 5 атомов углерода, ледяной уксусной кислоты, муравьиной кислоты, диметилсульфоксида и н-метилпирролидона, и один или несколько (например, один, два, три или четыре), выбираемых из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метилэтилкетона и метиленхлорида, (например, смешанный растворитель из метанола и метиленхлорида).

В качестве альтернативы, если используется способ распылительной сушки, способ может включать стадии: смешивания водного раствора активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера, растворенного в органическом растворителе, с образованием эмульсии, или смешивания активного ингредиента(ов) и биоразлагаемого полимера в одном растворителе или смешанном растворителе с образованием гомогенного раствора - смеси; сушки распылением полученной эмульсии или раствора для приготовления первичных микросфер; суспендирования полученных первичных микросфер в водном растворе материала покрытия для образования слоя покрытия на каждой микросфере; и промывки и лиофилизации микросфер со сформированным слоем покрытия.

Органический растворитель может быть одним или несколькими (например, одним, двумя, тремя или четырьмя), выбираемыми из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метиленхлорида и метилэтилкетона (например, метиленхлорида). Единственный растворитель может быть одним или несколькими (например, одним, двумя, тремя, четырьмя или пятью), выбираемыми из группы, состоящей из ледяной уксусной кислоты и муравьиной кислоты, и смешанный растворитель может представлять собой растворитель, в котором смешаны один или несколько (например, один, два, три, четыре, пять или более), выбираемых из группы, состоящей из по меньшей мере одного спирта, содержащего от 1 до 5 атомов углерода, ледяной уксусной кислоты, муравьиной кислоты, диметилсульфоксида и н-метилпирролидона, и один или несколько, выбираемых из группы, состоящей из хлороформа, этилацетата, метилэтилкетона и метиленхлорида, (например, смешанный растворитель из метанола и метиленхлорида).

Способ может, кроме того, включать стадию добавления защитного коллоидного материала любым обычным способом, например, защитный коллоидный материал может быть добавлен во время стадии покрытия микросфер материалом покрытия.

Концентрация материала покрытия, растворенного в водной фазе или в водном растворе, может составлять от приблизительно 0,01 М до приблизительно 1 М (например, от приблизительно 0,1 М до приблизительно 0,5 М, от приблизительно 0,01 М до приблизительно 0,8 М, от приблизительно 0,01 М до приблизительно 0,6 М, от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,4 М, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 М, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,8 М, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,6 М, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,4 М, от приблизительно 0,2 до приблизительно 1 М, от приблизительно 0,2 М до приблизительно 0,8 М, от приблизительно 0,2 М до приблизительно 0,6 М, от приблизительно 0,2 М до приблизительно 0,4 М, от приблизительно 0,4 до приблизительно 1 М, от приблизительно 0,4 М до приблизительно 0,8 М, от приблизительно 0,4 М до приблизительно 0,6 М, от приблизительно 0,6 до приблизительно 1 М, от приблизительно 0,6 до приблизительно 0,8 М или от приблизительно 0,8 до приблизительно 1 М). Более низкая концентрация материала покрытия, чем указанный выше диапазон, не позволяет полностью покрыть поверхность микросфер материалом покрытия, тогда как более высокая концентрация материала покрытия, чем указанный выше диапазон, приводит к перенасыщенному раствору материала покрытия, что не может привести к улучшению эффекта контроля начального выброса, и, таким образом, концентрация материала покрытия может находиться в пределах вышеуказанного диапазона.

ВВЕДЕНИЕ

Композицию с контролируемым высвобождением настоящего изобретения можно вводить пероральным или парентеральным путем (например, парентеральным путем), таким как внутривенный путь, подкожный путь, внутримышечный путь, внутрибрюшинный путь и т.п. Следовательно, в одном варианте осуществления настоящего изобретения композицию или состав с контролируемым высвобождением можно применять в виде раствора для инъекций в форме дисперсного раствора. Эффективное количество композиции может быть подходящим образом отрегулировано в соответствии с возрастом субъекта, видом и серьезностью заболевания, а также состоянием субъекта, и доза активного ингредиента в композиции может составлять от приблизительно 0,01 до приблизительно 100 мкг/кг/день (например, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мкг/кг/день), которые можно вводить сразу или дробно за несколько раз. Точное требуемое количество будет варьировать от полипептида к полипептиду и от субъекта к субъекту, в зависимости от вида, возраста и общего состояния субъекта, тяжести заболевания, которое подвергают лечению, конкретного используемого полипептида, способа его введения и т.п. Таким образом, невозможно указать точное «инсулинотропное количество» или количество, применимое для лечения болезни или повреждения нейронов. Однако соответствующее количество может быть определено специалистом со средним уровнем компетентности в данной области техники с использованием только обычных экспериментов.

Специалист в данной области техники поймет, как контролировать эффективность лечения, и как соответствующим образом корректировать лечение. Например, уровни глюкозы в крови можно контролировать с использованием нормогликемии, которая является оптимальным эффектом лечения. Если уровни глюкозы в крови выше предпочтительных уровней, то количество вводимого полипептида должно быть увеличено, а, если уровни глюкозы в крови ниже предпочтительных уровней, тогда количество вводимого полипептида будет уменьшено.

Соединения можно вводить перорально, внутривенно, внутримышечно, внутрибрюшинно, местно, чрескожно, локально, системно, интравентрикулярно, интрацеребрально, субдурально или интратекально. Специалист в данной области техники должен знать, как модифицировать способ введения, фармакологический носитель или другие параметры для оптимизации инсулинотропных эффектов. Количество вводимого активного соединения будет, конечно, зависеть от субъекта, подвергаемого лечению, веса субъекта, способа введения и суждения лечащего врача.

В зависимости от предлагаемого способа введения фармацевтические композиции могут быть в форме твердых, полутвердых или жидких лекарственных форм, таких как, например, таблетки, суппозитории, пилюли, капсулы, порошки, жидкости, суспензии, лосьоны, кремы, гели или т.п., например, в стандартной лекарственной форме, подходящей для однократного введения точной дозы. Композиции будут включать, как отмечено выше, эффективное количество выбранного лекарственного средства в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем и, кроме того, могут включать другие лекарственные средства, фармацевтические агенты, носители, адъюванты, разбавители и т.д. Смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, последнее издание, EW Martin Mack Pub. Co., Easton, PA, в котором раскрыты типичные носители и общепринятые способы приготовления фармацевтических композиций, которые могут использоваться в сочетании с приготовлением составов полипептидов, и который включен сюда посредством ссылки. В случае твердых композиций общепринятые нетоксичные твердые носители включают, например, фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, талька, целлюлозы, глюкозы, сахарозы, карбоната магния и т.п. Жидкие фармацевтически вводимые композиции могут быть получены, например, путем растворения, диспергирования и т.д. активного соединения, описанного здесь, и необязательных фармацевтических адъювантов в наполнителе, таком как, например, вода, солевой водный раствор декстрозы, глицерин, этанол и т.п., чтобы тем самым образовать раствор или суспензию. При желании вводимая фармацевтическая композиция может также содержать незначительные количества нетоксичных вспомогательных веществ, таких как смачивающие вещества или эмульгаторы, рН-буферные агенты и т.п., например, ацетат натрия, сорбитмонолаурат, триэтаноламин-ацетат натрия, олеат триэтаноламина и т.д. Фактические способы приготовления таких лекарственных форм известны или будут очевидны специалистам в данной области техники; например, смотрите Remington's Pharmaceutical Sciences, ссылка на который приведена выше.

Для перорального введения тонкоизмельченные порошки или гранулы могут содержать разбавляющие, диспергирующие и/или поверхностно-активные вещества и могут быть представлены в воде или в сиропе, в капсулах или саше в сухом состоянии или в неводном растворе или суспензии, в которую могут быть включены суспендирующие агенты, в таблетках, в которые могут быть включены связующие и смазывающие вещества, или в суспензии в воде или сиропе. Там, где это желательно или необходимо, могут быть включены ароматизаторы, консерванты, суспендирующие, загущающие вещества или эмульгаторы. В некоторых вариантах осуществления форма для перорального введения представляет собой таблетки или гранулы, которые могут быть покрыты оболочкой. Парентеральное введение, если оно используется, как правило, характеризуется инъекцией.

Инъецируемые составы могут быть приготовлены в обычных формах, либо в виде жидких растворов или суспензий, в твердых формах, подходящих для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией, либо в виде эмульсий. Совсем недавно пересмотренный подход для парентерального введения включает использование системы с медленным высвобождением или с замедленным высвобождением, так что поддерживается постоянный уровень дозировки. Смотрите, например, патент США с № 3710795, который включен сюда посредством ссылки.

Для местного введения могут использоваться жидкости, суспензии, лосьоны, кремы, гели или т.п. при условии, что активное соединение может быть доставлено на поверхность кожи.

ПРИМЕРЫ

Следующие примеры представлены для предоставления специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники полного раскрытия и описания того, каким образом заявленные здесь соединения, композиции, изделия, устройства и/или способы изготавливаются и оцениваются, и предназначены быть просто примером раскрытия настоящего изобретения и не предназначены для ограничения объема того, что авторы настоящего изобретения рассматривают как раскрытие своего изобретения. Были предприняты усилия для обеспечения точности в отношении чисел (например, количеств, температуры и т.д.), но следует учитывать некоторые ошибки и отклонения.

Статистика : Значения представлены в виде средних значений ± S.E.M. (стандартная ошибка среднего) Для определения нормальности распределений использовался критерий Колмогорова-Смирнова. T-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни, точный критерий Фишера или одно- и двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) использовались для статистического анализа, как указано в результатах. Ранговый дисперсионный анализ использовался при нарушении предположения о нормальности. Для всех парных множественных сравнений использовался ретроспективный критерий Ньюмена-Кейлса или критерий Данна. Статистически значимая разница определялась как p<0,05.

Пример 1. Фармакокинетика эксендина-4 и состава с замедленным высвобождением в плазме .

PT302, состав с замедленным высвобождением эксендина-4, содержит смесь полимеров (98%) и эксендина-4 (2%). Уровни эксенатида в плазме анализировали после инъекции состава с замедленным высвобождением эксендина-4 (PT302). В частности, фармакокинетику однократной дозы PT302 исследовали с использованием 6 взрослых (возрастом 9 недель) самцов крыс Sprague-Dawley. PT302 был недавно растворенным в разбавителе, и 2 мг/кг вводили подкожно. Кровь собирали через 0, 0,5 и 1 час после инъекции, а также в дни 1, 3, 5, 7, 9, 11, 14, 18, 21 и 26 после инъекции. Уровни эксендина-4 в плазме определяли с помощью набора Peptron Exenatide EIA (Peptron, Daejeon, Южная Корея). Данные представлены на фиг. 1А с Cmax=1,85 нг/мл, Tmax=12,5 дней и AUC=18,55 нг*д/мл (значения рассчитаны по индивидуальным данным всех 6 животных). Как видно на фиг. 1А, состав с замедленным высвобождением PT302 обеспечивает пролонгированные уровни эксендина-4 в плазме в результате однократной подкожной инъекции, приемлемые для схемы дозирования от одной до двух недель.

Фармакокинетику однократной дозы PT302 в различных дозировках (2,4 мг/кг, 4,8 мг/кг и 9,6 мг/кг) исследовали с использованием 6 взрослых (возрастом 9 недель) самцов крыс Sprague-Dawley на группу. PT302 был недавно растворенным в разбавителе, и его вводили, как указано, подкожно. Кровь собирали через 0, 0,5 и 1 час после инъекции, а также через 1, 3, 7, 10, 14, 17, 21, 24, 28 и 31 день после инъекции. Уровни в плазме эксендина-4 анализировали количественно, как обсуждалось выше. Данные представлены на фиг. 1B с Cmax=2,23 нг/мл, Tmax=14,83 дня и AUC=21,13 нг*д/мл для дозы 2,4 мг/кг; Cmax=5,21 нг/мл, Tmax=16,17 дней и AUC=49,46 нг*д/мл для дозы 4,8 мг/кг; и Cmax=9,42 нг/мл, Tmax=17,17 дней и AUC=87,14 нг*д/мл для дозы 9,6 мг/кг. На фиг. 1В показано, что состав с замедленным высвобождением PT302 обеспечивает пролонгированные уровни эксендина-4 в плазме в результате однократной подкожной инъекции, непосредственно связанные с уровнем дозы вводимого PT302.

PT304, состав эксендина-4 с замедленным высвобождением, содержит смесь полимеров (96%) и эксендина-4 (4%). Уровни эксенатида в плазме анализировали после инъекции 6 взрослым (возрастом 9 недель) самцам крыс Sprague-Dawley состава эксендина-4 с замедленным высвобождением (PT304). PT302 был недавно растворенным в разбавителе, и подкожно вводили 4 мг/кг. Кровь собирали через 1 час и 3 часа после инъекции, а также в дни 1, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 25, 28, 32, 35, 39 и 42 после инъекции. Уровни эксендина-4 в плазме определяли с помощью набора Peptron Exenatide EIA. Данные представлены на фиг. 2 с Cmax=3,82 нг/мл, Tmax=14,17 дней и AUC=48,34 нг*д/мл (значения рассчитаны по индивидуальным данным всех 6 животных). Как видно на фиг. 2, состав с замедленным высвобождением PT304 обеспечивает пролонгированные уровни эксендина-4 в плазме в результате однократной подкожной инъекции, приемлемые для схемы дозирования от двух до четырех недель.

Фармакокинетика PT302 в течение 10-недельного периода была исследована у 10 взрослых (возрастом 9 недель) крыс Sprague-Dawley на группу. Крысам подкожно инъецировали дозу 2 мг/кг PT302 раз в неделю или 4 мг/кг PT304 раз в две недели. PT302 и PT304 готовили, как описано выше, и кровь собирали через 1 час и 3 часа после первой инъекции, а также в дни 1, 3, 5, 7, 10, 14, 21, 28, 35, 42, 49, 56, 63, 70, 77, 84 и 91 день после первой инъекции. Уровни эксендина-4 в сыворотке анализировали количественно, как обсуждалось выше, и это представлено на фиг. 3. Крысы, которым раз в неделю инъецировали составы, имели Cmax=5,27 нг/мл, Tmax=51,60 дней и AUC=236,42 нг*д/мл, в то время как крысы, которым составы инъецировали раз в две недели, имели Cmax=5,08 нг/мл, Tmax=47,89 дней и AUC=211,51 нг*д/мл.

Пример 2. Предварительное лечение PT302 уменьшает опосредованное метамфетамином вращение в модели болезни Паркинсона, индуцированной 6-OHDA, на крысе.

Животных подвергали лечению носителем (9 крыс), 0,4 мг/кг PT302 (низкая доза; 9 крыс) или 2 мг/кг PT302 (высокая доза; 10 крыс) в дни, определенные на фиг. 4A (т.е. в дни 16 и 2 до одностороннего поражения с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга и в дни 12, 26 и 40 после поражения). Как показано на фиг. 4А и 4В, крыс подвергали опосредованному метамфетамином вращению в дни 20, 30 и 45 после поражения и подвергали эвтаназии в день 47. Для вызова крыс анестезировали хлоралгидратом (400 мг/кг, внутрибрюшинно) и помещали в стереотаксическую раму. 6-OHDA (2,76 мкг/мкл х 5 мкл в 0,9% NaCl, содержащем 0,2 мг/мл аскорбиновой кислоты) односторонне инъецировали в медиальный пучок переднего мозга (-4,4 мм AP, 1,2 мм ML относительно брегмы и 8,4 мм ниже черепа) на протяжении 4 минут с помощью микрошприца Гамильтона, удерживаемого стереотаксически. Микрошприц опускали до желаемого локуса-мишени в головном мозге, используя микроманипуляторы, прикрепленные к стереотаксической раме. Скорость инъекции (0,5 мкл/мин) контролировали с помощью шприцевого насоса (Micro 4, WPI, Sarasota, FL). Иглу удаляли через 5 минут после инъекции. Кусочек костного воска помещали на трепанационное отверстие для предотвращения утечки жидкости. Рану сшивали или обрезали. Температуру тела контролировали с помощью термисторного датчика и поддерживали при 37°C с помощью грелки-подушки во время анестезии. После выхода из наркоза температуру тела дополнительно поддерживали на уровне 37°C в течение 3 часов, используя термостат с контролируемой температурой.

Индуцированное метамфетамином вращательное поведение [Liu DM, Lin SZ, Wang SD, Wu MI, Wang Y. Xenografting human T2 sympathetic ganglion from hyperhidrotic patients partially restores catecholaminergic functions in hemi-Parkinsonian athymic rats. Cell Transplant 1999;8:563-91; and Luo Y, Hoffer BJ, Wang Y. Rotation, Drug-induced. In: Kompoliti K, Verhagen Metman L, editors. Encyclopedia of Movement Disorders. Oxford: Academic Press, 2010. p 49-51] оценивали с использованием 8-канальной системы ротометра (RotoMax, AccuScan Instruments, Inc). Животным вводили метамфетамин (2,5 мг/кг) через 6 дней после поражения с помощью 6-OHDA, как описано ранее [Yin LH, Shen H, Diaz-Ruiz O, Backman CM, Bae E, Yu SJ, Wang Y. Early post-treatment with 9-cis retinoic acid reduces neurodegeneration of dopaminergic neurons in a rat model of Parkinson's disease. BMC Neurosci 2012;13:120]. Метамфетамин является непрямым агонистом, который вызывает выброс дофамина в головном мозге. Крысы, которые получают односторонние инъекции 6-OHDA в нигростриарную дофаминергическую систему, используются в качестве модели для PD. У этих животных наблюдается ипсилатеральное вращение после введения непрямых агонистов дофамина (таких как метамфетамин) и контралатеральное вращение после введения прямых агонистов дофамина (таких как апоморфин). Такое поведение связано с односторонними изменениями экспрессии дофаминергических маркеров в полосатом теле.

Как показано на фиг. 4B, значительно уменьшало вращение лечение PT302 как в высокой, так и в низкой дозе в группе лечения PT302 (p=0,018, F2, 87=4,309, двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) в группе низкой дозы) по сравнению с носителем. Ретроспективный тест Ньюмена-Кейлса показал, что высокая доза PT302 значительно ослабляла опосредованное метамфетамином вращение (р=0,037). Таким образом, продолжительное, устойчивое введение эксендина-4 в форме PT302 значительно смягчало поведенческие эффекты, вызванные односторонним поражением с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга у крыс (в хорошо охарактеризованной модели PD на животном), обеспечивая нейропротективную активность.

Уровни в плазме эксендина-4 анализировали количественно, как обсуждалось выше. Как показано на фиг. 4C, средний уровень эксендина-4 в плазме составлял 30,845 пг/мл (n=10) у крыс с высокой дозой и 8,990 пг/мл (n=9) у крыс с низкой дозой. Однако при удалении резко выделяющихся крыс/измерений (крыс 1, 10 и 12) средний уровень эксендина-4 в плазме составлял 5596 пг/мл (n=8) у крыс с высокой дозой и 574 пг/мл (n=8) у крыс с низкой дозой.

Пример 3. Последующее лечение PT302 уменьшало индуцированное метамфетамином вращательное поведение у крыс с поражением с помощью 6-OHDA.

Использование одностороннего поражения с помощью 6-OHDA медиального пучка переднего мозга в модели PD на грызуне, описанного в примере 2, может сочетаться с последующим лечением потенциальным лекарственным средством, как показано на схеме на фиг. 5A. В этом случае у грызунов вызывается одностороннее поражение с помощью 6-OHDA (0 дней), и лечение начинается через 6 дней после этого. Это более сложная модель PD для лечения грызунов, поскольку гибель дофаминергических клеток уже началась и продолжается до начала лечения. У девятнадцати крыс было вызвано поражение, как описано выше. Индуцированное метамфетамином вращение исследовали, как обсуждалось выше, при этом животные, которые вращались со скоростью, превышающей 300 оборотов в час, были разделены на 2 группы, чтобы скорректировать групповое вращательное поведение для групп носителя и PT302 перед началом лечения. Как показано на фиг. 5А, индуцированное метамфетамином вращение исследовали через 6, 20, 30 и 45 дней после поражения, и животные (взрослые самцы крыс Sprague-Dawley - в возрасте 2 месяца по прибытии) были подвергнуты лечению носителем (подкожно, n=11) или PT302 (100 мг/кг, содержащих 2,0 мг/кг эксендина-4, подкожно, n=8) в дни 6, 20 и 34 после поражения с помощью 6-OHDA. PT302 готовили, как описано выше. Животных умерщвляли в день 47 после поражения. Образцы крови и головного мозга собирали, а плазму отделяли и хранили (-80°С). Эксендин-4 измеряли в собранной плазме.

Как показано на фиг. 5В, PT302 значительно уменьшал индуцированное метамфетамином вращательное поведение у крыс с односторонним поражением с помощью 6-OHDA (p=0,032, двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA)) по сравнению с носителем в качестве контроля.

Тирозингидроксилазу (TH) исследовали иммуногистохимически. В частности, серийный криостатные срезы всего головного мозга были сделаны толщиной 25 мкм. Одну серию, состоящую из каждого шестого среза, окрашивали на TH. Для контроля изменчивости окрашивания образцы от всех экспериментальных групп включали в каждую партию и подвергали реакции вместе в чистом луночном планшете в одинаковых условиях. Срезы промывали в 0,1 М фосфатном буфере (PB), блокировали 4% бычьим сывороточным альбумином (BSA) и 0,3% Triton X-100 в 0,1M PB. Затем срезы инкубировали в первом антителе (мышином моноклональном антителе против TH, разведенном в 4% BSA и 0,3% Triton X-100 в 0,1 М PB, в концентрации 1:100; Chemicon, Temecula, CA) в течение 17-19 часов при 4°С. Затем срезы промывали в 0,1 М PB и инкубировали во вторых антителах в течение 1 часа, затем инкубировали в течение 1 часа с комплексом авидин-биотин-пероксидаза хрена. Срезы размещали на предметных стеклах и покрывали стеклами. Контрольные срезы инкубировали без первых антител.

TH-иммунореактивность в полосатом теле измеряли с помощью ImageJ и усредняли, исходя из 3 срезов головных мозга, выбранных так, чтобы была видна передняя комиссура. TH-иммунореактивность в черной субстанции измеряли каждые 360 мкм по всему среднему мозгу (от брегмы - 4,2 мм до -6,0 мм). Всего было использовано 5 срезов головного мозга от каждого животного. Объем черной субстанции анализировали по методу Кавальери.

PT302 снижал 6-OHDA-опосредованную дофаминергическую нейродегенерацию в полосатом теле. Репрезентативное иммуноокрашивание на ТН в полосатом теле и уровни эксендина-4 в плазме у 3 крыс (#866, 883, 886), получавших носитель, и 3 крыс (#881, 875, 882), получающих PT302, представлены на фиг. 5C (концентрации эксендина-4 в плазме у этих же животных были определены и также отмечены на фиг. 5C). Как показано на фиг. 5D, инъекция 6-OHDA значительно снижала TH-иммунореактивность в полосатом теле у животных, получавших носитель, в то время как PT302 значительно увеличивал TH-иммунореактивность в пораженном полосатом теле (*p<0,001, двухфакторный ANOVA). L=пораженная сторона; non-L=непораженная сторона; veh=животные, получающие носитель; PT=PT302.

TH-иммунореактивность в черной субстанции измеряли с помощью ImageJ и усредняли, исходя из 3 срезов головного мозга, выбранных так, чтобы была видна передняя комиссура. Репрезентативное TH-иммуноокрашивание от животных, получающих носитель (крысы #866, #883, #886) или PT302 (крысы #881, #875, #882), представлено на фиг. 5E (также представлены уровни эксендина-4 в плазме у этих же животных). ТН-иммунореактивность в черной субстанции анализировалась количественно каждые 360 мкм от брегмы -4,2 мм до -6 мм, и это представлено на фиг. 5F. Инъекция 6-OHDA значительно снижала ТН-иммунореактивность в черной субстанции у животных, получавших носитель, тогда как PT302 значительно уменьшал потерю ТН-иммунореактивности в пораженной черной субстанции (*p<0,001, двухфакторный ANOVA). L = пораженная сторона; non-L = непораженная сторона; veh = животные, получавшие носитель; PT=PT302.

Последующее лечение PT302 защищает TH+ нейроны в пораженной черной субстанции. Делали срезы головного мозга, и иммуногистохимический анализ проводили, как описано выше. TH+ нейроны были обнаружены на непораженной стороне мозга (фиг. 5G и 5H). В черной субстанции на пораженной стороне головного мозга почти не были обнаружены TH+ нейроны или волокна (крыса #886; фиг. 5I). Лечение PT302 частично защищало TH+ нейроны (фиг. 5J, 5K и 5L).

Опосредованная эксендином-4 защита в ТН нейронах связана с уровнем эксендина 4 в плазме. На фиг. 5M показана значимая корреляция, обнаруженная между TH-иммунореактивностью в полосатом теле после приведения (т.е. пораженная/непораженная сторона) и уровнями эксендина 4 в плазме у тех же животных (р=0,002, R=0,663). На фиг. 5L показана значимая корреляция, наблюдаемая между уровнями эксендина 4 в плазме и TH-иммунореактивностью в черной субстанции на пораженной стороне (р<0,001, R=0,842).

Пример 4. Предварительное лечение PT302 уменьшает опосредованное метамфетамином вращение в индуцированной 6-OHDA модели PD на крысе.

Как показано на фиг. 6А, животные получали подкожно Ex-4 (5 мкг/кг, дважды в день) или PT302 (0,4 мг/кг) за 7 дней до и через 7 дней после поражения с помощью 6-OHDA, как описано выше. Используемая в этом исследовании доза эксендина-4, равная 5 мкг/кг дважды в день, выше, чем можно добиться у людей (смотрите таблицу 1 ниже), а более низкая доза, приблизительно равная 1 мкг/кг дважды в день, эквивалентна как дозе для человека, так и дозе PT302, используемой в исследовании. Лечение и Ex-4 (5 мкг/кг, дважды в день), и PT302 (0,4 мг/кг) значительно уменьшало вращение (р=0,005 в группе Ex-4 и 0,002 в группе PT302) у крыс с поражениями с помощью 6-OHDA (фиг. 6B).

Предварительное лечение или эксендином-4, или PT302 защищало от 6-OHDA-опосредованной дофаминергической нейродегенерации в черной субстанции. Репрезентативная TH-иммунореактивность от животных - ложных контролей и животных с поражениями с помощью 6-OHDA, получающих носитель, Ex-4 (5 мкг/кг, дважды в день) или PT302 (0,4 мг/кг), представлена на фиг. 6C. Инъекция 6-OHDA значительно уменьшала TH-иммунореактивности на стороне поражения (отмечено как ipsi на фиг. 6C). Репрезентативная TH-иммунореактивность в черной субстанции была проанализирована количественно и представлена на фиг. 6D. Лечение PT302 и Ex-4 значительно снижало потерю TH-иммунореактивности на стороне с 6-OHDA-поражением (по оценке путем представления TH-иммунореактивности в виде отношения иммунореактивности, присутствующей на стороне поражения (ipsi), в процентах от иммунореактивности, присутствующей у того же животного на контрольной непораженной стороне (contra)).

Пример 5. Последующее лечение PT302 уменьшает опосредованное метамфетамином вращение в модели болезни Паркинсона, индуцированной 6-OHDA, на крысе.

Животные получали Ex-4 (1 мкг/кг, дважды в день со дня 2) или PT302 (0,4 мг/кг, один раз в день 2) после поражения с помощью 6-OHDA, и опосредованное метамфетамином вращательное поведение исследовали в день 9 после поражения, как описано выше (фиг. 7А). Как показано на фиг. 7B, PT302 значительно ослаблял вращательное поведение у крыс с односторонним поражением с помощью 6-OHDA (p=0,0075). Напротив, эксендин-4 не ослаблял вращательное поведение у крыс с односторонним поражением с помощью 6-OHDA. Таким образом, использование эксендина-4 в эквивалентной для человека дозе (1 мкг/кг дважды в день у крысы) оказалось неэффективным в уменьшении индуцированного метамфетамином вращения, в то время как PT302 в переносимой человеком дозе оказался эффективным в модели PD, индуцированной 6-OHDA, на крысе. Когда доза эксендина-4 была повышена до эквивалента, который выше, чем достигаемая у человека доза, (5 мкг/кг дважды в день, как в примере 4), эксендин-4 мог обеспечить смягчение нарушений, вызванных 6-OHDA. Напротив, эквивалентная клинически переносимая доза PT302 обеспечивает благоприятное действие как в примере 4, так и в примере 5.

Пример 6. Последующее лечение PT302 улучшало токсин-индуцированный поведенческий дефицит в модели PD, индуцированной MPTP, на мыши.

Животные получали Ex-4 (16,7 мкг/кг, дважды в день с дня 6) или PT302 (0,6 мг/кг, в дни на 6, 20 и 34) после индукции паркинсонизма с помощью MPTP, как описано выше (фиг. 8A). В частности, паркинсонизм был индуцирован в результате системного введения 30 мг/кг MPTP ежедневно в течение 5 дней. Смотрите, например, Filichia E, Hoffer B, Qi X, Luo Y. Inhibition of Drp1 mitochondrial translocation provides neural protection in dopaminergic system in a Parkinson's disease model induced by MPTP. Sci Rep. 2016; 6:32656. Лечение или Ex-4, или PT302 начинали через один день после первой дозы MPTP и продолжали в течение 18 дней. Выбранные дозы Ex-4 (16,7 мкг/кг подкожно дважды в день) и PT302 (0,4 мг/кг однократная подкожная доза) были эквивалентны по доставляемому количеству Ex-4 и обеспечили 601,2 мкг/кг и менее 600 мкг/кг, соответственно, за 18 дней лечения. Тест на сцепление с проволокой использовался для оценки двигательной координации всех групп животных в день 18. Тест на сцепление с проволокой (также известный как тест на длительность захвата лапой (PaGE) и тест регистрации силы захвата) часто используется в качестве показателя силы двигательных мышц. PaGE предназначен для оценки силы захвата у мышей, что может свидетельствовать о снижении двигательных навыков, и был выполнен здесь, как описано Jessica AL и др. (Jessica A. L. Hutter-Saunders, Howard E. Gendelman, R. Lee Mosley. Murine Motor and Behavior Functional Evaluations for Acute 1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-Tetrahydropyridine (MPTP) Intoxication. J Neuroimmune Pharmacol. 2012; 7(1): 279-288). Вкратце, каждую мышь помещали на крышку из проволоки обычной клетки для грызунов; крышку осторожно встряхивали, чтобы вызвать захват, и перевертывали вверх дном (180°). Время ожидания, пока мышь не расцепит обе задние конечности, измерялось в секундах. Каждую мышь тестировали три раза с произвольным максимумом 240 с, и регистрировали наибольшее время ожидания до падения или отцепления обеих задних конечностей (Jessica, et al. 2012).

Как показано на фиг. 8B, введение токсина для дофаминергических клеток, MPTP, приводило к значительному сокращению времени ожидания в тесте на сцепление (MPTP: 94,5 с по сравнению с объединенной контрольной группой без MPTP: 148,3 с; p=0,02). PT302 значительно увеличивал время до падения с проволоки у мышей, получавших МРТР (118,3 с, статистически не отличается от значения у объединенной контрольной группы), тогда как эксендин-4 (вводимый дважды в день способом, подобным использованию Byetta человеком (т.е. Ex-4 с немедленным высвобождением)) не уменьшал вызванный токсином поведенческий дефицит у мышей, получавших МРТР (72,9 с, р+0,01 по сравнению со значением у объединенной контрольной группы) (фиг. 8В: во всех группах число мышей было между 7 и 10).

Пример 7. Доставка Ex-4 в центральную нервную систему с помощью эксендина-4 с замедленным высвобождением эффективна для достижения терапевтических количеств эксендина-4 в спинномозговой жидкости.

Эксендин-4 (инъекция и мини-насос) и состав с замедленным высвобождением эксендина-4 (РТ302) вводили, как описано в таблице 1, взрослым самцам крыс Sprague-Dawley (возрастом 9 недель), которые использовались для этого исследования. Кровь и спинномозговую жидкость (CSF) собирали в день 14 после первой инъекции эксендина-4 для измерения уровней эксендина-4. Уровни эксендина-4 в плазме и CSF анализировали количественно, как описано выше. Как показано в таблице 2, эксендин-4 был обнаружен в плазме и CSF группы введения состава с замедленным высвобождением и в группе введения эксендина-4 с помощью мини-насоса, в то время как уровень эксендина-4 был ниже определяемых пределов в CSF в группе введения эксендина-4 дважды в день (BID, немедленное освобождение). Это отличается от высоких уровней эксендина-4, обнаруженных в плазме этой группы введения эксендина-4. Отношения уровней CSF/плазма находились в диапазоне от 0,0081 (или 0,81%) до приблизительно 0,0412 (или 4,12%), при этом среднее значение, равное 0,018 (или 1,8%), отмечали при введении с помощью насоса эксендина-4 в дозах в диапазоне 3,5-15 пМ/кг/мин. Аналогично, отношение уровней в CSF/плазме варьировало от 0,0117 (или 1,17%) до приблизительно 0,016 (или 1,6%) у животных, которым вводили PT302 0,46-2,0 мг/кг/14 дней. Эти данные демонстрируют, что замедленное высвобождение эксендина-4 обеспечивает более высокие уровни эксендина-4 в ЦНС.

Таблица 1. Экспериментальная процедура

Ex-4 дважды в день (немедленное высвобождение	Ex-4 в день 16, мини-насос	РТ302	Рациональная	Животные
2,3 мкг/кг/день (1,15 дважды в день)	3,5 пМ/кг/мин	0,46 мг/кг/14 дней	Суточная доза, пересчет	5 крыс/группу
4,6 мкг/кг/день (2,3 дважды в день)	7,0 пМ/кг/мин	0,92 мг/кг/14 дней	Суточная доза х2	5 крыс/группу
10,0 мкг/кг/день (5 дважды в день)	15 пМ/кг/мин	2,0 мг/кг/14 дней	Равносильный уровень в плазме	5 крыс/группу

Таблица 2. Уровни в плазме и спинномозговой жидкости у крыс, получавших эксендин-4 с помощью мини-насоса, PT302 и эксендин-4

состав	Доза	Плазма	CSF	Отношение CSF/плазма
Насос (низкая скорость)	3,5 пМ/кг/мин	394,8484	14,88721	0,041279
Насос (средняя)	7,0 пМ/кг/мин	4293,409	35,0529	0,008159
Насос (высокая)	15 пМ/кг/мин	7899,634	137,688	0,0185
РТ302 (низкая доза)	0,46 мг/кг/14 дней	1853,329	18,28185	0,01612
РТ302 (средняя)	0,92 мг/кг/14 дней	4438,496	54,37036	0,012756
РТ302 (высокая)	2,0 мг/кг/14 дней	2316,801	29,98072	0,011789
Ex-4 (низкая)	2,3 мкг/кг/день (1,15 дважды в день)	93,479	Ниже НПКО (нижнего предела количественного анализа)	Нет данных
Ex-4 (средняя)	4,6 мкг/кг/день (2,3 дважды в день)	576,886	Ниже НПКО	Нет данных
Ex-4 (высокая)	10,0 мкг/кг/день (5 дважды в день)	5819,282	Ниже НПКО	Нет данных

Пример 8. Лечение эксенатидом с замедленным высвобождением мышей с легкой черепно-мозговой травмой (mTBI) улучшает распознавание новых объектов.

Травму головы наносили с использованием устройства для нанесения травмы методом падающего груза, как описано ранее (Tweedie et al. 2007). Устройство состоит из металлической трубки (длина 90 см, внутренний диаметр 1,3 см) и губки под трубкой для поддержки головы мышей. Мышей слегка анестезировали ингаляцией изофлурана и помещали под устройство. Металлический вес (30 грамм) был сброшен с верхней части трубки для нанесения удара в голову мыши с височной стороны между углом глаза и ухом. Сразу после нанесения травмы мышей помещали обратно в их первоначальную клетку для выздоровления. Эта процедура нанесения травмы головы хорошо переносится мышами и приводит к диффузной потере нейронов в гиппокампе и коре головного мозга на стороне травмы и сопровождается когнитивными нарушениями в тестах на зрительную и пространственную память (Deselms H, Maggio N, Rubovitch V, Chapman J, Schreiber S, Tweedie D, Kim DS, Greig NH, Pick CG. Novel pharmaceutical treatments for minimal traumatic brain injury and evaluation of animal models and methodologies supporting their development. J Neurosci Methods. 2016; 272:69-76).

PT302 с замедленным высвобождением вводили (0,6 мг/кг, подкожно) через 1 час после нанесения травмы головы, как описано выше (фиг. 9A). Мышей исследовали через 7 дней после нанесения травмы в отношении парадигмы распознавания новых объектов, которая обычно используется для оценки опознающей памяти у грызунов. Грызуны без нарушений демонстрируют присущую им тенденцию исследовать новые объекты в их непосредственных расположениях. Эта особенность поведения мыши позволяет оценить функцию памяти визуального распознавания. Возможно, что еще более важно, это также позволяет оценить влияние различных стимулов на эту присущую им активность. В тесте используются два испытания. В первом испытании животным разрешают исследовать два объекта в течение определенного времени - 5 минут. Через 24 часа после первого испытания проводится второе испытание, в котором животным показывают два объекта, один из которых такой же, как в первом испытании, а другой является новым для животного. Во втором испытании мышам также разрешено исследовать объекты в течение 5 минут. Показатель предпочтения или дискриминации рассчитывается и используется для оценки опознающей памяти у животного. Показатель рассчитывается следующим образом: время, которое животное проводит возле нового объекта, минус время, проведенное возле знакомого объекта, деленное на сумму времени, проведенного возле нового и знакомого объектов (Dix SL, Aggleton JP. Extending the spontaneous preference test of recognition: evidence of object-location and object-context recognition. Behav. Brain Res. 1999;99:191-200). Как показано на фиг. 9В, введение эксенатида значительно увеличивало распознавание нового объекта у мышей с mTBI (n=5) по сравнению с не подвергнутыми лечению мышами с mTBI (n=7), демонстрируя тем самым, что у мышей, подвергнутых лечению PT302, уменьшалось нарушение визуального распознавания, вызванное mTBI.

Пример 9. Исследование уровня эксендина-4 в плазме у нормальных мышей ICR. Концентрацию эксендина-4 в плазме измеряли у нормальных мышей ICR через 7 дней после подкожного введения PT302 (0,1, 0,3, 0,6, 1,0 и 2,0 мг/кг). Уровни в плазме эксендина-4 анализировали количественно, как описано выше. Уровень эксендина-4 в плазме является устойчивым и нарастает в зависимости от дозы до приблизительно 4000 пг/мл в течение 7 дней после инъекции (фиг. 10А).

Пример 10. Исследование уровней эксендина-4 в плазме у нормальных мышей и мышей с черепно-мозговыми травмами. Уровни эксендина-4 в плазме измеряли у нормальных мышей и мышей-моделей TBI через 7 дней после подкожного введения PT302 (0,6 мг/кг). Уровни в плазме эксендина-4 анализировали количественно, как описано выше. Не наблюдалось различий в уровнях эксендина-4 в плазме между нормальными мышами и мышами с вызовом TBI (фиг. 10B).

Пример 11. Эксенатид с замедленным высвобождением поддерживает уровни эксендина-4 в плазме в течение продолжительного периода времени. Нормальные мыши ICR получали однократную подкожную инъекцию PT302 в трех разных дозах: 0,024 мг/кг, 0,12 мг/кг и 0,6 мг/кг. Кровь собирали через 0, 0,5 и 1 час после первой инъекции, а также в день 1, 3, 7, 14 и 21 для измерения в плазме. Концентрацию эксендина-4 в плазме анализировали количественно, как описано выше. Как показано на фиг. 10C, однократная доза PT302 поддерживала уровни эксендина-4 в плазме более 20 дней.

Пример 12. Эксенатид с замедленным высвобождением значительно увеличивает распознавание новых объектов и новых рукавов лабиринта через семь дней после черепно-мозговой травмы. Травму головы наносили, как описано выше, и мышей немедленно помещали в их первоначальную клетку для выздоровления. PT302 (0,024 мг/кг, 0,12 мг/кг и 0,6 мг/кг) вводили мышам подкожно в виде однократной инъекции через 1 час после вызова TBI. Оценки поведения (распознавание новых объектов и тест в Y-лабиринте) проводились через 7 дней после mTBI. Парадигма Y-лабиринта обычно используется для оценки спонтанного исследования и реагирования на новое окружение и функции пространственной рабочей памяти (Deselms, et al., 2016). Устройство для испытания изготовлено из идентичных рукавов из черного плексигласа (8×30×15 см), причем рукава идут от центральной точки под углом 120° от центра. Внутри каждого рукава находится разная пространственная подсказка, предназначенная для того, чтобы дать мыши привязку к зрительной памяти. Как правило, существуют два испытания, проводимых с интервалом в несколько минут; здесь испытания проводились с 5-минутными интервалами. Для каждого первого испытания стартовый рукав выбирается случайным образом. Каждое животное помещается в центральную точку окружения Y-лабиринта; во время первого 5-минутного испытания один из двух рукавов наугад закрывается, во время второго 2-минутного испытания все три рукава открыты для исследования. Регистрируется общее время, которое мышь исследовала в каждом рукаве во время второго испытания. Во избежание возможной путаницы, между испытаниями Т-лабиринт тщательно очищается. Время, проведенное в новом ранее не исследованном рукаве относительно знакомого ранее исследованного рукава, используется для оценки любых поведенческих различий между каждой группой лечения животных, т.е. (время, проведенное в новом рукаве минус время, проведенное в знакомом рукаве)/(время, проведенное в новом рукаве плюс время, проведенное в знакомом рукаве).

Подвергнутые лечению носителем мыши с mTBI страдали от дефицита зрительной памяти и проводили меньше времени возле новых объектов по сравнению с контрольными мышами (p<0,001) (фиг. 11A). Высокое предпочтение нового объекта по сравнению с не подвергнутыми лечению мышами с mTBI наблюдалось у мышей, получавших однократную подкожную инъекцию PT302 через 1 час после вызова mTBI в дозе 0,12 мг/кг (р<0,05) и 0,6 мг/кг (р<0,01) (фиг. 11А).

Мыши, подвергнутые mTBI, продемонстрировали значительное нарушение пространственной памяти и проводили меньше времени в новом рукаве Y-лабиринта по сравнению с фиктивными животными - ложными контролями (p<0,001) (фиг. 11B). Однократная подкожная инъекция PT302 через 1 час после вызова mTBI в дозе 0,12 мг/кг и 0,6 мг/кг уменьшала дефицит пространственной памяти у мышей с mTBI по сравнению с не подвергнутыми лечению мышами с mTBI (p<0,01) (фиг. 11B). [F(4,50)=4,83, р=0,002, ретроспективный тест Фишера для выявления значимости различий].

Все группы проводили приблизительно одинаковое время в открытом рукаве приподнятого плюс лабиринта, и их нельзя было отличить друг от друга в отношении их поведения, подобного тревоге (фиг. 11C); важно отметить, что поведение, подобное тревоге, не было мешающим фактором в предшествующем распознавании новых объектов и парадигмах Y-лабиринта (p>0,05). [F(4,36)=0,28, р=0,89].

Пример 13. Эксенатид с замедленным высвобождением значительно повышает распознавание новых объектов и новых рукавов лабиринта через тридцать дней после черепно-мозговой травмы. Травму головы наносили, как описано выше, и мышей немедленно помещали в их первоначальную клетку для выздоровления. PT302 (0,6 мг/кг) вводили мышам подкожно в виде однократной инъекции через 1 час после вызова TBI. Оценки поведения (распознавание новых объектов и тест в Y-лабиринте) проводились через 30 дней после mTBI.

Подвергнутые лечению носителем мыши с mTBI страдали от дефицита зрительной памяти и проводили меньше времени возле нового объекта по сравнению с контрольными мышами (р<0,001; фиг. 12А). Высокое предпочтение нового объекта по сравнению с мышами с mTBI наблюдалось у мышей, получавших однократную подкожную инъекцию PT302 через 1 час после вызова mTBI в дозе 0,12 мг/кг или 0,6 мг/кг (р<0,01 и р<0,001, соответственно; фиг. 12А).

Мыши, подвергнутые mTBI, продемонстрировали значительное нарушение пространственной памяти и проводили меньше времени в новом рукаве лабиринта по сравнению с животными - ложными контролями (p<0,001; фиг. 12B). Однократная подкожная инъекция PT302 через 1 час после вызова mTBI в дозе 0,6 мг/кг уменьшала дефицит пространственной памяти у мышей с mTBI по сравнению с одной только mTBI (p<0,01; фиг. 12B).

Все группы проводили приблизительно одинаковое время в открытом рукаве лабиринта, и их нельзя было отличить друг от друга в отношении их поведения, подобного тревоге (фиг. 12C); что указывает на то, что поведение, подобное тревоге, не было фактором в предыдущем распознавание нового объекта и парадигме Y-лабиринта (р>0,05).

Пример 14. Введение PT302 предотвращало снижение NeuN-иммунореактивности после черепно-мозговой травмы в областях височной коры и гиппокампа мышей. NeuN является маркером зрелого нейрона, который можно использовать для оценки потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы. Для оценки NeuN клеток в определенных областях головного мозга мышей анестезировали путем введения избытка кетамина + ксилазина и сразу же перфузировали транскардиально с использованием физиологического буферного солевого раствора, а затем 4% параформальдегида ((PFA) в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4). Их головной мозг удаляли, фиксировали в течение ночи (4% PFA в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4) и затем помещали в 30% сахарозу на 48 часов. Коронарные срезы (30 мкм) делали в криостате, помещали в криопротектор и хранили при -20°С до использования. После этого 5 срезов коры и 5 срезов гиппокампа блокировали путем инкубации с 0,1% Triton X-100 в фосфатно-солевом буфере (PBST) и 10% нормальной лошадиной сывороткой в течение 1 часа при 25°С. Первое антитело, мышиные антитело против ядер нейронов (NeuN; 1:50, Millipore, Danvers, MA, США, каталожный #MAB3377) затем растворяли в PBST и 2% нормальной лошадиной сыворотке и инкубировали с срезами в течение 48 часов при 4°С. После промывания в PBST срезы инкубировали в течение 1 часа при 25°C с конъюгированным с DyLight™ 594 антикроличьим IgG осла, подвергнутым аффинной хроматографии, и с конъюгированным с DyLight™ 488 антимышиным IgG осла, подвергнутым аффинной хроматографии, (1:300; Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME, США). После промывки в PBST срезы устанавливали на сухие предметные стекла, покрытые желатином, и оценивали флуоресценцию с помощью конфокального микроскопа Zeiss LSM 510 с линзами ×20 и ×63 (Carl Zeiss, Jena, Германия). Для каждого головного мозга делали от трех до пяти срезов, и среднее количество клеток в гиппокампе и височной коре рассчитывали в определенных полях или 140², или 440² мкМ. Оценка иммуногистохимических предметных стекол в отношении иммунофлуоресценции была предпринята слепым метолом, и пропуск первого антитела обычно предпринимался при получении срезов отрицательного контроля. Анализы выполнялись с помощью программы Imaris для количественного анализа цвета (Bitplane AG, Zurich, Швейцария).

На фиг. 13А представлены репрезентативные изображения NeuN (красных (при оценке в цвете)) нейронов в коре головного мозга, CA3 и зубчатой извилины контрольных мышей, не подвергнутых лечению мышей с mTBI и подвергнутых лечению PT302 мышей с mTBI (0,6 мг/кг через 1 час после mTBI) через 30 дней после mTBI. Гистограммы на фиг. 13B, 13C и 13D показывают количественный анализ выживаемости нейронов в коре, CA3 и зубчатой извилине, соответственно, как было определено по количеству нейронов, положительно окрашенных антителом против NeuN в ложном контроле, группах mTBI и mTBI+PT302 0,6 мг/кг (**р<0,01, ***р<0,001). Значения представляют собой средние значения ± SEM. Введение эксендина-4 с замедленным высвобождением в форме PT302 предотвращало потерю нейронов, наблюдаемую вследствие черепно-мозговой травмы.

Пример 15. Введение PT302 уменьшало количество дегенеративных нейронов у мышей с mTBI . Fluoro-Jade® C представляет собой флуоресцентный краситель, который метит поврежденные дегенеративные нейроны головного мозга, который может использоваться для оценки потери нейронов вследствие черепно-мозговой травмы. Связывающая ионизированный кальций адаптерная молекула 1 (IBA1) специфически экспрессируется в микроглии, и ее экспрессия увеличивается в активированной микроглии, что может использоваться в качестве маркера нейровоспаления. Мышей умерщвляли, и их головной мозг готовили для иммуногистохимического анализа, как описано выше. Коронарные срезы из гиппокампа и теменной коры (40 мкм) делали в криостате и собирали в раствор криопротектора. Были проанализированы CA1, CA3 и зубчатая извилина гиппокампа.

Для окрашивания FluoroJade C срезы головного мозга сначала погружали в раствор, содержащий 1% NaOH в 80% этаноле, на 5 минут. Их промывали в течение 2 минут в 70% этаноле, промывали в дистиллированной воде, затем инкубировали в 0,06% растворе перманганата калия в течение 10 минут. После промывки водой предметные стекла инкубировали в окрашивающем растворе FJC (полученном путем добавления 4 мл 0,01% исходного раствора FJC в дистиллированной воде к 96 мл 0,1% уксусной кислоты) и окрашивали в течение 10 минут. После 3 промывок дистиллированной водой предметные стекла полностью высушивали на воздухе на нагревателе для предметных стекол, очищали в ксилоле и покрывали DPX. Позитивные по FluoroJade C клетки подсчитывали для каждой области в обоих полушариях с помощью конфокального микроскопа FV 1000MPE Olympus.

Для IBA1/TNF-α двойного мечения срезы инкубировали в течение 48 часов с антителом против IBA1 (поликлональным козьим антителом против IBA1 1:200, Abcam, США) и антителом против TNF-α (поликлональным кроличьим антителом против TNF-α, 1:800, Abbiotec, США). После промывки PBS срезы инкубировали со вторым антителом против IBA1, в то время как трехстадийное обнаружение использовали для увеличения сигнала TNF-α с помощью конъюгированного с биотином IgG (антикроличьего IgG (H+L), Biotin-Goat 1:500, Invitrogen, США) и стрептавидина-флуоресцеина (1:200, Vector, Соединенное Королевство).

Качественный и количественный анализы IBA1 и TNFα проводили с использованием конфокального лазерного сканирующего микроскопа FV 1000MPE. Изображения серии Z были обработаны с помощью ImageJ 1.47v, а объем колокализованных элементов был измерен с помощью Imaris 7.4.2 следующим образом: для каждого набора данных канал колокализации был автоматически составлен программным обеспечением. В последних стеках выбиралась представляющая интерес область для каждой области головного мозга (CA1, CA3, DG и коры головного мозга) в каждом полушарии каждого животного, и объем представляющих интерес элементов был рассчитан, суммирован и выражен как объем/мкм³.

Как показано на фиг. 14А, после травмы mTBI наблюдалось сильное увеличение числа позитивных по FluoroJade C нейронов во всех исследованных областях (CA1, CA3, DG для гиппокампа и латеральной поверхности коры) по сравнению с контролями (p<0,05 для CA1; p<0,001 для CA3, DG и CTX; фиг. 14A и фиг. 14B, 14C и 14D и 14E, соответственно). Лечение PT302 в дозе 0,6 мг/кг противодействовало индуцированной mTBI нейродегенерации во всех исследованных областях (p<0,01 в CA3 и DG, фиг. 14C и 14D; p<0,05 в CTX и CA1, фиг. 14E и 14B), в то время как доза PT302 0,12 мг/кг продемонстрировала значительный эффект в области CA3 (р<0,05).

Как показано на фиг. 15А, после травмы mTBI IBA1-иммунореактивность увеличивалась по сравнению с носителем в качестве контроля во всех анализируемых областях (р<0,05 для CA1; p<0,001 для CA3, DG и CTX). В контрольной группе клетки микроглии продемонстрировали морфологию покоя с небольшой сомой, длинными и тонкими отростками (фиг. 15А). После травмы mTBI микроглия продемонстрировала активированную морфологию, характеризующуюся более крупным телом с более короткими и более толстыми отростками (фиг. 15А). PT302 в обеих дозах ингибировал активацию микроглии: PT302 в дозе 0,6 мг/кг эффективен во всех областях головного мозга (p<0,001 в CTX; p<0,001 в CA1 и CA3; p<0,05 в DG).

Иммунореактивность в отношении провоспалительного цитокина TNF-α увеличивалась в IBA1+ клетках в группе с травмой IBA1 во всех анализируемых областях (p<0,05 в DG; p<0,01 в CA1; p<0,001 в CA3 и коре головного мозга; фиг. 15D 15В, 15С и 15Е, соответственно). Введение PT302 в дозах 0,6 и 0,12 мг/кг снижало уровни колокализации IBA1/TNF-α IR как в гиппокампе, так и в коре.

КОНКРЕТНЫЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает: введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, причем нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или замедленное высвобождение нейропротективного полипептида усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС)) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного пептида.

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает: введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением или устройства, обеспечивающего замедленное высвобождение или долговременную доставку нейропротективного полипептида, причем нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением или устройство усиливают доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.

В одном аспекте настоящего изобретения предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает введение в системный кровоток субъекта состава с контролируемым высвобождением, включающего по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации, и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением представляет собой состав нейропротективного полипептида длительного действия.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материал покрытия, так что биодоступность и замедленное высвобождение эффективного количества нейропротективного полипептида осуществляется в течение достаточного периода времени (например, без начального выброса, такого как вредный начальный выброс, активного ингредиента).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает: микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав длительного действия включает депо-состав для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав длительного действия включает композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, связанное с ЦНС состояние выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, инъекция нейропротективного состава с контролируемым высвобождением представляет собой подкожную инъекцию.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в спинномозговой жидкости (CSF), головном мозге или их комбинации у субъекта.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, концентрация нейропротективного полипептида в CSF находится в диапазоне от приблизительно 5 до приблизительно 400 пг/мл.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного состава с контролируемым высвобождением, включающего по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации, и нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением представляет собой состав нейропротективного полипептида длительного действия.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав с контролируемым высвобождением, кроме того, содержит биоразлагаемый полимер с определенной вязкостью и материалы покрытия, обладая биодоступностью и замедленным высвобождением нейропротективного полипептида в эффективной концентрации в течение определенного периода времени (например, без начального выброса, такого как вредный начальный выброс, активного ингредиента).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный состав с контролируемым высвобождением включает: микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав длительного действия включает депо-состав для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав длительного действия включает композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, связанное с ЦНС состояние выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), рассеянного склероза, наркомании, алкогольной зависимости, нейродегенеративных состояний, воспаления головного мозга, болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, хронической травматической энцефалопатии, заболеваний двигательных нейронов (например, бокового амиотрофического склероза, повреждения спинного мозга, спиноцеребеллярной атаксии (SCA), атрофии мышц позвоночника (SMA)), сосудистой деменции, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции, болезни Крейтцфельда-Якоба, гидроцефалии нормального давления или их комбинации.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, инъекция нейропротективного состава с контролируемым высвобождением субъекту представляет собой подкожную инъекцию.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации в плазме нейропротективного полипептида, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав вводят один раз каждые 7-21 день (например, один раз каждые 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или 21 день).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, состав вводят во второй раз через приблизительно 7-21 день (например, один раз каждые приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20 или приблизительно 21 дней) после предшествующего введения.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, процентное изменение концентрации нейропротективного полипептида в плазме не превышает приблизительно 30%, когда состав повторно вводят в пределах приблизительно 28 дней (например, в пределах приблизительно 21 или приблизительно 14 дней) от предшествующего введения состава.

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предложен способ доставки нейропротективного полипептида по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) субъекта. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку и/или ввод нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (BBB) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.

В дальнейшем аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом. Способ включает: обеспечение долговременной доставки в системный кровоток субъекта по меньшей мере одного нейропротективного полипептида, выбираемого из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4, причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и причем нейропротективный состав с контролируемым высвобождением усиливает доставку нейропротективного полипептида через гематоэнцефалический барьер (ВВВ) субъекта по меньшей мере в часть центральной нервной системы (ЦНС) по сравнению с составом с быстрым высвобождением нейропротективного полипептида.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, предоставление нейропротективного полипептида или полипептидов с замедленным высвобождением включает введение нейропротективного полипептида или полипептидов с помощью устройства (например, насоса, мини-насоса, осмотического насоса, осмотического устройства доставки, инфузионного насоса, устройства для внутривенного введения, перистальтического насоса, миниатюрного инфузионного насоса или т.п.).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, процентное изменение стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме после достижения стационарного состояния, составляет не более приблизительно 80% (например, не более приблизительно 50% или не более приблизительно 40%) при введении состава (например, при введении один раз каждые 7-28 дней или один раз каждые 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 или 28 дней).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный полипептид или полипептиды вводят с помощью устройства (например, насоса, мини-насоса, осмотического насоса, осмотического устройства доставки, инфузионного насоса, устройства для внутривенного введения, перистальтического насоса, миниатюрного инфузионного насоса или т.п.).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный полипептид или полипептиды вводят со скоростью от приблизительно 1 пМ/кг/мин до приблизительно 30 пМ/кг/мин (например, от приблизительно 3 пМ/кг/мин до приблизительно 17,5 пМ/кг/мин).

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением или обеспечение долговременной доставки нейропротективного полипептида ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС состояния у субъекта.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение состава с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 мкг/мл.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, введение композиции с контролируемым высвобождением или обеспечение замедленного высвобождения нейропротективного полипептида приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, концентрация нейропротективного полипептида в CSF находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 400 пг/мл.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, отношение стационарной концентрации полипептида в CFS к таковой в плазме находится в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, аналог эксендина-4 представлен химической формулой I или его фармацевтически приемлемой солью:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28-Z₁, (Химическая формула I),

где:

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;

Xaa2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;

Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu;

Xaa4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;

Xaa6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;

Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr;

Xaa9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицин или Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;

Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val, или Met;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;

Xaa21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg или С1-С10 алканоил с прямой или разветвленной цепью;

Xaa22 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa23 представляет собой Ile, Val, Leu, пентилглицин, трет-бутилглицин или Met;

Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp;

Xaa25 представляет собой Ala, Trp, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;

Xaa27 представляет собой Ala или Lys;

Xaa28 представляет собой Ala или Asn; и

Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂,

Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, 3Hyp, 4Hyp, тиопролина, N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина или N-алкилаланина, Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser), и

Z₂ представляет собой -OH или -NH₂,

при условии, что:

не более трех из Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 и Xaa28 представляют собой Ala; и

когда Xaa1 представляет собой His, Arg или Tyr, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 представляет собой Ala.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, аналог эксендина-4 представлен химической формулой II или его фармацевтически приемлемой солью:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 X₁-Z₁, (Химическая формула II)

где:

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;

Xaa2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;

Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu;

Xaa4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;

Xaa6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;

Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr;

Xaa9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицин или Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;

Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val, или Met;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;

Xaa21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NHε-R (где R представляет собой Lys, Arg, C1-C10 алканоил с прямой или разветвленной цепью или циклоаллеил-алканоил);

Xaa22 представляет собой Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa23 представляет собой Ile, Val, Leu, пентилглицин, трет-бутилглицин или Met;

Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp;

Xaa25 представляет собой Ala, Tarp, Phi, Tyr или нафтилаланин;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;

X₁ представляет собой Lys Asn, Asn Lys, Lys-NHε-R Asn, Asn Lys-NHε-R, Lys-NHε-R Ala, Ala Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg, C1-C10 алканоил с прямой или разветвленной цепью или циклоалкилалканоил;

Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂;

Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, 3Hyp, 4Hyp, тиопролина, N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина или N-алкилаланина, Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser), и

Z₂ представляет собой -OH или -NH₂,

при условии, что:

не более трех из Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25 и Xaa26 представляют собой Ala; и

когда Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr или 4-имидазопропионил, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 представляет собой Ala.

В любом аспекте или варианте осуществления, описанном здесь, нейропротективный полипептид выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO:1-55.

Каждый упомянутый здесь документ включен сюда посредством ссылки. За исключением примеров или случаев, где иное явно указано, все числовые величины в этом описании, определяющие количества материалов и т.п., следует понимать как измененные словом «приблизительно». Следует понимать, что верхний и нижний пределы количества, диапазона и соотношения, приведенные здесь, могут независимо комбинироваться. Аналогично, диапазоны и количества для каждого элемента настоящего изобретения могут использоваться вместе с диапазонами или количествами для любого из других элементов.

Специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления и способов, описанных здесь. Такие эквиваленты, как предполагается, охватываются объемом следующей формулы изобретения.

Понятно, что подробные примеры и варианты осуществления, описанные здесь, даны в качестве примера только для иллюстративных целей и никоим образом не рассматриваются как ограничивающие настоящее изобретение. В свете этого у специалистов в данной области техники будут вызываться мысли о различных модификациях или изменениях, и они включены в сущность и содержание этой заявки и рассматриваются в объеме прилагаемой формулы изобретения. Например, относительные количества ингредиентов могут меняться для оптимизации желаемых эффектов, могут добавляться дополнительные ингредиенты, и/или аналогичные ингредиенты могут заменять один или более описанных ингредиентов. Дополнительные преимущественные признаки и функциональные возможности, связанные с системами, способами и процессами настоящего изобретения, будут очевидны из прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, специалисты в данной области техники распознают или смогут установить, используя не более чем обычные эксперименты, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения, описанных здесь. Такие эквиваленты, как предполагается, охватываются следующей формулой изобретения.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Abercrombie M (1946) Estimation of nuclear population from microtome sections. Anat Rec 94:239-247.

Bressler et al. "Pharmacological regulation of blood glucose levels in non-insulin dependent diabetes," Arch. Int. Med. 157:836-848 (1997)

Calvo et al. "Structural characterization by affinity cross-linking of glucagon-like peptide-1 (7-36) amide receptor in rat brain," J. Neurochem. 64(1):299-306 (1995)

Campos et al. "Divergent tissue-specific and developmental expression of receptors for glucagon and glucagon-like peptide-1 in the mouse," Endocrinology 134:2156 -64 (1994)

Chen et al. "Tissue-specific expression of unique mRNAs that encode pro-glucagon-derived peptides or exendin-4 in the lizard," J. Biol. Chem. 272: 4108-4115 (1997

De Ore et al. "The effect of GLP-1 on insulin release in young and old rats in the fasting state and during an intravenous glucose tolerance test," J. Gerontol. 52:B245-249 (1997)

Drucker et al. "Glucagon-like peptide I stimulates insulin gene expression and increases cyclic AMP levels in a rat islet cell line," Proc. Natl. Acad. Sci. 84:3434-3438 (1987)

During MJ, et al. ʺGlucagon-like peptide-1 receptor is involved in learning and neuroprotection,ʺ Nature Medicine 9: 1173-1179 (2003).

Elahi et al. "The insulinotropic actions of glucose-dependent insulinotropic polypeptide (GIP) and glucagon-like peptide-1 (7-36) in normal and diabetic subjects," Regul. Pep. 51:63-74 (1994)

Fehmann et al. "Cell and Molecular Biology of the Incretin Hormones Glucagon-Like Peptide-I and Glucose-Dependent Insulin Releasing Polypeptide," Endocrine Rev. 16:390-410 (1995)

Fehmann et al. "Insulinotropic hormone glucagon-like peptide-1 (7-37) stimulation of proinsulin gene expression and proinsulin biosynthesis in insulinoma BTC-1 cells", Endocrinology 130: 159-166 (1992)

Geula and Mesulam "Cortical cholinergic fibers in aging and Alzheimer's disease: a morphometric study," Neuroscience. 33:469-81 (1989)

Ghazzi et al. "Cardiac and glycemic benefits of troglitazone treatment in NIDDM," Diabetes 46: 433-439. Care. 15: 270-276 (1997)

Goke et al. "Cardiac and Glycemic Benefits of Troglitazone Treatment in NIDDM," Diabetes 46:433-439 (1993)

Goke et al. "Distribution of GLP-1 binding sites in the rat brain: evidence that exendin-4 is a ligand of brain GLP-1 binding sites, Eur. J. Neurosci7:2294-2300 (1995)

Goke et al. "Exendin-4 is a high potency agonist and truncated exendin-4 (9-39)-amide in an antagonist at the GLP-1 (7-36)-amide receptor of insulin-secreting -cells," J. Biol. Chem. 268:19650-19655 (1993)

Greig N et al. "Once daily injection of exendin-4 to diabetic mice achieves long-term beneficial effects on blood glucose concentrations." Diabetologia 42:45-50, (1999).

Gross and Meienhofer (eds.) "The Peptides: Analysis, Synthesis," Biology 3: Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis, Academic Press, N.Y. (1981)

Gutniak et al. "Antidiabetogenic effect of glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in normal subjects and patients with diabetes mellitus," N. Engl. J. Med. 326:1316-1322 (1992)

Jia Y et al. 2015 Peptidic exenatide and herbal catapol mediate neuroprotection via the hippocampal GLP-1 receptor/β-endorphin pathway,ʺ Pharmacological Research 102:276-85.

Jin et al. "Distribution of glucagonlike peptide I (GLP-I), glucagon, and glicentin in the rat brain: an immunocytochemical study," J. Comp. Neurol. 271:519-32. (1988)

Kastin AJ and Akeerstrom V, International Journal of Obesity (2003) 27, 313-31

Kim BJ, et al. ʺTransferrin fusion technology: a novel approach to prolonging biological half-life of insulinotropic peptides,ʺ J Pharmacol Exp. Ther. 2010 Sep 1; 334(3):682-92.

Kim S, et al. ʺExendin-4 protects dopaminergic neurons by inhibition of microglial activation and matrix metalloproteinase-3 expression in an animal model of Parkinson's disease,ʺ J Endocrinol 202(3):431-9 (2009)

Lahiri DK, Farlow MR, Hintz N, Utsuki T and Greig NH. 2000 Cholinesterase inhibitors, beta-amyloid precursor protein and amyloid beta-peptides in Alzheimer's disease Acta Neurol Scand Suppl 176:60-67.

Li Y, et al. ʺGLP-1 receptor stimulation preserves primary cortical and dopaminergic neurons in cellular and rodent models of stroke and Parkinsonism,ʺ Proc Natl Acad Sci USA 106(4):1285-90 (2009)

Liu W, et al. ʺNeuroprotective effects of lixisenatide and liraglutide in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson's disease,ʺ Neuroscience 202:42-50 (2015)

Lu Z, et al., 2014 ʺDifferential hypoglycaemic, anorectic, autonomic and emetic effects of the glucagon-like peptide receptor agonist, exendin-4, in the conscious telemetered ferret,ʺ J. Transl Med. 12: 327.

Mark RJ, Pang Z, Geddes JW, Uchida K and Mattson MP. 1997 Amyloid beta-peptide impairs glucose transport in hippocampal and cortical neurons: involvement of membrane lipid peroxidation J Neurosci 17:1046-1054.

Martin B, et al. 2012 ʺEuglycemic agent-mediated hypothalamic transcriptomic manipulation in the N171-82Q model of Huntington disease is related to their physiological efficacy,ʺ J Biol Chem 287(38):31766-82.

Mattson MP, Lovell MA, Furukawa K et al., (1995) Neurotrophic factors attenuate glutamate-induced accumulation of peroxides, elevation of intracellular Ca2+ concentration, and neurotoxicity and increase antioxidant enzyme activities in hippocampal neurons. J Neurochem 65(4):1740-1751.

Moceri et al. "Early-life risk factors and the development of Alzheimer's disease," Neurology 54:415-420 (2000)

Montrose-Rafizadeh C, Wang Y, Janczewski AM et al., (1997a) Overexpression of glucagon-like peptide-1 receptor in an insulin-secreting cell line enhances glucose responsiveness. Mol Cell Endocrinol 130(1-2):109-117.

Montrose-Rafizadeh et al. "High potency antagonists of the pancreatic glucagon-like peptide-1 receptor," J. Biol. Chem. 272:21201-21206 (1997b)

Montrose-Rafizadeh et al. "Incretin hormones regulate glucose dependent insulin secretion in RIN 1046-38 cells: mechanisms of action," Endocrinology 135:589-594 (1994)

Nathan et al. "Insulinotropic action of glucagonlike peptide-I-(7-37) in diabetic and nondiabetic subjects," Diabetes Care 15:270-276 (1992)

Nauck et al. "Preserved incretin activity of Glucagon-like peptide 1 (7-36) amide but not of synthetic human gastric inhibitory polypeptide in patients with Type-2 diabetes mellitus," J. Clin. Invest. 91: 301-307 (1993)

Nauck et al. "Normalization of fasting hyperglycemia by exogenous glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in type II (non-insulin dependent) diabetic patients," Diabetologia 36:741-744 (1993)

Naya et al. "Diabetes, defective pancreatic morphogenesis, and abnormal enteroendocrine differentiation in BETA2/neuroD-deficient mice," Genes Dev. 11:2323-2334 (1997)

Orskov "Glucagon-like peptide-1, a new hormone of the entero-insular axis," Diabetologia 35: 701-711 (1992)

Ott et al. " Diabetes mellitus and the risk of dementia: The Rotterdam Study," Neurology 53:1937-42 (1999)

Paxinos and Watson. "The rat brain in stereotaxic coordinates", Academic Press, NSW Australia (1998).

Perry et al. "Behavioural, histological and immunocytochemical consequences following 192 IgG-saporin immunolesions of the basal forebrain cholinergic system," Brain Res. Bull. 54:29-48 (2001) Remington's Pharmaceutical Sciences (Martin, E. W. (ed.) latest edition Mack Publishing Co., Easton, PA)

Ritzel et al. "Pharmacokinetic, insulinotropic, and glucagonostatic properties of GLP-1 [7-36 amide] after subcutaneous injection in healthy volunteers. Dose-response-relationships," Diabetologia. 38:720-725 (1995)

Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, (2nd ed.) Vol. 1-3 Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY (1989)

Satoh et al. "Characterization of human and rat glucagon-like peptide-1 receptors in the neurointermediate lobe: lack of coupling to either stimulation or inhibition of adenylyl cyclase," Endocrinology 141:1301-9 (2000)

Shughrue et al. "Glucagon-like peptide-1 receptor (GLP1-R) mRNA in the rat hypothalamus," Endocrin. 137(11):5159-62 (1996)

Suzuki N, Cheung TT, Cai XD, Odaka A, Otvos L, Jr, Eckman C, Golde TE and Younkin SG. 1994 An increased percentage of long amyloid beta protein secreted by familial amyloid beta protein precursor (beta APP717) mutants Science 264:1336-1340.

Thorens et al. "Cloning and functional expression of the human islet GLP-1 receptor. Demonstration that exendin-4 is an agonist and exendin(9-39) an antagonist of the receptor," Diabetes 42:1678-1682 (1993)

Thorens et al. "Glucagon-like peptide-1 and the control of insulin secretion in the normal state and in NIDDM," Diabetes 42:1219-1225 (1993)

U.S. Patent No. 3,710,795 "Drug-Delivery device with Stretched, Rate-Controlling Membrane," Higuchi et al. (Jan. 16, 1973)

Wang et al. "GIP regulates glucose transporters, hexokinases, and glucose-induced insulin secretion in RIN 1046-38 cells," Moll. Cell. Endo.116:81-87 (1996)

Wang et al. "Glucagon-like peptide-1 affects gene transcription and messenger ribonucleic acid stability of components of the insulin secretory system in RIN 1046-38 cells," Endocrinology 136:4910-4917 (1995)

Wei et al. "Tissue-specific expression of the human receptor for glucagon-like peptide-I: brain, heart and pancreatic forms have the same deduced amino acid sequences," FEBS Lett 358(3):219-224 (Jan. 30, 1995)

Wilms et al. "Gastric emptying, glucose responses, and insulin secretion after a liquid test meal: effects of exogenous glucagon-like peptide-1 (7-36) amide in Type II (non-insulin-dependent) diabetic patients," J. Clin. Edocrinol. Metab. 81:327 332 (1996)

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PEPTRON CO., LTD

<120> СПОСОБЫ ДОСТАВКИ НЕЙРОПРОТЕКТИВНОГО ПОЛИПЕПТИДА В ЦЕНТРАЛЬНУЮ

НЕРВНУЮ СИСТЕМУ И СПОСОБЫ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ

<130> 1568390.100US0

<140> TBD

<141> 2017-10-20

<150> 62/410,748

<151> 2016-10-20

<160> 55

<170> FastSEQ для версии 4.0 Windows

<210> 1

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 1

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 2

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 2

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 3

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 3

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 4

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 4

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 5

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 5

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 6

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 6

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 7

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 7

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

20 25 30

<210> 8

<211> 31

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 2

<223> Xaa=аминокапроновая кислота

<400> 8

His Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 9

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 30

<223> Xaa=любая аминокислота

<400> 9

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Xaa Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 10

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 10

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 11

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 11

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly

20 25 30

<210> 12

<211> 37

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 12

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro

35

<210> 13

<211> 35

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 13

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala

35

<210> 14

<211> 33

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 14

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser

<210> 15

<211> 28

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 15

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn

20 25

<210> 16

<211> 26

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 16

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu

20 25

<210> 17

<211> 23

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 17

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile

20

<210> 18

<211> 20

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 18

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg

20

<210> 19

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 19

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu

<210> 20

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 20

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met

1 5 10

<210> 21

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 21

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser

1 5 10

<210> 22

<211> 34

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 3,4,5,6

<223> Xaa=аминокапроновая кислота

<400> 22

His Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser

1 5 10 15

Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys

20 25 30

Gly Arg

<210> 23

<211> 38

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 3,4,5,6,7,8,9,10

<223> Xaa=аминокапроновая кислота

<400> 23

His Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser

1 5 10 15

Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala

20 25 30

Trp Leu Val Lys Gly Arg

35

<210> 24

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 24

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Val Arg Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 25

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 25

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Met Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 26

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 26

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Val Arg Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 27

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 27

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 28

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 28

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 29

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 29

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Gly

20 25 30

<210> 30

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 30

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Lys Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 31

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 31

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg

20 25 30

<210> 32

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 32

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Arg

20 25 30

<210> 33

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 33

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Glu Phe Ile Ala Trp Leu Lys Asn Gly Arg

20 25 30

<210> 34

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 34

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 35

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 35

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 36

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 36

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 37

<211> 30

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 37

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Arg

20 25 30

<210> 38

<211> 42

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 38

Tyr Gly Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15

Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys

20 25 30

Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40

<210> 39

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 39

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 40

<211> 42

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 40

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro

35 40

<210> 41

<211> 45

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 41

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro Pro Ser Ser

35 40 45

<210> 42

<211> 40

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 2

<223> Xaa=аминокапроновая кислота

<400> 42

His Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro

20 25 30

Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 40

<210> 43

<211> 43

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 2

<223> Xaa=аминокапроновая кислота

<400> 43

His Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro

20 25 30

Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro

35 40

<210> 44

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 2

<223> Xaa=аминокапроновая кислота

<400> 44

His Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro

20 25 30

Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro Pro Ser Ser

35 40 45

<210> 45

<211> 40

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 3

<223> Xaa=аминокапроновая кислота

<400> 45

His Ala Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro

20 25 30

Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35 40

<210> 46

<211> 43

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 3

<223> Xaa=аминокапроновая кислота

<400> 46

His Ala Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro

20 25 30

Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro

35 40

<210> 47

<211> 46

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 3

<223> Xaa=аминокапроновая кислота

<400> 47

His Ala Xaa Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu

1 5 10 15

Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro

20 25 30

Ser Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Pro Pro Ser Ser

35 40 45

<210> 48

<211> 43

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<220>

<221> Вариант

<222> 2

<223> Xaa=аминокапроновая кислота

<400> 48

Tyr Xaa Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp

1 5 10 15

Lys Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly

20 25 30

Lys Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40

<210> 49

<211> 36

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 49

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro

35

<210> 50

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 50

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 51

<211> 36

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 51

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro

35

<210> 52

<211> 33

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: Примечание =

Синтетическая конструкция

<400> 52

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg Pro Ser

20 25 30

Ser

<210> 53

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность эксендина-3

<400> 53

His Ser Asp Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<210> 54

<211> 31

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность варианта эксендина-4

<400> 54

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Met Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Trp Leu Lys Asn Gly Gly Pro

20 25 30

<210> 55

<211> 39

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность 14Leu25Phe варианта эксендина-4

<400> 55

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Leu Ser Lys Gln Leu Glu Glu

1 5 10 15

Glu Ala Val Arg Leu Phe Ile Glu Phe Leu Lys Asn Gly Gly Pro Ser

20 25 30

Ser Gly Ala Pro Pro Pro Ser

35

<---

1. Способ лечения субъекта с заболеванием, связанным с центральной нервной системой (ЦНС), или ослабления по меньшей мере одного симптома заболевания, связанного с ЦНС, у субъекта, нуждающегося в этом, при этом способ включает:

введение в системный кровоток субъекта терапевтически эффективного количества нейропротективного полипептида с помощью состава с контролируемым высвобождением, содержащего по меньшей мере один биоразлагаемый полимер, причем нейропротективный полипептид включает по меньшей мере один нейропротективный полипептид, выбираемый из группы, состоящей из GLP-1, эксендина-4 или терапевтически эффективного аналога GLP-1 или эксендина-4,

причем нейропротективный полипептид связывается и активирует рецептор, который связывает по меньшей мере один из GLP-1, эксендина-4 или их комбинации; и

причем состав с контролируемым высвобождением также содержит материал покрытия, и биоразлагаемый полимер имеет определенную вязкость, так что биодоступность и замедленное высвобождение эффективного количества нейропротективного полипептида осуществляется в течение достаточного периода времени;

где заболевание, связанное с ЦНС, выбирают из группы, состоящей из болезни Паркинсона (PD), черепно-мозговой травмы (TBI), болезни Альцгеймера (AD), множественной системной атрофии, болезни Хантингтона, деменции с тельцами Леви (DLB), смешанной деменции, лобно-височной деменции или их комбинации,

где нейропротективный состав с контролируемым высвобождением содержит микросферу с контролируемым высвобождением, которая включает ядро с нейропротективным полипептидом и по меньшей мере одним биоразлагаемым полимером; и слой покрытия, который покрывает ядро,

где слой покрытия включает материал покрытия, выбранный из группы, состоящей из основных аминокислот, полипептидов и органических азотсодержащих соединений.

2. Способ по п. 1, в котором состав с контролируемым высвобождением представляет собой состав нейропротективного полипептида длительного действия.

3. Способ по п. 2, в котором состав длительного действия включает депо-состав для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.

4. Способ по п. 2, в котором состав длительного действия включает композицию для замедленного высвобождения нейропротективного полипептида.

5. Способ по п. 1, в котором биоразлагаемый полимер выбирают из группы, состоящей из полилактида (PLA), полигликолида (PGA), сополимера лактида и гликолида (PLGA), полиортоэфира, полиангидрида, полигидроксимасляной кислоты, поликапролактона и полиалкилкарбоната, сополимера или простой смеси двух или более, выбираемых из группы полимеров, сополимера полимера и полиэтиленгликоля (PEG) или комплекса полимер-сахар, в котором сахар связан с полимером или сополимером.

6. Способ по любому из пп. 1-5, в котором введение нейропротективного состава с контролируемым высвобождением включает инъекцию субъекту нейропротективного состава с контролируемым высвобождением.

7. Способ по п. 6, в котором инъекция субъекту состава с контролируемым высвобождением представляет собой подкожную инъекцию.

8. Способ по любому из пп. 1-7, в котором состав с контролируемым высвобождением вводят в следующий раз через приблизительно 7-21 день (например, один раз каждые приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11, приблизительно 12, приблизительно 13, приблизительно 14, приблизительно 15, приблизительно 16, приблизительно 17, приблизительно 18, приблизительно 19, приблизительно 20 или приблизительно 21 дней) после предшествующего введения.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором введение нейропротективного полипептида в системный кровоток ослабляет по меньшей мере один симптом по меньшей мере одного связанного с ЦНС заболевания у субъекта.

10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором введение состава с контролируемым высвобождением приводит к стационарной концентрации нейропротективного полипептида в плазме, которая находится в диапазоне от приблизительно 50 до приблизительно 4500 пг/мл.

11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором введение состава с контролируемым высвобождением приводит к нарастающему увеличению концентрации нейропротективного полипептида в по меньшей мере одном из спинномозговой жидкости (CSF), головного мозга или их комбинации.

12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором концентрация нейропротективного полипептида в CSF находится в диапазоне от приблизительно 10 до приблизительно 400 пг/мл.

13. Способ по любому из пп. 1-12, в котором отношение стационарной концентрации полипептида в CFS к таковой в плазме находится в диапазоне от приблизительно 0,1% до приблизительно 5%.

14. Способ по любому из пп. 1-13, в котором аналог эксендина-4 представлен химической формулой I или его фармацевтически приемлемой солью:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 Xaa27 Xaa28-Z₁ (Химическая формула I),

где

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;

Xaa2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;

Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu;

Xaa4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;

Xaa6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;

Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr;

Xaa9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицин или Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;

Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val, или Met;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;

Xaa21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg или С1-С10 алканоил с прямой или разветвленной цепью;

Xaa22 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa23 представляет собой Ile, Val, Leu, пентилглицин, трет-бутилглицин или Met;

Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp;

Xaa25 представляет собой Ala, Trp, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;

Xaa27 представляет собой Ala или Lys;

Xaa28 представляет собой Ala или Asn; и

Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂,

Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, 3Hyp, 4Hyp, тиопролина, N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина или N-алкилаланина, Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser), и

Z₂ представляет собой -OH или -NH₂,

при условии, что

не более трех из Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25, Xaa26, Xaa27 и Xaa28 представляют собой Ala; и

когда Xaa1 представляет собой His, Arg или Tyr, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 представляет собой Ala.

15. Способ по любому из пп. 1-13, в котором аналог эксендина-4 представлен химической формулой II или его фармацевтически приемлемой солью:

Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 Xaa13 Xaa14 Xaa15 Xaa16 Xaa17 Ala Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 Xaa25 Xaa26 X₁-Z₁ (Химическая формула II),

где

Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr, Ala, Norval, Val, Norleu или 4-имидазопропионил;

Xaa2 представляет собой Ser, Gly, Ala или Thr;

Xaa3 представляет собой Ala, Asp или Glu;

Xaa4 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu или Gly;

Xaa5 представляет собой Ala или Thr;

Xaa6 представляет собой Ala, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa7 представляет собой Thr или Ser;

Xaa8 представляет собой Ala, Ser или Thr;

Xaa9 представляет собой Ala, Norval, Val, Norleu, Asp или Glu;

Xaa10 представляет собой Ala, Leu, Ile, Val, пентилглицин или Met;

Xaa11 представляет собой Ala или Ser;

Xaa12 представляет собой Ala или Lys;

Xaa13 представляет собой Ala или Gln;

Xaa14 представляет собой Ala, Leu, Ile, пентилглицин, Val, или Met;

Xaa15 представляет собой Ala или Glu;

Xaa16 представляет собой Ala или Glu;

Xaa17 представляет собой Ala или Glu;

Xaa19 представляет собой Ala или Val;

Xaa20 представляет собой Ala или Arg;

Xaa21 представляет собой Ala, Leu или Lys-NHε-R (где R представляет собой Lys, Arg, C1-C10 алканоил с прямой или разветвленной цепью или циклоаллеил-алканоил);

Xaa22 представляет собой Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa23 представляет собой Ile, Val, Leu, пентилглицин, трет-бутилглицин или Met;

Xaa24 представляет собой Ala, Glu или Asp;

Xaa25 представляет собой Ala, Trp, Phe, Tyr или нафтилаланин;

Xaa26 представляет собой Ala или Leu;

X₁ представляет собой Lys Asn, Asn Lys, Lys-NHε-R Asn, Asn Lys-NHε-R, Lys-NHε-R Ala, Ala Lys-NHε-R, где R представляет собой Lys, Arg, C1-C10 алканоил с прямой или разветвленной цепью или циклоалкилалканоил;

Z₁ представляет собой -OH, -NH₂, Gly-Z₂, Gly Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37-Z₂, Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38-Z₂ или Gly Gly Xaa31 Ser Ser Gly Ala Xaa36 Xaa37 Xaa38 Xaa39-Z₂;

Xaa31, Xaa36, Xaa37 и Xaa38 независимо выбирают из группы, состоящей из Pro, гомопролина, 3Hyp, 4Hyp, тиопролина, N-алкилглицина, N-алкилпентилглицина или N-алкилаланина, Xaa39 представляет собой Ser или Tyr (например, Ser), и

Z₂ представляет собой -OH или -NH₂,

при условии, что

не более трех из Xaa3, Xaa4, Xaa5, Xaa6, Xaa8, Xaa9, Xaa10, Xaa11, Xaa12, Xaa13, Xaa14, Xaa15, Xaa16, Xaa17, Xaa19, Xaa20, Xaa21, Xaa24, Xaa25 и Xaa26 представляют собой Ala; и

когда Xaa1 представляет собой His, Arg, Tyr или 4-имидазопропионил, по меньшей мере один из Xaa3, Xaa4 и Xaa9 представляет собой Ala.

16. Способ по любому из пп. 1-13, в котором нейропротективный полипептид выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-55.