Способ активации цитотоксических т-лимфоцитов в популяции мононуклеарных клеток крови при помощи мембранных везикул, полученных из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы м14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2

Изобретение относится к области клеточной биологии, более точно к способам увеличения популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов в смешанной культуре мононуклеарных клеток периферической крови при помощи индуцированных цитохалазином B мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток со сверхэкспрессией интерлейкина 2, например, клеток линии меланомы М14, in vitro. Изобретение может быть использовано для разработки и улучшения существующих адъювантных способов терапии и противоопухолевых вакцин на основе производных клеток пациента. Изобретение позволяет увеличивать число активированных цитотоксических Т-лимфоцитов человека для улучшения противоопухолевого иммунного ответа. 2 ил., 1 пр.

 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, ветеринарии, фармакологии, клеточной биологии, более точно к способам увеличения популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов в смешанной культуре мононуклеарных клеток периферической крови при помощи индуцированных цитохалазином В мембранных везикул, полученных из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 со сверхэкспрессией IL-2 in vitro. Изобретение может быть использовано для разработки и улучшения существующих адъювантных способов терапии и противоопухолевых вакцин на основе опухолевых клеток, в том числе, производных клеток пациента.

Далее в целях исключения неоднозначного понимания текста заявителем приведены использованные в заявочном материале термины и их расшифровка:

Адъювантная терапия - дополнительное лечение рака, проводимое после основного лечения, чтобы снизить риск рецидива рака, которая может включать химиотерапию, лучевую терапию, гормональную терапию, таргетную терапию или биологическую терапию.

иМВ - индуцированные мембранные везикулы.

ЦТЛ - цитотоксические Т-лимфоциты.

ДК - дендритные клетки.

МНК ПК - мононуклеарные клетки периферической крови.

ГКГС - главный комплекс гистосовместимости.

IL-2 - интерлейкин 2 человека.

LV - лентивирус.

rhIL-2 - рекомбинантный человеческий интерлейкин 2.

rhIL-7 - рекомбинантный человеческий интерлейкин 7.

rhIL-15 - рекомбинантный человеческий интерлейкин 15.

М14-IL-2 - клетки меланомы линии М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2.

иМВ-М14-IL-2 - индуцированные мембранные везикулы выделенные из клеток меланомы линии М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2.

На дату представления заявочных материалов в области онкологии существует объективная проблема по повышению эффективности терапии и лечения онкозаболеваний различной этиологии, в частности, при помощи иммунотерапии. Известно, что лечение консервативными способами, в число которых входит хирургия, лучевая и химиотерапия, позволяет удалить значительную массу опухолевых очагов, однако не позволяет уничтожить все диссеминированные по организму клетки, которые становятся причиной рецидива заболевания в будущем [Yang Y. Cancer immunotherapy: harnessing the immune system to battle cancer. J Clin Invest. 2015 Sep; 125(9):3335-7. doi: 10.1172/JCI83871]. Таким образом, разработка способов, способных безопасно и целенаправленно уничтожать опухолевые клетки по всему организму, является актуальной.

На основании вышеизложенного можно сделать вывод, что существует проблема разработки новых и улучшения существующих методов терапии онкологических заболеваний с использованием иммунотерапии. Однако большинство иммунотерапевтических подходов не показывают ожидаемой эффективности в клинических испытаниях на человеке в виду индукции слабого противоопухолевого иммунного ответа.

Заявителем проведен анализ существующего уровня техники по научной и патентной информации в области активации и выявлены следующие аналоги.

Известен источник «Analysis of immunomodulating properties of cytochalasin B induced membrane vesicles, isolated from human melanoma cells in vitro» [Filin I.Y. «Analysis of immunomodulating properties of cytochalasin B induced membrane vesicles, isolated from human melanoma cells in vitro» / Сборник научных трудов всероссийской конференции с международным участием «Регенеративная биология и медицина» // I. Y. Filin. - 2019. - C. 4-5], в котором показывается принципиальная возможность использования иМВ-M14-IL-2 в качестве терапевтического иммуномодулирующего агента.

Недостатком известного технического решения является то, что приведенные результаты не могут быть использованы для разработки и улучшения существующих адъювантных способов терапии и противоопухолевых вакцин на основе опухолевых клеток, в том числе, производных клеток пациента, т.к. протокол описанного способа не позволяет достичь иммунотерапевтического эффекта необходимого и достаточного для применения в области медицины, ветеринарии, фармакологии, клеточной биологии. Таким образом, сущность способа активации цитотоксических Т-лимфоцитов в популяции мононуклеарных клеток крови при помощи мембранных везикул, полученных из генетически модифицированных опухолевых клеток со сверхэкспрессией интерлейкина 2, представленная в данной заявке, ранее не была опубликована.

Известен источник [«Analysis of CD markers of immune cells after interaction with melanoma cells membrane vesicles» (тезис сборника конференции «ESGCT»]. Сущностью является способ загрузки иМВ-М14-IL-2 в дендритные клетки для использования в качестве противоопухолевой вакцины.

Недостатком известного технического решения является использование дендритных клеток в качестве антиген-презентирующих клеток, что значительно усложняет процесс иммуномодуляции.

Известен источник [https://link.springer.com/article/10.1007/s00432-006-0184-7] «Increased induction of antitumor response by exosomes derived from interleukin-2 gene-modified tumor cells». Сущностью является способ, заключающийся в генетической модификации опухолевых клеток линии E.G7-OVA аденовирусом, кодирующим ген IL-2 и получения опухолевых экзосом путем серийного центрифугирования и ультрацентрифугирования в градиентах сахарозы. Для демонстрации их противоопухолевого действия IL-2-содержащие экзосомы (Exo/IL-2) вводили подкожно мышам C57BL/C: либо с опухолью, либо с последующей инокуляцией опухоли. Вакцинация этими Exo/IL-2 может более эффективно индуцировать антигенспецифический T-хелперный-1-поляризованный иммунный ответ и ЦТЛ, что приводит к более значительному ингибированию роста опухоли. CD8⁺ T-клетки являются основными эффекторными клетками, однако CD4⁺ T-клетки и NK-клетки также участвуют в индукции противоопухолевого ответа при таком подходе. Показано, что генетическая модификация IL-2 опухолевых клеток может привести к тому, что выделенные из опухоли экзосомы будут содержать IL-2 с повышенными противоопухолевыми эффектами, что представляет собой многообещающий способ создания противоопухолевой вакцины на основе экзосом.

Таким образом, в известном источнике описывается способ использования экзосом опухолевых клеток со сверхэкспрессией IL-2 в качестве противоопухолевой вакцины.

Недостатком известного технического решения является использование естественных экзосом опухолевых клеток, известный метод требует использования ультрацентрифугирования для осаждения частиц, что значительно удорожает итоговый продукт. Кроме того, сбор естественных экзосом характеризуются малым выходом, что снижает эффективность способа и его промышленную применимость.

Известно изобретение по патенту RU 2680539 «Способ активации хелперных Т-клеток и композиция для применения в данном способе». Сущность изобретения заключается в добавлении пептида WT1 к антиген-презентирующим клеткам и, посредством этого, активации хелперных Т-клеток, где пептид WT1 способен связываться с любой из молекулы HLA-DRB1*1501, молекулы HLA-DRB1*0901 и молекулы HLA-DRB1*0501, и композиции для этого, фармацевтической композиции для лечения и/или профилактики рака путем активации хелперных Т-клеток и им подобных. 1. Способ активации хелперных Т-клеток, включающий приведение антиген-презентирующей клетки в контакт с пептидом WT1 и, таким образом, активацию хелперных Т-клеток, где пептид WT1 обладает способностью связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501, и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и антиген-презентирующая клетка является положительной по меньшей мере по одной из молекул, выбранных из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501; и хелперные Т-клетки экспрессируют комплекс TCR-CD3, который распознает комплекс пептида WT1 и молекулы HLA, выбранной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501. Способ по п. 1, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502. Способ по п. 1, в котором стадию приведения антиген-презентирующей клетки в контакт с пептидом WT1 осуществляют путем добавления пептида WT1 к антиген-презентирующей клетке. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, страдающего WT1-специфическим злокачественным новообразованием, включающий приведение антиген-презентирующей клетки субъекта в контакт с пептидом WT1 in vivo и, таким образом, активацию хелперных Т-клеток у субъекта, где пептид WT1 обладает способностью связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501 и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и антиген-презентирующая клетка является положительной по меньшей мере по одной из молекул, выбранных из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501; и хелперные Т-клетки экспрессируют комплекс TCR-CD3, который распознает комплекс пептида WT1 и молекулы HLA, выбранной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501. Способ по п. 4, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502. Способ по п. 4, в котором стадию приведения антиген-презентирующей клетки в контакт с пептидом WT1 осуществляют путем добавления пептида WT1 к антиген-презентирующей клетке. Способ по п. 4, где WT1-специфическое злокачественное новообразование представляет собой гематопоэтическую опухоль или солидный рак. Способ по п. 7, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому или злокачественную лимфому. Способ по п. 7, где солидный рак представляет собой рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, рак клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, страдающего WT1-специфическим злокачественным новообразованием, включающий приведение антиген-презентирующей клетки субъекта в контакт с пептидом WT1 in vitro и, таким образом, активацию хелперных Т-клеток, и введение активированных хелперных Т-клеток субъекту, где пептид WT1 способен связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501, и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и антиген-презентирующая клетка является положительной по меньшей мере по одной из молекул, выбранных из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501; и хелперные Т-клетки экспрессируют комплекс TCR-CD3, который распознает комплекс пептида WT1 и молекулы HLA, выбранной из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501. Способ по п. 10, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502. Способ по п. 10, где WT1-специфическое злокачественное новообразование представляет собой гематопоэтическую опухоль или солидный рак. Способ по п. 12, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому или злокачественную лимфому. Способ по п. 12, где солидный рак представляет собой рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, рак клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников. Способ индукции иммунного ответа у субъекта, страдающего WT1-специфическим злокачественным новообразованием, включающий введение пептида WT1 субъекту, у которого было диагностировано WT1-специфическое злокачественное новообразование, где пептид WT1 обладает способностью связываться с молекулой HLA-DRB1*1501, молекулой HLA-DPB1*0901 и молекулой HLA-DPB1*0501, и где пептид WT1 представляет собой пептид, состоящий из аминокислотной последовательности: Lys Arg Tyr Phe Lys Leu Ser His Leu Gln Met His Ser Arg Lys His (SEQ ID NO: 2); и субъект имеет молекулу HLA, выбранную из HLA-DRB1*1501, HLA-DPB1*0901 и HLA-DPB1*0501. Способ по п. 15, где пептид WT1 дополнительно способен связываться с молекулой HLA-DRB1*0405 и/или молекулой HLA-DRB1*1502. Способ по п. 15, где WT1-специфическое злокачественное новообразование представляет собой гематопоэтическую опухоль или солидный рак. Способ по п. 17, где гемопоэтическая опухоль представляет собой лейкоз, миелодиспластический синдром, множественную миелому или злокачественную лимфому. Способ по п. 17, где солидный рак представляет собой рак желудка, рак толстой кишки, рак легких, рак молочной железы, рак клеток, рак печени, рак кожи, рак мочевого пузыря, рак предстательной железы, рак матки, рак шейки матки или рак яичников.

Таким образом, в известном изобретении в целом описывается метод опосредованной антиген-презентирующими клетками активации хелперных Т-клеток при помощи добавления пептида WT1.

Недостатком известного технического решения является отсутствие специфичной к опухоли активации клеток, что может снижать эффективность противоопухолевого ответа.

Известно изобретение по патенту RU 2751837 «Способ активации цитотоксических лимфоцитов». Сущность изобретения Способ активации цитотоксических лимфоцитов, включающий обработку клеток крови пептидом, содержащим аминокислотный сиквенс His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1), или его фармацевтически приемлемыми солями в концентрации, усиливающей способность цитотоксических лимфоцитов лизировать трансформированные клетки организма, представляющие собой клетки рака или инфицированные вирусом клетки. Способ по п. 1, в котором клетки рака являются клетками рака легких. Способ по п. 1, в котором клетки рака являются клетками рака шейки матки. Способ по п. 1, в котором клетки рака являются клетками лейкоза. Способ по п. 1, в котором вирус является вирусом папилломы человека. Способ по п. 1, результатом которого является активация NK-лимфоцитов. Способ по п. 1, результатом которого является активация Т-лимфоцитов. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, продуцирующих интерферон-гамма. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор CD25. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор CD69. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор NKG2D. Способ по п. 1, результатом которого является увеличение доли лимфоцитов, экспрессирующих активационный рецептор CD226. Способ по п. 1, результатом которого является снижение доли лимфоцитов, экспрессирующих ингибирующие рецепторы семейства KIR. Способ по п. 13, в котором ингибирующий рецептор семейства KIR является KIR2DL3, KIR3DL1, KLRG1. Способ по п. 1, в котором лимфоциты обрабатывают путем введения пептида His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1) в кровь пациента. Способ по п. 1, в котором лимфоциты обрабатывают путем интратуморального введения пептида His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1). Способ по п. 1, в котором лимфоциты выделяют из периферической крови и инкубируют в питательной среде, содержащей пептид His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1). Применение способа по п. 1 для повышения чувствительности цитотоксических лимфоцитов к интерлейкину 12. Применение способа по п. 1 для повышения чувствительности цитотоксических лимфоцитов к интерлейкину 2. Применение способа по п. 1 для поддержания популяции NK-клеток в функционально активном состоянии в процессе цитотоксической реакции с трансформированными клетками организма, представляющими собой клетки рака или инфицированные вирусом клетки.Таким образом, в известном изобретении в целом описывается метод активации ЦТЛ при помощи пептида His-Gly-Val-Ser-Gly-Trp-Gly-Gln-His-Gly-Thr-His-Gly (SEQ ID No. 1).

Недостатком известного технического решения является отсутствие опухолевых антигенов при активации ЦТЛ данным способом, что может снизить противоопухолевую активность полученных ЦТЛ.

Известно изобретение по патенту RU 2619186 «Способ получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена». Способ получения in vitro популяций активированных антигенспецифических противоопухолевых цитотоксических Т-лимфоцитов, специфичных к эпитопам опухоль-ассоциированного антигена, включающий получение прилипающей и неприлипающей фракции мононуклеарных клеток (МНК), выделенных из периферической крови человека, получение дендритных клеток (ДК) путем стимуляции их дифференцировки из прилипающей фракции МНК и антигенную активацию полученных зрелых ДК опухоль-ассоциированным антигеном, совместное культивирование клеток из неприлипающей фракции с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции, последующее выделение фракции антигенспецифических Т-лимфоцитов с помощью окрашивания антигенспецифическими реагентами, стимуляцию роста выделенных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) с использованием рекомбинантного человеческого интерлейкина 2 (rhIL-2), интерлейкина 7 (rhIL-7) и интерлейкина 15 (rhIL-15), отличающийся тем, что антигенную активацию полученных зрелых ДК осуществляют с использованием ДНК-конструкции, кодирующей эпитопы KIFGSLAFL и RLLQETELV опухоль-ассоциированного белка HER2, совместному культивированию с аутологичными зрелыми антиген-активированными ДК из прилипающей фракции подвергают все клетки неприлипающей фракции МНК, далее из совместной культуры ДК и МНК выделяют цитотоксические Т-лимфоциты, специфичные к эпитопам KIFGSLAFL и RLLQETELV белка HER2 методом магнитной сепарации с использованием антигенспецифических реагентов, обеспечивающих обратимое окрашивание выделяемых клеток, а после выделения HER2-специфических ЦТЛ производят стимуляцию их пролиферации посредством культивирования в присутствии внесенных одновременно цитокинов rhIL-2, rhIL-7, rhIL-15 в течение 14-20 суток, причем конечная концентрация каждого из цитокинов rhIL-2, rhIL-7 и rhIL-15 составляет 50 нг/мл. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве окрашивающего антигенспецифического реагента используют стрептамеры.

Таким образом, в известном изобретении в целом описывается способ активации ЦТЛ, специфичных к HER2, опосредованный активацией ДК.

Недостатком известного технического решения является узкая направленность иммунного ответа - против HER2-экспрессирующих опухолевых клеток, а также сложность активации ЦТЛ опосредованно через ДК. Кроме того, описанный способ предполагает использование дополнительное использование rhIL-2, что усложняет использование изобретения.

Известно изобретение по патенту RU 2745319 «Получение антигенспецифических T-клеток». Сущность способа заключается в получении популяции антигенспецифических ЦТЛ, обладающих фенотипом центральной памяти и эффекторной памяти, включает предоставление образца, содержащего наивные T-клетки от пациента или подходящего донора; обогащение образца CD8⁺ Т-клетками; приведение образца в контакт с парамагнитными наночастицами, содержащими на своей поверхности: способ по п. 1 антигенпрезентирующий комплекс главный комплекс гистосовместимости (ГКГС) класса I-пептид, полученный при помощи пассивной нагрузки наночастиц, конъюгированных с главным комплексом гистосовместимости ГКГС класса I; и способ по п. 2 анти-CD28 костимулирующий лиганд, которые находятся в одной или разных популяциях наночастиц.

Таким образом, в известном изобретении в целом описывается метод получения популяции антигенспецифических ЦТЛ с помощью парамагнитных наночастиц, содержащих ГКГС пептид-1 и анти-CD28 костимулирующий лиганд.

Недостатком известного технического решения является использование искусственных матриц - наночастиц - для активации ЦТЛ увеличивает стоимость использования данного способа.

Техническим результатом заявленного технического решения является разработка способа увеличения количества активированных цитотоксических Т-лимфоцитов при помощи мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2 человека in vitro, что дает усиление противоопухолевого иммунного ответа путем повышения количества активированных ЦТЛ в культуре клеток.

Сущностью заявленного технического решения является способ увеличения количества активированных цитотоксических Т-лимфоцитов в популяции мононуклеарных клеток крови при помощи индуцированных мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2 человека in vitro заключающийся в том, что культивируют опухолевые клетки меланомы М14, после чего получают репликативно дефектный лентивирус, кодирующий ген IL-2 и генетически модифицируют опухолевые клетки меланомы М14, далее анализируют экспрессию функционально активного белка IL-2, получают индуцированные мембранные везикулы из М14-IL-2 при помощи цитохалазина В, добавляют мембранные везикулы, выделенные из М14-IL-2, к мононуклеарам периферической крови, затем проводят анализ популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов.

Заявленное техническое решение поясняется Фиг. 1 и Фиг. 2.

На Фиг. 1 показан вестерн-блот-анализ секреции белков IL-2 в иМВ, выделенных из нативных опухолевых клеток М14 (иМВ-М14 нативные) и иМВ, выделенных из клеток М14, генетически модифицированных лентивирусом, кодирующим ген IL-2 (иМВ-М14-IL-2). Нативные М14 - не модифицированные клетки меланомы человека и использованы в качестве контрольного образца, где:

16 кДа - молекуярная масса белка IL-2,

42 кДа - молекуярная масса белка β-актина,

IL-2 - искомый белок IL-2,

β-актин - белок β-актин, используемый в качестве контроля реакции.

На Фиг. 2 показаны результаты анализа числа активированных иммунных клеток здорового человека, в частности CD3⁺CD4^-CD8⁺ T-киллеров после культивирования с иМВ, выделенных из М14-IL-2 (иМВ-М14-IL-2). Нативные МКПК - образец мононуклеарных клеток из периферической крови человека, культивировавшихся без иМВ, где ** - статистическая достоверная разница.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Заявленное техническое решение основывается на том, что иммуномодулирующий цитокин IL-2 связывается с рецепторами IL-2 на поверхности Т-лимфоцитов, активируя внутриклеточные сигнальные пути, которые включают гены, помогающие Т-лимфоцитам пролиферировать и дифференцироваться в активированные ЦТЛ. А мембранные везикулы, выделенные из опухолевых клеток, например, клеток меланомы линии М14, несут на своей поверхности антигены опухоли, которые способствуют нацеливанию активированных ЦТЛ против опухоли, которое происходит за счёт распознавания Т-лимфоцитами опухолевых антигенов на поверхности иМВ. Таким образом, использование индуцированных мембранных везикул, выделенных из генетически модифицированных геном иммуномодулирующего цитокина IL-2 опухолевых клеток, например, меланомы М14, оказывает комбинированный эффект на увеличение количества активированных ЦТЛ.

Указанный технический результат становится возможным вследствие использования комбинации индуцированных мембранных везикул, выделенных из опухолевых клеток, например, меланомы М14, которые содержат на поверхности мембраны антигены опухолевых клеток и дополнительного иммуномодулирующего фактора - цитокина IL-2, который способствует дифференцировке Т-лимфоцитов в активированные ЦТЛ.

Указанный подход основан на том, что индуцированные мембранные везикулы, выделенные из опухолевых клеток, несут антигенный материал опухоли, который позволяет эффективно генерировать специфический противоопухолевый иммунный ответ, основанный на активации ЦТЛ, а присутствие иммуномодулирующего цитокина IL-2 активирует внутриклеточные сигнальные пути пролиферации и дифференцировки в активированные ЦТЛ.

Заявленное техническое решение предоставляет возможность решить проблему недостаточной активации ЦТЛ при проведении противоопухолевой терапии у пациентов, например, при использовании противоопухолевых вакцин, что позволит повысить терапевтический эффект по сравнению с аналогами.

Таким образом, краткая сущность заявленного технического решения заключается в разработке способа увеличения количества активированных цитотоксических Т-лимфоцитов в популяции мононуклеарных клеток при помощи индуцированных мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 in vitro, для улучшения существующих адъювантных способов терапии и противоопухолевых вакцин с использованием опухолевых клеток меланомы М14, в том числе на основе производных клеток пациента.

Заявленное техническое решение осуществляется в 5 этапов:

1 этап: культивируют опухолевые клетки меланомы М14;

2 этап: получают репликативно-дефектный лентивирус, кодирующий ген IL-2 и проводят генетическую модификацию опухолевых клеток,

3 этап: проводят анализ экспрессии функционально активного белка IL-2,

4 этап: выделяют индуцированные мембранные везикулы из М14-IL-2 при помощи цитохалазина В;

5 этап: добавляют индуцированные мембранные везикулы, выделенные из М14-IL-2, к мононуклеарам периферической крови, проводят анализ популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов.

Далее заявителем приведен пример осуществления заявленного технического решения.

Пример . Активация цитотоксических Т-лимфоцитов в популяции мононуклеарных клеток крови при помощи мембранных везикул, полученных из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2.

Первый этап - культивирование опухолевых клеток

Берут опухолевые клетки меланомы М14, культивируют их на питательной среде RPMI-1640 (производства фирмы ПанЭко, Россия) содержащей 10 % фетальной телячьей сыворотки (производства фирмы Invitrogen, США), L-глутамин (ПанЭко, Россия) и смесь антибиотиков пенициллин-стрептомицин (производства фирмы ПанЭко, Россия) при температуре 37°C, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂.

Второй этап - получение репликативно дефектного лентивируса, кодирующий ген IL-2 и генетическая модификация опухолевых клеток

Репликативно дефектные лентивирусы (LV) получают путем трансфекции клеток HEK293T кальций фосфатым методом тремя кодирующими плазмидами: генетической конструкцией pLX304-IL-2; упаковочной плазмидой (pCMV-dR8.2 dvpr, Addgene #8455, США); оболочечной плазмидой (pCMV-VSV-G, Addgene #8454, США). Полученные LV-IL-2 концентрируют ультрацентрифугированием в течение 2 часов при 26000 об/мин.

Полученный LV-IL-2 используют для генетической модификации опухолевых клеток, например линии меланомы М14. Для этого клетки меланомы высевают на 6-луночный планшет в количестве 10000 клеток на лунку. На следующий день добавляют LV-IL-2 с множественностью инфекции (MOI) 10 и культивируют в бессывороточной среде RPMI-1640 в течение 6 часов. В конце инкубации клетки отмывают от вируса и добавляют свежую полную среду RPMI-1640. Чтобы отобрать генетически модифицированнные клетки, М14-IL-2 культивируют в присутствии селективного антибиотика бластицидин S (5 мкг/мл, Invitrogen, США) в течение 10 дней. Полученные клетки М14-IL-2 используют для дальнейшей работы.

Третий этап - анализ экспрессии функционально активного белка IL-2

Анализ экспрессии белка IL-2 в генетически модифицированных М14-IL-2 проводят с помощью вестерн-блот-анализа. Для выделения общего белка образцы нативных и генетически модифицированных клеток М14 (1×10⁶ клеток) лизируют в RIPA буфере, содержащем ингибитор протеаз, затем центрифугируют при 12000 об/мин в течение 30 минут. Равные объемы лизатов разделяют в 4-12% градиентных гелях и переносят на нитроцеллюлозную мембрану с размером пор 0,2 мкм (#162-0112, BioRad, США) с использованием транс-блот-системы для полусухого электрофоретического переноса (BioRad, США). Мембраны с белками инкубируют в течение ночи с первичными антителами. Используемые в работе первичные антитела: anti-IL-2 (#ab180780, Abcam, разведение 1:100). Затем мембраны инкубируют со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (#8a0467j, American Qualex Antibodies, США) в разведении 1:2000 в течение 2 часов. Белки визуализируют с использованием субстрата Clarity™ Western ECL (#1705061, BioRad, США) в системе ChemiDoc XRS+ (BioRad, США).

По результатам анализа заявителем была подтверждена секреция белка IL-2 в М14-IL-2 (Фиг. 1).

Четвертый этап - выделение индуцированных мембранных везикул из М14-IL-2 при помощи цитохалазина В.

Для выделения мембранных везикул берут 10*10⁶ клеток М14-IL-2, разбавляют в 5 мл бессывороточной среды RPMI-1640 и добавляют цитохалазин B (Sigma- Aldrich, США) в соотношении 1:6000. После 30 минут инкубации при 37°C во влажной атмосфере с поддержанием 5% уровня СО₂, клеточную суспензию необходимо энергично встряхивать в течение минуты, после чего осадить клетки при 500 g в течение 10 минут. Супернатант необходимо дважды отцентрифугировать (700 g в течение 10 минут и 12000 g в течение 15 минут). Полученный осадок содержит индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы клеток М14-IL-2.

Пятый этап - добавление индуцированных мембранных везикулы, выделенных из М14-IL-2, к мононуклеарам периферической крови, проведение анализа популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов.

Для анализа популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов получают иммунные клетки, например мононуклеарные клетки (ядросодержащие клетки крови) из крови человека или животных с применением стандартных культуральных методов. Например, выделение мононуклеарных клеток из крови осуществляют посредством центрифугирования крови в градиенте плотности фиколла (плотность 1,077 г/мл, производства фирмы ПанЭко, Россия). Мононуклеарные клетки культивируют на культуральном пластике в питательной среде, например RPMI-1640 (производства фирмы ПанЭко, Россия), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки (производства фирмы Invitrogen, США), L-глутамин (производства фирмы ПанЭко, Россия) и смесь антибиотиков пенициллин-стрептомицин (производства фирмы Биолот, Россия) при температуре 37°C, во влажной атмосфере, содержащей 5% СО₂.

К свежевыделенным мононуоклеарным клеткам добавляют полученные индуцированные цитохалазином В мембранные везикулы клеток М14-IL-2 в концентрации 300 мкг/мл (в пересчете на концентрацию белка). Культивируют в течение 24 часов, после проводят окрашивание, согласно инструкции производителя, на активированные ЦТЛ при помощи панели антител: анти-CD4 антитело (например, Pacific Blue anti-human CD4 antibody, #317429 BioLegend, США), анти-CD8 антитело (например, FITC anti-human CD8a anti-body, #300906, BioLegend, США), анти-HLA-DR антитело (например, PE anti-human HLA-DR antibody, #307605, BioLegend, США) и анализируют полученные результаты при помощи проточной цитофлуориметрии по известной методике (например, на приборе FACS Aria III, BD, США).

По результатам анализа заявителем было подтверждено увеличение количества активированных ЦТЛ (Фиг. 2).

Из данных, приведенных на Фиг. 1 видно, что в М14-IL-2, а также в иМВ, выделенных из М14-IL-2, синтезируется белок IL-2. Такие данные показывают, что генетическая модификация клеток М14 лентивирусом, кодирующим ген IL-2, привела к способности данных клеток синтезировать соответствующий белок и указывает на наличие данного белка в иМВ, выделенных из М14-IL-2.

Из данных, приведенных на Фиг. 2, видно, что обнаружено увеличение числа CD3⁺CD4^-CD8⁺ T-киллеров (ЦТЛ) после культивирования с иМВ, выделенными из М14-IL-2, (133,3 ± 3,4 %) по сравнению с МКПК, культивировавшихся отдельно (100,0 ± 0,16%). Такие данные показывают, что иМВ, выделенные из М14-IL-2, обладают иммуномодулирующей активностью и приводят к увеличению количества ЦТЛ.

Таким образом, графические материалы, иллюстрирующие примеры конкретного выполнения заявленного технического решения, доказывают возможность достижения заявленного технического результата, а именно:

- экспрессия белка IL-2 в М14-IL-2 подтверждается вестерн-блот-анализом с использованием специфичных антител;

- число CD3⁺CD4^-CD8⁺ T-киллеров (ЦТЛ) увеличивается на 33% в образце МКПК после культивирования с иМВ-М14-IL-2 по сравнению с образцами нативных МКПК и на 28% по сравнению с образцами МКПК после культивирования с иМВ-М14.

Таким образом, в примере экспериментально доказано, что использование заявленного технического решения на основе мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток со сверхэкспрессией интерлейкина 2 человека позволяет стимулировать увеличение активированных иммунных клеток.

Основываясь на приведенных экспериментальных данных, приведенных на Фиг. 1 - Фиг. 2 соответственно, представляется возможным сделать логический вывод о том, что иМВ, выделенные из опухолевых клеток, например, линии М14, со сверхэкспрессией интерлейкина 2 могут быть использованы для усиления иммунного ответа путем увеличения количества ЦТЛ в популяции мононуклеарных клеток периферической крови.

Таким образом, из вышеизложенного можно сделать общий вывод, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно: разработан способ увеличения количества активированных цитотоксических Т-лимфоцитов при помощи мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток со сверхэкспрессией интерлейкина 2 человека in vitro, что дает усиление противоопухолевого иммунного ответа путем повышения количества активированных ЦТЛ в культуре клеток.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как из исследованного уровня техники не выявлены источники, в которых описаны признаки, совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков, перечисленные в формуле изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемому к изобретениям, поскольку из исследованного уровня техники заявителем не выявлены технические решения, характеризующиеся использованием иМВ, выделенных из опухолевых клеток, анпример, линии М14, со сверхэкспрессией интерлейкина 2 для иммунологической модуляции путем увеличения количества ЦТЛ в популяции мононуклеарных клеток периферической крови

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость», предъявляемому к изобретениям, так как оно может быть использовано в промышленных масштабах для создания препаратов, предназначенных для лечения широкого спектра онкологических заболеваний человека.

Способ увеличения количества активированных цитотоксических Т-лимфоцитов в популяции мононуклеарных клеток крови при помощи индуцированных мембранных везикул из генетически модифицированных опухолевых клеток меланомы М14 со сверхэкспрессией интерлейкина 2 человека in vitro, заключающийся в том, что культивируют опухолевые клетки меланомы М14, после чего получают репликативно дефектный лентивирус, кодирующий ген IL-2 и генетически модифицируют клетки меланомы М14, далее анализируют экспрессию функционально активного белка IL-2, получают индуцированные мембранные везикулы из М14-IL-2 при помощи цитохалазина В, добавляют мембранные везикулы, выделенные из М14-IL-2, в концентрации 300 мкг/мл к мононуклеарам периферической крови, культивируют в течение 24 часов, затем проводят анализ популяции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов.