Иммуногенные композиции

Авторы патента:

ЭМБРОУСИНО, Донна (US)

БРОУЭРИНГ, Тереза Дж. (US)

КРОСС, Ален (US)

МАЛЛИ, Ричард (US)

МИЧОН, Фрэнсис (US)

САЙБЕР, Джордж, Рейнер (US)

САЙМОН, Рафаэль (US)

ТЕННАНТ, Шэрон (US)

A61K47/64 - Лекарственные препараты, отличающиеся используемыми неактивными ингредиентами, например носителями, инертными добавками

A61K39/108 - Escherichia; Klebsiella

A61K39/104 - псевдомонады

A61K39/0258 - Лекарственные препараты, содержащие антигены или антитела (материалы для иммунологического анализа G01N 33/53)

Владельцы патента RU 2791256:

ЮНИВЕРСИТИ ОФ МЭРИЛЭНД, БАЛТИМОР (US)
АФФИНИВАКС, ИНК. (US)

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к иммуногенной композиции, содержащей (i) каркасный полимер, включающий полимер и один или более антигенных полисахаридов, конъюгированных с полимером; и (ii) один или более полипептидных антигенов в нековалентном комплексе с полимером и/или антигенным полисахаридом; в которой полимер представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19; и в которой каждый из одного или более антигенных полисахаридов представляет собой O-антигенный полисахарид (OPS) K. pneumoniae и/или P. aeruginosa; и в которой каждый из одного или более полипептидных антигенов независимо выбран из: флагеллина P. aeruginosa, PcrV P. aeruginosa, MrkA K. pneumoniae, их антигенных фрагментов и их комбинации; и причем иммуногенная композиция характеризуется тем, что после введения субъекту она вызывает иммунный ответ против Klebsiella и/или Pseudomonas, также относится к иммуногенной композиции, содержащей (a) каркасный полимер, включающий (i) полимер, содержащий капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19; и (ii) один или более антигенных полисахаридов, содержащих O-антигенный полисахарид (OPS) Klebsiella и/или Pseudomonas, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19; и (b) один или более полипептидных антигенов в нековалентном комплексе с полимером за счет по меньшей мере одной пары аффинных молекул, включающей (i) первую аффинную молекулу, связанную с полимером; и (ii) вторую аффинную молекулу, комплементарную первой молекуле, и связанную с одним или более полипептидными антигенами, где каждый из одного или более полипептидных антигенов независимо выбран из: флагеллина P. aeruginosa, PcrV P. aeruginosa, MrkA K. pneumoniae, их антигенных фрагментов или их комбинации; и причем иммуногенная композиция характеризуется тем, что после введения субъекту она вызывает иммунный ответ против Klebsiella и/или Pseudomonas, также относится к вакцинным композициям, также относится к фармацевтической композиции, содержащей одну или более иммуногенных композиций или вакцинных композиций и фармацевтически приемлемый носитель, где фармацевтическая композиция отличается тем, что при введении пациенту она вызывает иммунный ответ против Klebsiella и/или Pseudomonas, также относится к способу иммунизации пациента против инфекции, вызываемой Klebsiella, и к способу иммунизации пациента против инфекции, вызываемой P. aeruginosa. Группа изобретений обеспечивает разработку технологий профилактики и/или лечения внутрибольничных инфекций и обеспечивает получение вакцин с достаточной иммуногенностью для создания иммунитета и предотвращения колонизации. 8 н. и 63 з.п. ф-лы, 98 ил., 36 табл., 16 пр.

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет на основании временной заявки на патент США номер 62/524315, поданной 23 июня 2017 г., и временной заявки на патент США номер 62/633807, поданной 22 февраля, 2018 г., содержание которых включено в настоящее описание посредством ссылки в полном объеме.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Нозокомиальная инфекция, также называемая внутрибольничной инфекцией, является основной проблемой, с которой сталкиваются пациенты в настоящее время. Опросы, проведенные в США в 183 больницах (Magill et al., 2014), показали, что из 11282 пациентов, 452 имели одну или более инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (4,0%; 95% доверительный интервал, 3,7-4,4). Из 504 таких инфекций, наиболее распространенными были пневмония (21,8%), инфекции операционного поля (21,8%) и желудочно-кишечные инфекции (17,1%). Clostridium difficile являлся наиболее часто упоминаемым патогеном (вызывающим 12,1% инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи). Инфекции, связанные с медицинскими устройствами (то есть, связанная с центральным катетером инфекция кровотока, связанная с катетером инфекция мочевыводящих путей и связанная с вентилирующим устройством пневмония), на которые традиционно были направлены программы по предотвращению инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, составляли 25,6% таких инфекций. По оценкам авторов изобретения, в больницах неотложной помощи в Соединенных Штатах Америки (США) в 2011 г. находились 648000 пациентов с 721800 инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи.

С резким возрастанием числа бактерий с множественной лекарственной резистентностью (МЛР), стало сложно лечить внутрибольничные инфекции. Клиницистам приходится прибегать к применению более токсичных и менее эффективных антибиотиков. Тем не менее, по оценкам Центра контроля и профилактики заболеваний (ЦКПЗ), ежегодно происходят ~23000 смертей от инфекций, вызываемых МЛР бактериями.

Таким образом, сохраняется потребность в эффективных технологиях профилактики и/или лечения таких инфекций.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение направлено на решение проблемы отсутствия соответствующих технологий профилактики и/или лечения внутрибольничных инфекций. В числе прочего настоящее изобретение направлено на решение проблем получения вакцин с достаточной иммуногенностью для создания иммунитета и предотвращения колонизации.

В частности, настоящее раскрытие относится к композициям и способам для профилактики и/или лечения внутрибольничных инфекций у пациентов.

В частности, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, содержащим, например, (i) каркасный полимер, включающий полимер и один или более антигенных полисахаридов, конъюгированных с полимером; и (ii) один или более полипептидных антигенов в не ковалентном комплексе с полимером или антигенным полисахаридом.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция может содержать один или более антигенных полисахаридов, конъюгированных с полимером при помощи линкера. В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция может содержать один или более антигенных полисахаридов, конъюгированных с полимером без линкера. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов получены из грамотрицательных бактерий и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов получены из антигенных полисахаридов Klebsiella, Pseudomonas и/или E. coli.

В некоторых вариантах осуществления одно или более из потенциальной возможности опсонизации или иммуногенности одного или более антигенных полисахаридов увеличивается относительно ранее определенного уровня, при измерении методом ELISA и/или в функциональном анализе антител. В некоторых вариантах осуществления одно или более из потенциальной возможности опсонизации или иммуногенности одного или более антигенных полисахаридов увеличивается относительно контрольной композиции, при измерении методом ELISA и/или в функциональном анализе антител. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в вакцинной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в вакцинной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в вакцинной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в вакцинной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в вакцинной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в вакцинной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в вакцинной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в фармацевтической композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в фармацевтической композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в фармацевтической композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в фармацевтической композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в фармацевтической композиции, и не содержать полимер, присутствующий в фармацевтической композиции.

В некоторых вариантах осуществления одно или более из потенциальной возможности опсонизации или иммуногенности одного или более антигенных полисахаридов увеличивается по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза или 5 раз относительно ранее определенного уровня, при измерении методом ELISA и/или в функциональном анализе антител. В некоторых вариантах осуществления ранее определенный уровень представляет собой преиммунный уровень. В некоторых вариантах осуществления эпитопная валентность одного или более антигенных полисахаридов по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза или 5 раз превышает таковую у нативного полисахарида.

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов могут представлять собой белки-носители для одного или более антигенных полисахаридов. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенная композиция вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на более высоком уровне, чем в случае композиции, содержащей антигенный полисахарид и не содержащей каркасный полимер, при измерении методом ELISA. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенная композиция вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на более высоком уровне, чем в случае композиции, содержащей полипептидный антиген и не содержащей каркасный полимер, при измерении методом ELISA. В некоторых вариантах осуществления один или более патогенов выбирают из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенная композиция вызывает иммунный ответ против одного или более из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления полипептидный антиген представляет собой, или содержит, бактериальный полипептид, грибковый полипептид и/или вирусный полипептид, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления полипептидный антиген представляет собой, или содержит, полипептид, или его иммуногенный фрагмент, из Klebsiella, Pseudomonas и/или E. coli. В некоторых вариантах осуществления полипептидный антиген представляет собой, или содержит, полипептид, полученный из полипептида Klebsiella, Pseudomonas и/или E. coli.

В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, полисахарид, полипептид или синтетический дендример. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет размер от примерно 50 кДа до примерно 2000 кДа. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, капсульный полисахарид из грамотрицательных или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой, или содержит, капсульный полисахарид Klebsiella, экзополисахарид Pseudomonas и/или капсульный полисахарид Escherichia. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, линейный поли-L-лизин или дендример L-лизина. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, дендример синтетического моносахарида или олигосахарида.

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов находятся в не ковалентном комплексе с полимером и/или одним или более антигенными полисахаридами за счет образования по меньшей мере одной пары комплементарных аффинных молекул, включающей (i) первую аффинную молекулу, связанную с полимером или одним или более антигенными полисахаридами; и (ii) комплементарную аффинную молекулу, связанную с одним или более полипептидными антигенами. В некоторых вариантах осуществления пару комплементарных аффинных молекул выбирают из группы, состоящей из: биотина/биотин-связывающего белка, антитела/антигена, фермента/субстрата, рецептора/лиганда, металла/металл-связывающего белка, углевод/углевод-связывающего белка, липида/липид-связывающего белка и His-метки/His-метку-связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула представляет собой биотин или его производное. В некоторых вариантах осуществления комплементарная аффинная молекула представляет собой биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок представляет собой ризавидин, авидин, стрептавидин, брадавидин, тамавидин, лентиавидин, зебавидин, нейтравидин, каптавидин™, или их сочетание.

В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула перекрестно сшита или ковалентно связана с полимером, или одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула перекрестно сшита или ковалентно связана с полимером каркасного полимера. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула перекрестно сшита или ковалентно связана с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула перекрестно сшита или ковалентно связана с полимером каркасного полимера и с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, поли-L-лизин. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов представляют собой, или содержат, полисахарид из одного или более из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов представляют собой, или содержат, OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов представляют собой или содержат OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11, O12 P. aeruginosa, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из антигенных полисахаридов представляет собой, или содержит, экзополисахарид PsL P. aeruginosa. В некоторых вариантах осуществления PsL представляет собой, или содержит, по меньшей мере один эпитоп, который связывает моноклональное антитело, содержащее аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 4, и/или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 5.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1 (фимбриальный белок I типа K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 (консервативный фимбриальный белок III типа MrkA K. pneumoniae), и/или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3, или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой, или содержит, флагеллин подтипа A FliC P. aeruginosa, флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6 (флагеллин подтипа A1 FliC P. aeruginosa), аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 9 (флагеллин подтипа A2 FliC P. aeruginosa), аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенная композиция по изобретению представляет собой, или содержит, (a) каркасный полимер, включающий (i) полимер, содержащий капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19; и (ii) один или более антигенных полисахаридов, содержащих полисахарид Klebsiella или Pseudomonas, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19; и (b) один или более полипептидных антигенов в не ковалентном комплексе с полимером за счет образования по меньшей мере одной пары комплементарных аффинных молекул, включающей (i) первую аффинную молекулу, связанную с полимером; и (ii) комплементарную аффинную молекулу, связанную с одним или более полипептидными антигенами. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов представляют собой, или содержат, OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов представляют собой, или содержат, OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула представляет собой биотин или его производное, и комплементарная аффинная молекула представляет собой, или содержит, биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок представляет собой, или содержит, ризавидин или его биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов представляют собой, или содержат, домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива, PcrV P. aeruginosa, MrkA K. pneumoniae, их антигенные фрагменты, или их сочетание.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул включает слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина FlaB, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой, или содержит, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 24 (Rhavi-FlaB-Домен2-MrkA-His).

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул включает слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой, или содержит, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 26 (Rhavi-FlaB-Домен2-PcrV-His).

В частности, настоящее изобретение относится к вакцинным композициям. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать одну или более иммуногенных композиций. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать одно или более из: (a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (d) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (e) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (f) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (g) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (h) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (i) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (j) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (k) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и (l) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция может содержать одно или более из (a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (d) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (e) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (f) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (g) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (h) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (i) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (j) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; (k) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и (l) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером. В некоторых вариантах осуществления слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA представляет собой, или содержит, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 24 (Rhavi-FlaB-Домен2-MrkA-His). В некоторых вариантах осуществления слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV представляет собой, или содержит, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 26 (Rhavi-FlaB-Домен2-PcrV-His).

В некоторых вариантах осуществления OPS каждой иммуногенной композиции присутствует в массовом отношении примерно 1:1. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер каждой иммуногенной композиции присутствует в массовом отношении примерно 1:1. В некоторых вариантах осуществления совокупно OPS и CPS каждой иммуногенной композиции присутствуют в массовом отношении примерно 1:1. В некоторых вариантах осуществления OPS каждой иммуногенной композиции присутствует в количестве примерно 1 мкг. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер каждой иммуногенной композиции присутствует в количестве примерно 1 мкг. В некоторых вариантах осуществления совокупно OPS и CPS каждой иммуногенной композиции присутствуют в количестве примерно 1 мкг. В некоторых вариантах осуществления OPS каждой иммуногенной композиции присутствует в количестве примерно 5 мкг. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер каждой иммуногенной композиции присутствует в количестве примерно 5 мкг. В некоторых вариантах осуществления совокупно OPS и CPS каждой иммуногенной композиции присутствуют в количестве примерно 5 мкг. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой, или содержит, каркас BP-1. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой, или содержит, каркас BP-1.2. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой, или содержит, каркас BP-2a. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой, или содержит, каркас BP-2b. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой, или содержит, каркас BP-3.

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов представляют собой, или содержат, один или более белков P. aeruginosa, или их вариантов, и при этом комплементарная аффинная молекула представляет собой, или содержит, биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из полипептидных антигенов представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин FlaB P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из полипептидных антигенов представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6 (флагеллин FlaA1 P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина FlaB, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 11 (домен D2 флагеллина FlaA1, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, или полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 12 (домен D2 флагеллина FlaA2, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна пара комплементарных аффинных молекул представляют собой, или включают, слитый белок, содержащий (i) биотин-связывающий белок или его биотин-связывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенная композиция вызывает продуцирование антител, которые узнают нативный MrkA на K. pneumoniae, экспрессирующей MrkA. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту вакцинная композиция вызывает продуцирование антител, которые узнают нативный MrkA на K. pneumoniae, экспрессирующей MrkA.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит одну или более иммуногенных композиций или вакцинных композиций, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит один или более адъювантов. В некоторых вариантах осуществления адъювант выбирают из группы, состоящей из фосфата алюминия, гидроксида алюминия, фосфатированного гидроксида алюминия, агонистов TLR, таких как агонист TLR2 сапонин (QS21) или порины, агонистов TLR4, таких как, например, монофосфориллипид A (MPL), и агонистов TLR5, таких как флагеллины, и так далее.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция составлена для внутримышечного, внутрибрюшинного, внутрикожного и/или подкожного введения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция составлена для инъекции. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту фармацевтическая композиция вызывает Th1 и/или Th17 клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту фармацевтическая композиция вызывает опсонический/бактерицидный ответ против одного или более из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту фармацевтическая композиция приводит к уменьшению скорости передачи инфекции и/или колонизации слизистых поверхностей одним или более из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту фармацевтическая композиция приводит к уменьшению скорости передачи инфекции и/или колонизации ЖК тракта одним или более из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции Klebsiella, включающим введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции Klebsiella, включающим введение пациенту эффективного количества вакцинной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции Klebsiella, включающим введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции P. aeruginosa, включающим введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции P. aeruginosa, включающим введение пациенту эффективного количества вакцинной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции P. aeruginosa, включающим введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению.

Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции E. coli, включающим введение пациенту эффективного количества иммуногенной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции E. coli, включающим введение пациенту эффективного количества вакцинной композиции по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к способам иммунизации пациента против инфекции E. coli, включающим введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенная композиция вызывает иммунный ответ против грамотрицательных и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту вакцинная композиция вызывает иммунный ответ против грамотрицательных и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту фармацевтическая композиция вызывает иммунный ответ против грамотрицательных и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления грамотрицательные бактерии выбирают из Klebsiella, Pseudomonas, E. coli, а также их сочетания. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой выработку антител или B-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой CD4+ T-клеточный ответ, включая Th1, Th2, или Th17 ответ, или CD8+ T-клеточный ответ, или CD4+/CD8+ T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой выработку антител или B-клеточный ответ; и T-клеточный ответ.

Некоторые варианты осуществления относятся к композициям антител, содержащим антитела, выработанные у млекопитающего, иммунизированного иммуногенной композицией по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к композициям антител, содержащим антитела, выработанные у млекопитающего, иммунизированного вакцинной композицией по изобретению. Некоторые варианты осуществления относятся к композициям антител, содержащим антитела, выработанные у млекопитающего, иммунизированного фармацевтической композицией по изобретению. В некоторых вариантах осуществления композиция антител содержит по меньшей мере одно антитело, выбранное из группы, состоящей из моноклональных антител и антиидиотипических антител. В некоторых вариантах осуществления композиция антител содержит выделенную гамма-глобулиновую фракцию.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам очистки O-антигенного полисахарида от одного или более клеточных компонентов Klebsiella, при этом клеточные компоненты включают белок и/или нуклеиновую кислоту, включающим стадии: создания контакта одного или более клеточных компонентов с окисляющим реагентом, с получением смеси, при этом pH смеси составляет примерно 3-5; отделения O-антигенного полисахарида от клеточных компонентов; и извлечение OPS, при этом OPS является практически свободным от других клеточных компонентов и содержит свободный альдегид на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент представляет собой нитрит натрия, кислота представляет собой уксусную кислоту, и при этом восстанавливающий конец OPS представляет собой остаток 2,5-ангидроманнозы, содержащий свободный альдегид.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам очистки O-антигенного полисахарида от одного или более клеточных компонентов грамотрицательных бактерий, при этом клеточные компоненты включают белок и/или нуклеиновую кислоту, включающим: создание контакта одного или более клеточных компонентов с кислотным реагентом, с получением смеси, при этом pH смеси составляет примерно 3-5, нагревание смеси до температуры от примерно 80°C до примерно 100°C; отделение O-антигенного полисахарида от клеточных компонентов; и извлечение OPS, при этом OPS является практически свободным от других клеточных компонентов и содержит кетон на его восстанавливающем конце.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, при этом O-антигенный полисахарид содержит первичную аминогруппу, и по меньшей мере один биотинилированный полисахарид, включающим: химическое связывание первичной аминогруппы O-антигенного полисахарида путем смешивания O-антигенного полисахарида с полисахаридом, биотинилированным и окисленным, полученным сначала путем обработки карбоксилатных групп полисахарида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), а также биотин гидразидом, с последующей обработкой полисахарида окисляющим реагентом; и восстановительное аминирование смеси восстанавливающим реагентом, с получением полимерного каркаса BP-1.2, при этом полисахарид является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления первичная группа на O-антигенном полисахариде представляет собой α-аминогруппу L-аланина внешнего ядра OPS из P. aeruginosa или аминогруппу, которая была введена в восстанавливающий конец O-антигенного полисахарида за счет химического связывания короткой спейсерной молекулы, содержащей первичную группу на каждом конце, путем восстановительного аминирования восстанавливающим реагентом. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент для окисления полисахарида представляет собой периодат натрия, короткий спейсер, содержащий диамин, представляет собой дигидразид адипиновой кислоты, и восстанавливающий реагент для восстановительного аминирования представляет собой цианоборогидрид натрия. Некоторые варианты осуществления относятся к полимерному каркасу BP-1.2, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, при этом O-антигенный полисахарид содержит первичную аминогруппу, и по меньшей мере один биотинилированный полисахарид, включающим: химическое связывание первичной аминогруппы O-антигенного полисахарида путем смешивания O-антигенного полисахарида с полисахаридом, биотинилированным и CDAP-активированным, полученным сначала путем обработки карбоксилатных групп полисахарида 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), а также биотин гидразидом, с последующей активацией биотинилированного полисахарида CDAP, с получением полимерного каркаса BP-1.3, при этом полисахарид является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления первичная группа на O-антигенном полисахариде представляет собой α-аминогруппу L-аланина внешнего ядра OPS P. aeruginosa или аминогруппу, которая была введена в восстанавливающий конец O-антигенного полисахарида за счет химического связывания короткой спейсерной молекулы, содержащей первичную группу на каждом конце, путем восстановительного аминирования восстанавливающим реагентом. В некоторых вариантах осуществления короткий спейсер, содержащий диамин, представляет собой дигидразид адипиновой кислоты, и восстанавливающий реагент для восстановительного аминирования представляет собой цианоборогидрид натрия. Некоторые варианты осуществления относятся к полимерному каркасу BP-1.3, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид и по меньшей мере один биотинилированный полисахарид, включающим: химическое связывание O-антигенного полисахарида, содержащего первичный амин в его ядре, полученного либо путем связывания короткого спейсера, содержащего первичный амин на каждом конце, с O-антигенным полисахаридом путем восстановительного аминирования, с получением молекулы O-антигенный полисахарид-спейсер, или с использованием не дериватизированного OPS, содержащего α-аминогруппу L-аланина, смешивания O-антигенного полисахарида, содержащего первичный амин, с частично окисленным полисахаридом, с получением смеси; восстановительное аминирование смеси, с получением каркаса OPS; и дериватизацию каркаса OPS при помощи CDAP и биотина, содержащего первичный амин, с получением, в результате, каркасного полимера, при этом полисахарид и химически связанный O-антигенный полисахарид являются биотинилированными. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид и по меньшей мере один не биотинилированный полисахарид, включающим: биотинилирование O-антигенного полисахарида, содержащего один или более коровых KDO и/или фрагментов гептозы, при помощи CDAP и биотина, содержащего первичный амин, с получением смеси биотинилированного OPS; частичное окисление смеси биотинилированного OPS периодатом натрия для введения альдегидов в коровые KDO и/или фрагменты гептозы; восстановительное аминирование биотинилированной смеси дигидразидом адипиновой кислоты; смешивание биотинилированного и аминированного OPS с частично окисленным полисахаридом, с получением смеси; и восстановительное аминирование смеси; с получением, в результате, каркасного полимера, при этом полисахарид является не биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является биотинилированным. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид и полимер PLL, включающим: восстановительное аминирование O-антигенного полисахарида, содержащего концевые альдегиды или альфа-KDO, ε-NH₂ группами полимера PLL, с получением полимера OPS-PLL; дериватизацию OPS при помощи CDAP, с получением смеси производных; проведение реакции смеси производных с биотином, содержащим первичный амин; и обработку, или не обработку, смеси ацилирующим реагентом для блокирования непрореагировавших ε-NH₂ групп полимера PLL; с получением, в результате, каркасного полимера, при этом блокированный каркас N-ацетилированный-PLL, или неблокированный PLL, является не биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления ацилирующий реагент представляет собой уксусный ангидрид или ацетилхлорид. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий реагент представляет собой цианоборогидрид натрия. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, при этом O-антигенный полисахарид содержит альдегидную или кетонную группу на его восстанавливающем конце, и по меньшей мере один биотинилированный полисахарид, содержащий первичные аминогруппы, полученный реакцией клик-химии в присутствии катализатора, при этом биотинилированный полисахарид содержит алкиновые группы с низкомолекулярным соединением, содержащим азидогруппу на одном конце и свободную аминогруппу на другом конце, включающим: химическое связывание O-антигенного полисахарида, содержащего альдегидные или кетонные группы, путем смешивания O-антигенного полисахарида с биотинилированным полисахаридом, содержащим первичные аминогруппы, и восстановительного аминирования смеси восстанавливающим реагентом, с получением в результате каркасного полимера, при этом полисахарид является биотинилированным, а химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам получения каркасного полимера, включающего по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид, при этом биотинилированный O-антигенный полисахарид содержит азидогруппу на его восстанавливающем конце, и по меньшей мере один не биотинилированный полисахарид, содержащий алкины, включающим: связывание реакцией клик-химии в присутствии катализатора биотинилированного O-антигенного полисахарида, содержащего азидогруппу на его восстанавливающем конце, с не биотинилированным полисахаридом, содержащим алкины, с получением в результате каркасного полимера, при этом полисахарид является не биотинилированным, и связанный реакцией клик-химии O-антигенный полисахарид является биотинилированным. В некоторых вариантах осуществления катализатор для связывания реакцией клик-химии O-антигенного полисахарида и полисахарида посредством алкин-азидного циклоприсоединения представляет собой сульфат меди. В некоторых вариантах осуществления алкиновую группу для дериватизации полисахарида выбирают из группы, состоящей из 1-амино-3-бутина, 1-амино-4-пентина, DBCO-амина и алкин-ПЭГ4-амина. В некоторых вариантах осуществления азидную группу для дериватизации полисахарида выбирают из группы, состоящей из азидо-ПЭГ3-амина, азидопропиламина и азидобутиламина. Некоторые варианты осуществления относятся к каркасному полимеру, полученному способами, раскрытыми в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой, или содержит, биотин-связывающий домен и полипептид, который представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с любой последовательностью из SEQ ID NO: 16-26. В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой, или содержит, биотин-связывающий домен и полипептид, который представляет собой, или содержит, аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с любой последовательностью из SEQ ID NO: 1-3 или 6-26.

В некоторых вариантах осуществления способ получения варианта MAPS включает образование комплекса из по меньшей мере одного каркасного полимера, описанного в настоящем изобретении, с по меньшей мере одним слитым белком, описанным в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления вариант MAPS представляет собой BP-1 MAPS, BP-1.2 MAPS, BP-1.3 MAPS, BP-2a MAPS, BP-2b MAPS или BP-3 MAPS.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки иммуногенности иммуногенной композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и уровней цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки эффективности иммуногенной композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки иммуногенности вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки эффективности вакцинной композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки иммуногенности фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

В некоторых вариантах осуществления способ оценки эффективности фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, включает оценку, измерение и/или сравнение иммунного ответа с использованием одного или более in vitro биоанализов, в том числе, анализа B-клеточных и T-клеточных ответов, например, уровней антител методом ELISA, функциональных уровней антител методом FC, ОФУ, и в других функциональных тестах, таких как определение агглютинации, подвижности, цитотоксичности, Th1/Th17 клеток и цитокинов, а также in vivo анализов в животных моделях внутрибольничного заболевания (пневмонии, сепсиса, инфекций ожоговых ран, ЖК тракта и операционного поля), таких как анализ бактериального клиренса, пассивной и активной защиты после заражения внутрибольничными патогенами, которые являются мишенью для иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ сравнивают с ответом для контрольной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать каркасный полимер, присутствующий в иммуногенной композиции. В некоторых вариантах осуществления контрольная композиция может содержать антигенный полипептид, присутствующий в иммуногенной композиции, и/или антигенный полисахарид, присутствующий в иммуногенной композиции, и не содержать полимер, присутствующий в иммуногенной композиции.

Список общепринятых сокращений

ADH: дигидразид адипиновой кислоты; ПМР: резистентность к противомикробным средствам; УЕ: условная единица; BB: каркас; BP: каркасный полимер; CDAP: 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборат; ЦКПЗ: Центр контроля и профилактики заболеваний; CDM: среда с определенным химическим составом; КФ: кистозный фиброз; CP: общая часть; CPS: капсульный полисахарид; КОЕ: колониеобразующие единицы; COPS: коровый O-полисахарид; ХТ: холерный токсин; ДНК: дезоксирибонуклеиновая кислота; ДТТ: дитиотреитол; EC: Escherichia coli; EDC: 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид; ELISA: иммуноферментный анализ; ELISpot: клеточный иммуноферментный анализ; ETEC: энтеротоксичная E. coli; ПЦ: проточная цитометрия; ПФ: проточная фаза; ЖК: желудочно-кишечный; ГОБ: грамотрицательные бактерии; ГОП: грамотрицательные палочки; H-ЯМР: протонный ядерный магнитный резонанс; ГА: гемагглютинация; УН: убитые нагреванием; клетки HL-60: человеческие клетки промиелоцитарного лейкоза; ВЭЖХ: высокоэффективная жидкостная хроматография; IATS: Международная система серотипирования антигенов; ОИТ: отделение интенсивной терапии; ИОХ: ионообменная хроматография; IFN: интерферон; IL: интерлейкин; в/м: внутримышечно; и/н: интраназально; в/б: внутрибрюшинно; в/в: внутривенно; в/в IG: внутривенный иммуноглобулин; Ig: иммуноглобулин; KDO: группа кетокислоты; KP: Klebsiella pneumoniae; KO: Klebsiella oxytoca; LAL: лизат амебоцитов мечехвоста: LPS: липополисахарид; мАт: моноклональные антитело; MALLS: анализ многоуглового рассеяния лазерного излучения; MAPS: множественная система представления антигенов; МЛР: множественная лекарственная резистентность; MHC: главный комплекс гистосовместимости; ММ: молекулярная масса; NAPLL: N-ацетил-поли-L-лизин; NaBH₃CN: цианоборогидрид натрия; NaIO₄: метапериодат натрия; NHS: N-гидроксисукцинимид; НЧС: нормальная человеческая сыворотка; ЯМР: ядерный магнитный резонанс; OD: оптическая плотность; OMP: белок наружной мембраны; ОФА: анализ опсонофагоцитирующей активности; ОФУ: опсонофагоцитарное уничтожение; OPS: O-полисахарид; PA: Pseudomonas aeruginosa; ПЦР: полимеразная цепная реакция; PBS: фосфатно-солевой буфер; ПЭГ: полиэтиленгликоль; PMN: полиморфноядерные лейкоциты; PLL: поли-L-лизин; п/о: перорально; ППГ: полипропиленгликоль; PRO-CN: контрольный белок-носитель; КТ: коклюшный токсин; RCB: исследовательский банк клеток; КП: коэффициент преломления; РИА: радиоиммунный анализ; РНК: рибонуклеиновая кислота; об/мин: оборотов в минуту; СБТ: сывороточный бактерицидный тест; п/к: подкожно; SDS: додецилсульфат натрия; SDS-ПААГ: электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия: ЭХ: эксклюзионная хроматография; TFF: проточная фильтрация вдоль потока; TLR: toll-подобный рецептор; TNF: фактор некроза опухоли; TTSS: секреторная система третьего типа, УФ: ультрафильтрация; США: Соединенные Штаты Америки; WFI: вода для инъекций.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Идеи настоящего изобретения, описанные в настоящем описании, будут более понятны при изучении следующего далее описания различных иллюстративных вариантов осуществления в сочетании с сопроводительными чертежами. Следует понимать, что описанные ниже чертежи предназначены исключительно для иллюстративных целей и никоим образом не должны ограничивать объем настоящего изобретения.

На Фигуре 1A схематически показана структура внутреннего ядра (верх) и наружного ядра (низ) липополисахарида из P. aeruginosa (PA), стрелка с надписью «расщепление» указывает на сайт расщепления, опосредованного уксусной кислотой, между «группами кетокислоты» (KDO) и молекулой липида A. На Фигуре 1B схематически показана структура повторяющихся O-полисахаридных (OPS) единиц нескольких из разных соответствующих международным стандартам типирования (IATS) коровых типов PA. На Фигуре 1C показана структура части корового полисахарида липополисахарида (LPS) K. pneumoniae с сайтом дезаминирующего расщепления между остатками глюкозамина и галактуроновой кислоты ядра при обработке LPS нитритом натрия и уксусной кислотой (азотистой кислотой), что приводит к образованию 2,5-ангидроманнозы с альдегидной группой на C-1 на восстанавливающем конце общей части (CP) OPS. На Фигуре 1D показана химическая структура повторяющихся единиц некоторых из OPS K. pneumoniae (KP) с 2,5-ангидроманнозой на восстанавливающем конце CP OPS. На Фигуре 1E показана химическая структура повторяющейся единицы капсульного полисахарида (CPS) K. oxytoca (KO) K19, который идентичен CPS K. pneumoniae K19 (Brisse et al., 2013), таким образом, их обоих взаимозаменяемо называют в настоящем изобретении KP K19 CPS. На Фигуре 1F представлен спектр H-ядерного магнитного резонанса (H-ЯМР) при 950 МГц очищенного KP K19 CPS.

На Фигуре 2A схематически представлен иллюстративный химический способ получения KP/PA OPS, меченого дигидразидом адипиновой кислоты (ADH) и связанного путем восстановительного аминирования с окисленным CPS, с избирательным биотинилированием на CPS (BP-1). На Фигуре 2B схематически представлен иллюстративный химический способ получения KP/PA CPS/OPS BP-1.2, где остатки биотина связаны на карбоксилатных группах CPS каркасного полимера в процессе реакции с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом (EDC-NHS), и ADH-меченый OPS связан с биотинилированным CPS каркасного полимера путем восстановительного аминирования с окисленным периодатом и биотинилированным CPS. На Фигуре 2C схематически представлен иллюстративный химический способ получения KP/PA CPS/OPS BP-1.3, где остатки биотина связаны на карбоксилатных группах CPS каркасного полимера в процессе реакции с 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимидом и N-гидроксисукцинимидом (EDC-NHS), с последующим связыванием ADH-меченого OPS с биотинилированным и CDAP-активированным CPS каркасного полимера.

На Фигуре 3 схематически представлен иллюстративный химический способ получения ADH-меченого OPS, связанного с окисленным CPS, с последующим добавлением остатков биотина на CPS и OPS (BP-2a).

На Фигуре 4 схематически представлен иллюстративный химический способ получения OPS, связанного с окисленным CPS, в котором остатки биотина избирательно связывают с OPS (BP-2b).

На Фигуре 5A схематически представлен иллюстративный химический способ получения каркасного полимера OPS с полимером поли-L-лизином (PLL), в котором остатки биотина избирательно вводят в OPS, и непрореагировавшие свободные ε-аминогруппы PLL блокируют для получения каркасного полимера биотинилированного OPS и N-ацетилированного PLL (NAPLL) (BP-3). На Фигуре 5B представлены три схемы получения иллюстративных каркасных полимеров. На схеме 1 и схеме 2 показаны два варианта химического способа получения CPS/OPS каркаса 1 (BP-1) с использованием клик-химии; на схеме 3 показан химический способ с использованием клик-химии для получения CPS/OPS каркаса 2b (BP-2b).

На Фигуре 6A показаны результаты иллюстративной эксклюзионной хроматографии (ЭХ), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Waters BioAlliance с колонкой Phenomenex BioSep SEC-4000 и скоростью потока 1 мл/мин в PBS pH 7,4, содержащем азид натрия (0,02%); профили элюции окисленного CPS KP K19, OPS-ADH дериватизированного KPO1 (кривая 1), KPO5 (кривая 5), PAO6 (кривая 6), PAO10 (кривая 10). На Фигуре 6B показаны результаты ЭХ-ВЭЖХ (Waters BioAlliance с колонкой Phenomenex BioSep SEC-4000 и скоростью потока 1 мл/мин в PBS, pH 7,4, содержащем азид натрия (0,02%); профили элюции (слева): OPS_ADH; окисленный KP K19 CPS_OX (указано на фигуре как K19_OX); и K19 CPS_OX: OPS_ADH каркасный полимер и (справа): K19 CPS_OX: OPS_ADH каркасный полимер после определения размера молекул методом либо ЭХ, либо ультрафильтрации (УФ), при использовании мембраны с номинальным порогом отсечения по молекулярной массе (NMWCO) 100 кДа. На Фигуре 6C показаны результаты изучения антигенности методом иммуноферментного анализа (ELISA) с конструктами PA COPS или PA COPS: K19 BP-1, с использованием гипериммунной кроличьей сыворотки после иммунизации убитой нагреванием (УН) Pseudomonas aeruginosa (после четвертой иммунизации). COPS энтеротоксичной E. coli (ETEC) использовали в качестве отрицательного контроля в ELISA. Сильная реакционная способность PA COPS K19 BP-1 с иммунной сывороткой, специфичной для OPS Pseudomonas aeruginosa, указывает на то, что эпитопы OPS в каркасном полимере сохранены.

На Фигуре 7A схематически представлен иллюстративный комплекс BP-1 MAPS со слитым белком ризавидина и OPS BP-1 или BP-1.2; На Фигуре 7B схематически представлен иллюстративный комплекс BP-2a MAPS со слитым белком ризавидина и OPS BP-2a; На Фигуре 7C схематически представлен иллюстративный комплекс BP-2b MAPS со слитым белком ризавидина и OPS BP-2b; на Фигуре 7D схематически представлен комплекс BP-3 MAPS со слитым белком ризавидина и OPS BP-3; на Фигуре 7E схематически представлен комплекс MAPS со слитым белком ризавидина и нативным OPS.

На Фигуре 8A представлена иллюстративная схема последовательности операций последующего процесса очистки OPS из KP и OPS из PA. На Фигуре 8B показаны результаты иллюстративной ЭХ-ВЭЖХ (Waters BioAlliance с колонкой Phenomenex BioSep SEC-4000 использовали при скорости потока 1 мл/мин в PBS, pH 7,4, содержащем азид натрия (0,02%); профили очищенных KP OPS и K19 CPS наложены на кривые коэффициента преломления (КП), слева направо: K19 CPS, O1, O3, O2 и O5. На Фигуре 8C показаны результаты иллюстративной ЭХ-ВЭЖХ (Waters BioAlliance с колонкой Phenomenex BioSep SEC-4000 использовали при скорости потока 1 мл/мин в PBS, pH 7,4, содержащем азид натрия (0,02%); профили очищенных PA OPS наложены на кривые КП, слева направо: O2, O6, O3, O4, O5, O1, O10 и O11.

На Фигуре 9A представлена иллюстративная схема последовательности операций последующего процесса очистки KO CPS K19. На Фигуре 9B представлена конструкция гена для избыточно продуцирующего экзополисахарид PsL штамма Pseudomonas. На Фигуре 9C представлена схема последовательности операций последующего процесса очистки экзополисахарида PsL PA.

На Фигуре 10, верхней панели, представлен иллюстративный профиль элюции при ЭХ на колонке Superdex-200 комплексов BP-2a MAPS слитого белка Rhavi-FlaBD2-MrkA с K19: KPO2-ADH BP-2a. На Фигуре 10, нижней панели, показаны результаты скрининга путем проведения электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-ПААГ) и окрашивания на общий белок фракций, элюированных с колонки при ЭХ, образцы были обработаны без нагревания в буфере с додецилсульфатом натрия (SDS) для образцов, содержащем 10 мМ дитиотреитол (ДТТ), перед проведением SDS-ПААГ, чтобы комплексы MAPS могли оставаться интактными.

На Фигурах 11A-11C приведены примеры анализа методом SDS-ПААГ и окрашивания на общий белок иллюстративных вариантов комплексов MAPS с BP-1, полученных с использованием разных слитых белков. На Фигуре 11A показаны результаты иллюстративного SDS-ПААГ вариантов комплексов MAPS с BP-1, образованных из слитого белка ризавидина (PRO-CN) отдельно с PA O10 OPS BP-1 (дорожки 4 и 5), PA O1 OPS BP-1 (дорожки 6 и 7) и PA O2 OPS BP-1 (дорожки 8 и 9). На Фигуре 11B показаны результаты иллюстративного SDS-ПААГ вариантов комплексов MAPS с BP-1, образованных из белка ризавидин-FlaB-PcrV (Rhavi-FlaB-PcrV) отдельно с PA O10 OPS BP-1 (дорожки 4 и 5), PA O1 OPS BP-1 (дорожки 6 и 7) и PA O2 OPS BP-1 (дорожки 8 и 9). На Фигуре 11C показаны результаты иллюстративного SDS-ПААГ вариантов комплексов MAPS с BP-1, образованных из белка ризавидин-FlaB-D2-MrkA (Rhavi-FlaBD2-MrkA) с PA O10 OPS BP-1 (дорожки 4 и 5), PA O1 OPS (дорожки 6 и 7) и PA O2 OPS BP-1 (дорожки 8 и 9). На Фигурах 11A-11C отдельно слитый белок ризавидина использовали в качестве контроля (дорожки 1 и 2). Каждый из образцов обрабатывали с нагреванием (при кипячении) (дорожки 1, 4, 6 и 8) и без нагревания (дорожки 2, 5, 7 и 9). Варианты комплексов MAPS с BP-1 не разрушались без нагревания, и белок в вариантах комплексов MAPS с BP-1 оставался в самой верхней части геля. При кипячении варианты комплексов MAPS с BP-1 разрушались, белок высвобождался, и белковый димер также диссоциировал. В эксперимент также включали белковые маркеры молекулярной массы (дорожка 3), и молекулярная масса стандартов указана слева от геля в кДа.

На Фигуре 12A приведено схематическое изображение слитых белков ризавидин-антиген, которые получены из Pseudomonas (PcrV; FlaB; FlaA2; FlaA1; FlaB-PcrV; FlaBD2; FlaA2-D2) или Klebsiella (MrkA), или гибридных белков, полученных как из Klebsiella, так и из Pseudomonas (FlaB-D2-MrkA; PcrV-MrkA). На Фигуре 12B показана биологическая активность toll-подобного рецептора (TLR) 5 в отношении нативных флагеллинов Pseudomonas и слитых белков Rhavi, отдельно или в виде варианта комплекса MAPS с пневмококковыми полисахаридами (PnPS) 6B, в этом анализе клетки HEK293-NFkB:Luc отвечали на флагеллин, но не отдельно взятую среду. Эти результаты указывают на то, что конструкты ризавидина и флагеллина (FlaB, FlaA1, FlaA2), отдельно или в комплексе MAPS с PnPS 6B, стимулировали активность TLR5, следовательно, белок имел правильную укладку.

На Фигурах 13A-13B приведено сравнение способности комплексов MAPS, полученных с разными слитыми белками ризавидин-антиген и пневмококковыми капсульными полисахаридами (PnCPS), вызывать ответ в виде продуцирования анти-CPS 19A антитела (Фигура 13A) или анти-CPS 6B антитела (Фигура 13B) у кроликов, при измерении методом ELISA. Оценивали образцы, полученные до иммунизации (P0), через две недели после первой иммунизации (P1) и через две недели после второй иммунизации (P2). Измеренный ответ в виде IgG выражали в условных единицах (УЕ) на основании стандартной кривой, считая УЕ на мл за 12500. Среднее геометрическое значение указано в виде горизонтальной черной линии с планками погрешностей для 95% доверительного интервала. Фигура 13A, верхняя панель: ответ в виде продуцирования иммуноглобулинов (IgG) на PnCPS 19A с PRO-CN; отдельно ризавидин (Rhavi); ризавидин-FlaB-D2 (FlaBD2); ризавидин-FlaA2-D2 (FlaA2D2); ризавидин-FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); ризавидин-FlaB-D2-MrkA (FlaBD2-MrkA); ризавидин-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA). Фигура 13A, нижняя панель: PRO-CN; ризавидин-PcrV (PcrV); ризавидин-FlaB (FlaB); ризавидин-FlaA1 (FlaA1); ризавидин-FlaA2 (FlaA2); ризавидин-MrkA (MrkA). Фигура 13B, верхняя панель: ответ в виде продуцирования IgG на PnCPS 6B с PRO-CN; отдельно ризавидин (Rhavi); ризавидин-FlaB-D2 (FlaBD2); ризавидин-FlaA2-D2 (FlaA2D2); ризавидин-FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); ризавидин-FlaB-D2-MrkA (FlaBD2-MrkA); ризавидин-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA). Фигура 13B, нижняя панель: PRO-CN; ризавидин-PcrV (PcrV); ризавидин-FlaB (FlaB); ризавидин-FlaA1 (FlaA1); ризавидин-FlaA2 (FlaA2); ризавидин-MrkA (MrkA).

На Фигуре 14 показан иммунный ответ у кроликов, иммунизированных слитыми белками ризавидин-антиген (100 мкг белка в адъюванте Фрейнда). IgG против используемого для иммунизации антигена у кроликов при измерении методом ELISA в образцах сыворотки, полученных до иммунизации (P0) и через две недели после второй иммунизации (P2). Измеренный ответ в виде IgG выражали в условных единицах (УЕ) на основании стандартной кривой, считая УЕ на мл за 12500. Среднее геометрическое значение указано в виде горизонтальной черной линии. Титры представлены в УЕ для белков Rhavi-FlaB-D2 (FlaB-D2); Rhavi-FlaA2-D2 (FlaA2-D2); Rhavi-FlaB-PcrV (FlaB-PcrV); Rhavi-FlaB-D2-MrkA (FlaB-D2-MrkA) и Rhavi-PcrV-MrkA (PcrV-MrkA).

На Фигуре 15 приведено сравнение иммуногенности у кроликов двухвалентных препаратов PA O6 и O10 нативных OPS в комплексах MAPS со слитым белком ризавидина PRO-CN или ризавидином (Rhz). Титры IgG против O6 или O10 OPS представлены в виде единиц ELISA до (P0), после одной (P1) или двух инъекций (P2).

На Фигуре 16 приведено сравнение иммуногенности у кроликов препаратов 2-валентного KP O1 и KP O5 OPS BP-1; одновалентного KP O1 BP-2a, а также KP O1 BP-2b, все в вариантах комплексов MAPS со слитым белком ризавидина PRO-CN и с фосфатом алюминия. Титры IgG против KP O1 или KP O5 OPS представлены в виде единиц ELISA до (P0), после одной (P1) или двух инъекций (P2).

На Фигуре 17 приведено сравнение иммуногенности у кроликов препаратов: 2-валентного PA O6, O10 OPS BP-1 в комплексе с PRO-CN; PA O6, O10 OPS BP-1 в комплексе с PRO-CN (без квасцов); PA O6, O10-BP-1 (без белка, например, без PRO-CN); PA O6, O10 OPS BP-1 (без MAPS; например, без биотинилирования, но компоненты каркасного полимера и PRO-CN включены); и одновалентного PA-O6 OPS BP-1 в BP-1 комплексах MAPS со слитым белком ризавидина PRO-CN с фосфатом алюминия, если нет иных указаний. Титры IgG против PA O6 и против PA O10 OPS представлены в виде единиц ELISA до (P0), после одной (P1) или двух инъекций (P2).

На Фигуре 18A приведено сравнение результатов опсонофагоцитарного уничтожения (ОФУ), полученных с использованием человеческих клеток промиелоцитарного лейкоза (HL-60), клеток Klebsiella штамма 12-0581 (O1: K62), кроличьей иммунной сыворотки (от кроликов AFV651 и AFV667) к: KP O1 OPS BP-1 PRO-CN MAPS до и после второй иммунизации (слева); KP O1 OPS BP-2a/ризавидин PRO-CN MAPS до и после второй иммунизации (справа). Повышенное уничтожение наблюдали в случае сыворотки к BP-2a при сравнении иммунной сыворотки с преиммунной сывороткой от одного и того же кролика. На Фигуре 18B приведено сравнение результатов ОФУ, полученных с клетками HL-60, клетками Pseudomonas штамма PA IATSO6, кроличьей иммунной сывороткой к двухвалентному PA O6, O10-OPS BP-1 PRO-CN MAPS и одновалентному PA IATSO6-OPS BP-1 PRO-CN MAPS. Отдельные протестированные сыворотки кроликов приводили к ОФУ клеток PA IATSO6, кроличья сыворотка AFV643 приводила к эффекту прозоны, что свидетельствовало о высоком титра антител против OPS. На Фигуре 18C показано, что четыре отдельные иммунные сыворотки кроликов (P2), полученные с использованием 2-валентной вакцины PA O6, PA O10 OPS BP-1-PRO-CN-MAPS, индуцировали сильное ОФУ бактерий PA O10 клетками HL-60.

На Фигуре 19A приведено сравнение полученных методом проточной цитометрии (ПЦ) результатов связывания целых клеток Klebsiella штамма B5055 (O1: K2) с отдельными кроличьими сыворотками к PRO-CN вариантов MAPS KPO1, O5 OPS BP-1 (слева) и KPO1 OPS BP-2a (справа). Эти полученные методом ПЦ результаты связывания с целыми бактериями имели аналогичную тенденцию с титрами ELISA к очищенному KPO1 OPS, то есть, низкий титр, низкое связывание методом ПЦ. Небольшое число дважды положительных событий указывало на слабое связывание антитела или ограниченное экспонирование OPS на поверхности клеток Klebsiella штамма B5055. На Фигуре 19B (верхняя панель) показана диаграмма разброса данных ПЦ для отдельной кроличьей сыворотки (AFV667) к PRO-CN BP-2a комплексу MAPS с KPO1 OPS BP-2a, где сравнивается слабое связывание с (B5055) и (K. pneumoniae, штамм Caroli, O1: K2) и сильное связывание с не инкапсулированными клетками штаммов Klebsiella (CVD 3001) O1. На Фигуре 19B (нижняя панель) показаны определенные методом ПЦ общие события связывания с теми же тремя штаммами Klebsiella O1 сыворотки от кролика, вакцинированного 2-валентным KP O1, O5 OPS BP-1 PRO-CN MAPS. Эти данные по связыванию указывают на то, что количество CPS, влияющее на экспонирование OPS, возможно, зависит от условий выращивания.

На Фигуре 20 приведено сравнение полученных методом ПЦ результатов связывания целых бактерий Pseudomonas штамма PAK (O6:FlaA1) с (слева) кроличьей сывороткой к 2-валентному PAO6-PAO10 с нативным OPS-PRO-CN (объединенная сыворотка от 3 кроликов, после второй иммунизации); (в центре) кроличьей сывороткой к 2-валентному PAO6-PAO10 OPS BP-1-PRO-CN MAPS (объединенная сыворотка от 3 кроликов, после второй иммунизации); (справа) кроличьей сывороткой к одновалентному PAO6-IATSO6 - OPS BP-1-PRO-CN MAPS (объединенная сыворотка от 3 кроликов, после второй иммунизации); более сильное связывание по результатам ПЦ наблюдали для PAO6 OPS BP-1 MAPS в сравнении с нативной формой OPS MAPS.

На Фигуре 21A показаны полученные методом ПЦ данные по связыванию анти-FlaB кролика с PA O1 штамма O5, экспрессирующего FlaB: на правой панели показана диаграмма разброса данных с высокой процентной долей меченой популяции PA O1 в сыворотке после третьей иммунизации (иммунизация P3; объединенная сыворотка от 10 кроликов) у кроликов, вакцинированных ризавидин-FlaB-D2 (без связывающей области TLR5) при сравнении с сывороткой до иммунизации (P0) (левая панель). На Фигуре 21B, верхняя панель, показаны результаты ПЦ для отдельной кроличьей сыворотки P3 против ризавидин-FlaB-D2; центральная панель, показаны результаты для отдельной кроличьей сыворотки P3 против ризавидин-FlaB-PcrV; нижняя панель, показаны результаты для отдельной кроличьей сыворотки P3 против ризавидин-FlaB-D2-MrkA.

На Фигуре 22 показаны результаты ОФУ клетками HL-60 штамма-мишени Pseudomonas штамма PAO1 (O5: экспрессирующего FlaB) с объединенной кроличьей анти-Rhavi-FlaB-His иммунной сывороткой в сравнении с положительным контролем - анти-PA-FlaB антителом против PAO1 FlaB и поликлональным человеческим внутривенным иммуноглобулином (в/в IG) и отрицательным контролем (без антитела).

На Фигуре 23 показано блокирование адгезии KP O5 6997 (место происхождения Южная Африка) к клеткам A549 (карцинома легкого) при разных разбавлениях анти-FlaBD2-MrkA кроличьей сыворотки. Сыворотка против FlaBD2-MrkA (после третьей иммунизации, P3) ингибировала связывание Klebsiella штамма 6997 с клетками A549, в отличие от преиммунной сыворотки. Это указывает на то, что белковый компонент MrkA в СБ FlaBD2-MrkA имел правильную укладку и вызывал продуцирование функциональных антител.

На Фигуре 24A показана защита анти-PcrV антителами клеток A549 от цитотоксической интоксикации Pseudomonas штамма PAK (O6:FlaA1). Монослои клеток A549 инфицировали Pseudomonas штамма PAK (O6:FlaA1) в течение 4 часов в присутствии 10% сыворотки от кроликов (3 объединенные сыворотки), вакцинированных слитым белком Rhavi-FlaB-PcrV. Анти-Rhavi-FlaB-PcrV (P3, после третьей иммунизации) сыворотка защищала клетки от интоксикации Pseudomonas штамма PAK, в сравнении с преиммунной сывороткой, о чем свидетельствует меньшее количество округлившихся и отделившихся клеток. На Фигуре 24B, монослой клеток A549 инфицировали Pseudomonas штамма PAK в течение 4 часов в присутствии сыворотки от NCB006 Rhavi-FlaB-PcrV (3 объединенные сыворотки) при разных разведениях. Клетки промывали PBS и инкубировали в течение 1 часа с нейтральным красным. Клетки лизировали, и поглощение красителя в каждой лунке регистрировали. Анти-Rhavi-FlaB-PcrV (P3) сыворотка защищала клетки от цитотоксической интоксикации Pseudomonas штамма PAK, в сравнении с преиммунной сывороткой, до разведения 1 к 40.

На Фигуре 25 показаны результаты анализа на цитотоксичность с использованием клеток A549 и анти-FlaB-PcrV кроличьей сыворотки (после третьей иммунизации; P3) с разными штаммами Pseudomonas: в случае высокотоксичной PA IATS O1 (замкнутые ромбы) сывороточная защита от цитотоксичности отсутствовала; в случае цитотоксической PA M2 O5 (замкнутые кружки) сывороточная защита отсутствовала; в случае цитотоксической PA 17002 O10 (замкнутые треугольники) четко наблюдалась сывороточная защита; в случае не цитотоксической PA IATS O6 (замкнутые треугольники) токсичность отсутствовала.

На Фигуре 26 представлен график Каплана-Мейера выживаемости мышей, которым были нанесены ожоги, с последующим инфицированием 28 колониеобразующими единицами (КОЕ) экспрессирующих FlaB Pseudomonas штамма M-2 (O5), введенными в ожоговую рану. В данной модели мышам CD-1 пассивно вводили преиммунную кроличью сыворотку или анти-FlaB кроличью сыворотку и либо имитировали инфицирование фосфатно-солевым буфером (PBS), либо инфицировали Pseudomonas штамма M-2 в PBS. Мыши, которым вводили анти-FlaB иммунную сыворотку, были защищены (5/5, или выживаемость 100%) в течение 10 дней, или более, от заражения раны Pseudomonas штамма M-2, в то время как все мыши из других групп, кроме ложно инфицированных мышей, погибали от заражения раны.

На Фигуре 27 показан клиренс и нагрузка органа в мышиной модели инфекции KP. Мышам (CD1; группы из 3) пассивно вводили внутрибрюшинной (в/б) инъекцией кроличью сыворотку против KPO1 BP-2a OPS-PRO-CN MAPS, и затем инфицировали внутривенно (в/в) Klebsiella штамма KP B5055 O1: K2 (9×10⁴ КОЕ). Количество жизнеспособных KP в селезенке измеряли через 14 ч после инфицирования. Имело место явное уменьшение количества жизнеспособных KP в селезенках мышей, получавших иммунную сыворотку (P2), в сравнении с селезенками мышей, которые получали преиммунную сыворотку (P0). Эти данные свидетельствуют о том, что анти-OPS O1 антитело, полученное к каркасному полимеру в вакцине варианта MAPS, было способно очищать ткани мышей от микроорганизмов и, таким образом, имело функциональную защитную активность in vivo.

На Фигуре 28 представлен график Каплана-Мейера выживаемости при пассивной защите мышей введенной кроличьей сывороткой против KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS перед инфицированием их Klebsiella штамма B5055 (O1: K2), выращенными в салицилате для уменьшения экспрессии капсулы. Мышам CD1 (5/группу) вводили в/б 0,1 мл объединенной кроличьей иммунной (P2) или преиммунной (P0) сыворотки, с последующим в/б бактериальным заражением 2×10⁴ КОЕ Klebsiella штамма B5055 (O1: K2). Показаны графики Каплана-Мейера выживаемости для мышей, получавших сыворотку P0 или P2 против KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS. Сыворотка P2 защищала животных в модели, с выживанием мышей, получавших сыворотку против KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS, в большем количестве и в течение более длительного времени, чем мышей, получавших сыворотку P0.

На Фигуре 29 представлены результаты ELISA конечных титров IgG против KP OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 (5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине, экспериментальная группа 5), в сравнении с 4-валентной KP вакциной (5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине, экспериментальная группа 4).

На Фигуре 30 представлены результаты ELISA конечных титров IgG против PA OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 (5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине, экспериментальная группа 5), в сравнении с 8-валентной PA вакциной (5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине, экспериментальная группа 4).

На Фигуре 31 представлены результаты ELISA конечных титров IgG против PA OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 (например, 60 мкг суммарных PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине), в сравнении с 12-валентной KP/PA вакциной 1 при (1 мкг PS от каждого типа BP в вакцине, экспериментальная группа 6).

На Фигуре 32 показаны индивидуальные титры IgG против каждого PS в 12-валентной KP/PA вакцине 1 в дозе 5 мкг (например, 60 мкг суммарных PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине).

На Фигуре 33 показаны индивидуальные титры IgG против каждого PS в 12-валентной KP/PA вакцине 1 в дозе 1 мкг (например, 12 мкг суммарных PS в вакцине; 1 мкг PS от каждого типа BP в вакцине).

На Фигуре 34 показано увеличение индукции индивидуальных анти-OPS IgG в случае 12-валентной KP/PA вакцины в дозе 5 мкг.

На Фигуре 35 приведено сравнение увеличения индукции индивидуальных анти-OPS IgG в случае 12-валентной KP/PA вакцины в дозе 5 мкг PS на дозу BP и 1 мкг PS на дозу BP.

На Фигуре 36 представлены результаты ELISA конечных титров IgG против PA и KP OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 2 в дозе 60 мкг, 5 мкг PS от каждого типа BP в дозе вакцины (экспериментальная группа 1), в сравнении с 12-валентной KP/PA вакциной 2 в дозе 12 мкг, 1 мкг PS от каждого типа BP в вакцине (экспериментальная группа 2).

На Фигуре 37 показаны индивидуальные титры IgG против каждого PS в 12-валентной KP/PA вакцине 2 в дозе 5 мкг.

На Фигуре 38 показано увеличение индукции индивидуальных анти-OPS IgG в случае 12-валентной KP/PA вакцины 2 в дозе 5 мкг.

На Фигуре 39 показаны результаты анализа ELISA кроличьих IgG против FlaBD2, индуцированных введением 12-валентной KP/PA вакцины 1, 12-валентной KP/PA вакцины 2, 8-валентной PA вакцины и 4-валентной KP вакцины.

На Фигуре 40 показаны результаты анализа ELISA кроличьих IgG против MrkA, индуцированных введением 12-валентной KP/PA вакцины 1, 12-валентной KP/PA вакцины 2, 8-валентной PA вакцины и 4-валентной KP вакцины.

На Фигуре 41 показаны результаты анализа ELISA кроличьих IgG против PcrV, индуцированных введением 12-валентной KP/PA вакцины 1.

На Фигуре 42 показано увеличение индукции индивидуальных IgG против белка-носителя, индуцированных введением 12-валентной KP/PA вакцины 1, 12-валентной KP/PA вакцины 2, 8-валентной PA вакцины и 4-валентной KP вакцины.

На Фигуре 43 показано увеличение индукции ответа на FlaB, вызванного введением различных вакцинных препаратов в трех исследованиях иммуногенности на кроликах: NCB007, NCB008 и NCB012.

На Фигуре 44 показано увеличение индукции ответа на MrkA, вызванного введением различных вакцинных препаратов в трех исследованиях иммуногенности на кроликах: NCB007, NCB008 и NCB012.

На Фигуре 45 показано увеличение индукции ответа на PcrV, вызванного введением различных вакцинных препаратов в трех исследованиях иммуногенности на кроликах: NCB007, NCB008 и NCB012.

На Фигуре 46 показано отсутствие биологической активности агониста TLR5 у белков-носителей, содержащих только домен 2 FlaB.

На Фигуре 47 показаны результаты анализа ОФУ человеческими нейтрофилами KP O2 K-штамма 7380.

На Фигуре 48A показаны результаты анализа поглощения и ОФУ с клеточной линией J774 макрофагов в присутствии гентамицина. На Фигуре 48B показаны результаты анализа поглощения и ОФУ с клеточной линией J774 макрофагов в отсутствие гентамицина.

На Фигуре 49 показаны результаты анализа защиты от гентамицина для PA и KP, опсонизированных объединенной сывороткой от кроликов, иммунизированных 12-валентной вакциной 1. Иммунная сыворотка (P2) опосредует поглощение бактерий макрофаг-подобными клетками J774, в отличие от преиммунной сыворотки (P0).

На Фигуре 50 показаны результаты микроскопического анализа поглощения бактерий макрофаг-подобными клетками J774 с использованием GFP-меченых PA. PA активно поглощаются после воздействия иммунной сыворотки.

На Фигуре 51 показано, что объединенная сыворотка от кроликов, получавших дозу 5 мкг 12-валентной KP/PA вакцины 1 (всего 60 мкг PS), стимулирует поглощение бактерий фагоцитирующими клетками.

На Фигуре 52 показана выживаемость клеток, в процентах, в анализе HL60 ОФУ с KP O2 штамма 7380.

На Фигуре 53 представлены результаты анализов, демонстрирующие, что антитела к PcrV защищают клетки от цитотоксичности. При смешивании штамма PA (без FlaB) с 12-валентной иммунной сывороткой (пул 10, высокая доза вакцины 1) наблюдается сниженная цитотоксичность для клеток в сравнении с использованием преиммунной сыворотки от тех же кроликов.

На Фигуре 54 показано, что клетки, обработанные объединенной сывороткой от кроликов, иммунизированных дозой 5 мкг (например, всего 60 мкг PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине) 12-валентной KP/PA вакцины 1, демонстрируют сниженную подвижность штамма PA O5 FlaB через антитело к FlaB, в сравнении клетками, обработанными преиммунной сывороткой.

На Фигуре 55 показано, что объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 4-валентной KP вакциной (доза 5 мкг, экспериментальная группа 4), не содержащей PA OPS, приводит к увеличению агрегации FlaB-экспрессирующих PA, что свидетельствует о том, что антитело, полученное против FlaB-содержащего белка-носителя, является функциональным.

На Фигуре 56 показано, что объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1, объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 8-валентной PA вакциной (MrkA является единственным антигеном KP в 8-валентной PA вакцине), объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 4-валентной KP вакциной, блокируют адгезию KP O5 штамма 6997 к клеткам A549. Данные свидетельствуют о том, что причиной является антитело к MrkA, индуцированное белком-носителем FlaBD2-MrkA.

На Фигуре 57 представлены результаты анализа клиренса крови для 3 мышей, зараженных KP O1 штамма B5055, через 1 час и 4 часа после заражения.

На Фигуре 58 показана нагрузка органа в печени и селезенке мышей после заражения KP O1 штамма B5055.

На Фигуре 59 представлены результаты анализа клиренса крови для 3 мышей, зараженных KP O5 штамма 6997, через 1 час и 4 часа после заражения.

На Фигуре 60 показана нагрузка органа в селезенке мышей после заражения KP O5 (штамм 6997).

На Фигуре 61 представлены результаты анализа пассивной защиты от нагрузки органа в селезенке мышей, показывающие клиренс KP O2 (штамм KPN-12) из системы кровообращения мышей, получивших сыворотку от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1.

На Фигуре 62 показаны различные иллюстративные оптимизированные протоколы и результаты экспериментов по пассивной защите мышей CD-1 при помощи преиммунной и иммунной сывороток против Klebsiella O2 K2 из исследования NCB012.

На Фигура 63 показана индукция IL-17a в стимулированных клетках селезенки от мышей, иммунизированных вакциной KP O1 MAPS, с последующим бактериальным заражением KP O1:K2 штамма B5055.

На Фигуре 64 представлен экспериментальный протокол и результаты исследования с колонизацией PA O6 ЖК тракта крыс, иммунизированных двумя дозами вакцины PA O6 MAPS, с последующим бактериальным заражением.

На Фигуре 65 представлено схематическое изображение структуры KP OPS Gal-I, Gal-II и Gal-III эпитопов.

На Фигуре 66 показано связывание с клетками, экспрессирующими эпитопы KP D-Gal-III и KP D-Gal-I, определенное методом проточной цитометрии в сыворотке от животных, иммунизированных 4-валентной KP PRO-CN MAPS вакциной.

На Фигуре 67 представлены результаты анализа методом проточной цитометрии, демонстрирующие, что антитела в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1, связываются с двумя из трех штаммов ST258 из бактериемических изолятов и также связываются с тремя из четырех штаммов серотипов, не присутствующих в вакцине с мутантными аллелями MrkA.

На Фигуре 68 показаны индивидуальные титры анти-OPS IgG после иммунизации BP-1 (группа 1) и BP-1.2 (группа 2) KP/PA 4-валентной MAPS вакциной.

На Фигуре 69 показан ответ в виде IgG на белок-носитель, наблюдаемый при сравнении объединенных сывороток против BP-1 MAPS (группа 1) и BP-1.2 MAPS (группа 2).

На Фигуре 70 показаны в отдельных сыворотках ответы в виде продуцирования антител к белку-носителю FlaBD2 для BP-1 и BP-1.2 (KP/PA, 4-валентная), соответственно.

На Фигуре 71 показаны в отдельных сыворотках ответы в виде продуцирования антител к белку-носителю MrkA для BP-1 и BP-1.2 (KP/PA, 4-валентная), соответственно.

Определения

В настоящей заявке, если иное не следует из контекста, (i) термин в единственном числе можно считать означающим «по меньшей мере один»; (ii) «или» можно понимать как «и/или»; (iii) термины «содержащие» и «включающие» можно понимать как охватывающие указанные компоненты или стадии, представленные либо в отдельности, либо совместно с одним или более дополнительными компонентами или стадиями; (iv) термины «примерно» и «приблизительно» следует считать допускающими стандартное отклонение, как понятно специалистам в данной области; и (v) при указании диапазонов конечные точки включены.

Примерно: Термин «примерно», используемый в настоящем изобретении применительно к значению, относится к значению, которое является аналогичным, в контексте указанного значения. Как правило, специалисты в данной области, знакомые с контекстом, понимают относительную степень отличия, охваченную термином «примерно» в этом контексте. Например, в некоторых вариантах осуществления термин «примерно» может охватывать диапазон значений, который находится в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, или менее, от указанного значения.

Введение: Используемый в настоящем изобретении термин «введение», как правило, означает введение композиции пациенту, или в систему, для обеспечения доставки средства, которое представляет собой, или включено в, композицию. Специалистам в данной области знакомо множество способов, которые можно, в соответствующих обстоятельствах, использовать для введения пациенту, например, человеку. Например, в некоторых вариантах осуществления введение может быть внутриглазным, пероральным, парентеральным, топическим и так далее. В некоторых конкретных вариантах осуществления введение может быть бронхиальным (например, путем бронхиальной инстилляции), трансбуккальным, кожным (которое может представлять собой, или включать, например, одно или более из топического введения на кожу, внутрикожного, подкожного, чрескожного и так далее), энтеральным, внутриартериальным, внутрикожным, внутрижелудочным, интрамедуллярным, внутримышечным, интраназальным, внутрибрюшинным, интратекальным, внутривенным, интравентрикулярным, в конкретный орган (например, в печень), мукозальным, назальным, пероральным, ректальным, подкожным, подъязычным, топическим, трахеальным (например, путем интратрахеальной инстилляции), вагинальным, интравитреальным и так далее. В некоторых вариантах осуществления введение может включать введение одной дозы. В некоторых вариантах осуществления введение может включать введение фиксированного количества доз. В некоторых вариантах осуществления введение может включать прерывистое (например, несколько доз, разделенных во времени) и/или периодическое (например, отдельные дозы, разделенные одинаковыми временными интервалами) введение доз. В некоторых вариантах осуществления введение может включать непрерывное введение дозы (например, перфузию) в течение по меньшей мере выбранного периода времени.

Средство: В настоящем изобретении термин «средство», как правило, может быть использован для обозначения соединения или объекта любого химического класса, включая, например, полипептид, нуклеиновую кислоту, сахарид, липид, малую молекулу, металл, либо их сочетание или комплекс. При определенных обстоятельствах, как понятно из контекста специалистам в данной области, термин может быть использован для обозначения объекта, который представляет собой, или содержит, клетку или микроорганизм, или его фракцию, экстракт или компонент. Альтернативно или дополнительно, как будет понятно из контекста, термин может быть использован для обозначения естественного продукта, в том отношении, что он встречается, и/или может быть получен, в природе. В некоторых случаях, опять-таки, как будет понятно из контекста, термин может быть использован для обозначения одного или более объектов, которые являются искусственными в том отношении, что они спроектированы, сконструированы и/или созданы рукой человека, и/или не встречаются в природе. В некоторых вариантах осуществления средство может быть использовано в выделенной или чистой форме; в некоторых вариантах осуществления средство может быть использовано в необработанной форме. В некоторых вариантах осуществления потенциальные средства могут быть предоставлены в виде наборов или библиотек, например, которые могут быть подвергнуты скринингу для идентификации или определения характеристик активных средств в их составе. В некоторых случаях термин «средство» может относиться к соединению или объекту, представляющему собой, или содержащему, полимер; в некоторых случаях термин может относиться к соединению или объекту, содержащему один или более полимерных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления термин «средство» может относиться к соединению или объекту, не являющемуся полимером и/или практически свободному от любого полимера и/или от одного или более конкретных полимерных фрагментов. В некоторых вариантах осуществления термин может относиться к соединению или объекту, лишенному или практически свободному от любого полимерного фрагмента.

Аминокислота: В самом широком смысле используемый в настоящем изобретении термин «аминокислота» относится к любому соединению и/или веществу, которое может быть включено в полипептидную цепь, например, за счет образования одной или более пептидных связей. В некоторых вариантах осуществления аминокислота имеет общую структуру H₂N-C(H)(R)-COOH. В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой природную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой неприродную аминокислоту; в некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой D-аминокислоту; в некоторых вариантах осуществления аминокислота представляет собой Lаминокислоту. Термин «стандартная аминокислота» относится к любой из двадцати стандартных L-аминокислот, обычно встречающихся в природных пептидах. Термин «нестандартная аминокислота» относится к любой аминокислоте, отличающейся от стандартных аминокислот, независимо от того, получена ли она путем синтеза, или из природного источника. В некоторых вариантах осуществления аминокислота, включая карбокси- и/или амино-концевую аминокислоту в полипептиде, может иметь структурную модификацию в сравнении с общей структурой, приведенной выше. Например, в некоторых вариантах осуществления аминокислота может быть модифицирована путем метилирования, амидирования, ацетилирования, пегилирования, гликозилирования, фосфорилирования и/или замены (например, аминогруппы, карбоксильной группы, одного или более протонов и/или гидроксильной группы) в сравнении с общей структурой. В некоторых вариантах осуществления такая модификация может, например, изменять время полувыведения из системы кровообращения полипептида, содержащего модифицированную аминокислоту, в сравнении с полипептидом, содержащим в остальном идентичную, не модифицированную аминокислоту. В некоторых вариантах осуществления такая модификация существенно не изменяет соответствующую активность полипептида, содержащего модифицированную аминокислоту, в сравнении с полипептидом, содержащим в остальном идентичную, не модифицированную аминокислоту. Как будет понятно из контекста, в некоторых вариантах осуществления термин «аминокислота» может быть использован для обозначения свободной аминокислоты; в некоторых вариантах осуществления он может быть использован для обозначения аминокислотного остатка полипептида.

Антитело: Используемый в настоящем изобретении термин «антитело» относится к полипептиду, содержащему канонические элементы последовательности иммуноглобулина, достаточные для придания свойства специфического связывания конкретного антигена-мишени. Как известно в данной области, интактные антитела, продуцируемые в природе, представляют собой тетрамерные молекулы размером примерно 150 кДа, состоящие из двух идентичных полипептидов тяжелой цепи (каждая размером примерно 50 кДа) и двух идентичных полипептидов легкой цепи (каждая размером примерно 25 кДа), которые связаны друг с другом в структуру, обычно называемую «Y-образной» структурой. Каждая тяжелая цепь состоит из по меньшей мере четырех доменов (каждый длиной примерно 110 аминокислот) - амино-концевого вариабельного (VH) домена (расположенного на концах Y-образной структуры), за которым следуют три константных домена: CH1, CH2 и карбокси-концевой CH3 (расположенный у основания стебля «Y»). Короткая область, известная как «переход», соединяет вариабельную и константные области тяжелой цепи. «Шарнир» соединяет домены CH2 и CH3 с остальной частью антитела. Два дисульфидных моста в этой шарнирной области соединяют два полипептида тяжелой цепи друг с другом в интактном антителе. Каждая легкая цепь состоит из двух доменов - амино-концевого вариабельного (VL) домена, за которым следует карбокси-концевой константный (CL) домен, они отделены друг от друга еще одним «переходом». Тетрамеры интактного антитела состоят из двух димеров тяжелая цепь-легкая цепь, в которых тяжелая и легкая цепи связаны друг с другом одной дисульфидной связью; две другие дисульфидные связи соединяют шарнирные области тяжелых цепей друг с другом, так что димеры связаны друг с другом, образуя тетрамер. Продуцируемые в природе антитела также являются гликозилированными, как правило, на домене CH2. Каждый домен в природном антителе имеет структуру, называемую «укладкой цепи иммуноглобулинов», которая образована из двух бета-складчатых слоев (например, 3-, 4- или 5-цепочечных складчатых слоев), упакованных друг против друга в плотную антипараллельную бета-бочку. Каждый вариабельный домен содержит три гипервариабельные петли, известные как «определяющие комплементарность области» (CDR1, CDR2 и CDR3), и четыре в некоторой степени инвариантные «каркасные» области (FR1, FR2, FR3 и FR4). При сворачивании природных антител области FR образуют бета-складчатые структуры, которые создают структурный каркас для доменов, области петель CDR, как из легкой, так и из тяжелой, цепей сближаются в трехмерном пространстве, образуя один гипервариабельный антигенсвязывающий сайт, расположенный на конце «Y» структуры. Fc-область природных антител связывается с элементами системы комплемента, а также с рецепторами на эффекторных клетках, включая, например, эффекторные клетки, которые опосредуют цитотоксичность. Как известно в данной области, аффинность и/или другие характеристики связывания Fc-областей с Fc-рецепторами можно модулировать путем гликозилирования или другой модификации. В некоторых вариантах осуществления антитела, полученные и/или используемые в соответствии с настоящим изобретением, содержат гликозилированные Fc-домены, включая Fc-домены, модифицированные или сконструированные с использованием такого гликозилирования. Для целей настоящего изобретения, в конкретных вариантах осуществления любой полипептид или комплекс полипептидов, включающий достаточные последовательности доменов иммуноглобулина, которые имеются в природных антителах, можно называть и/или использовать в качестве «антитела», независимо от того, произведен ли полипептид естественным образом (например, выработан организмом в ответ на антиген), или произведен рекомбинантными методами, химическим синтезом или с использованием другой искусственной системы или методологии. В некоторых вариантах осуществления антитело является поликлональным; в некоторых вариантах осуществления антитело является моноклональным. В некоторых вариантах осуществления антитело имеет последовательности константной области, которые характерны для антител мыши, кролика, примата или человека. В некоторых вариантах осуществления элементы последовательности антитела являются гуманизированными, приматизированными, химерными, и так далее, как известно в данной области. Кроме того, используемый в настоящем изобретении термин «антитело» в соответствующих вариантах осуществления может означать (если нет иных указаний или не очевидно из контекста) любой из известных в данной области или разработанных конструктов или форматов для использования структурных и функциональных признаков антитела в альтернативной презентации. Например, в некоторых вариантах осуществления антитело, используемое по настоящему изобретению, имеет формат, выбранный из, но без ограничения, интактных IgA, IgG, IgE или IgM антител; би- или мультиспецифических антител (например, Zybodies^® и так далее); фрагментов антител, таких как Fab-фрагменты, Fab’-фрагменты, F(ab’)₂-фрагменты, Fd’-фрагменты, Fd-фрагменты, а также выделенные области CDR или их наборы; одноцепочечных Fv; продуктов слияния полипептид-Fc; однодоменных антител (например, однодоменных антител акулы, таких как IgNAR или их фрагменты); верблюжьих антител; маскированных антител (например, Probodies^®); иммунофармацевтических средств на основе модульного белка малого размера (Small Modular ImmunoPharmaceuticals («SMIP™»); одноцепочечных или тандемных диател (TandAb^®); VHH; антикалинов^®; нанотел^® минител; BiTE^®; белков, содержащих анкириновые повторы, или дарпинов^®; авимеров^®; DART; TCR-подобных антител;, аднектинов^®; аффилинов^®; транстел^®; аффител^®; ТримерX^®; микробелков; финомеров^®, центиринов^® и калбиторов^®. В некоторых вариантах осуществления у антитела может отсутствовать ковалентная модификация (например, присоединение гликана), которую оно бы имело в случае естественного продуцирования. В некоторых вариантах осуществления антитело может иметь ковалентную модификацию (например, присоединение гликана, полезной нагрузки (например, детектируемого фрагмента, терапевтического фрагмента, каталитического фрагмента и так далее), или другую боковую группу (например, полиэтиленгликоль и так далее).

Антиген: Используемый в настоящем изобретении термин «антиген» означает (i) средство, вызывающее иммунный ответ; и/или (ii) средство, которое связывается с T-клеточным рецептором (например, при представлении молекулой MHC) или с антителом. В некоторых вариантах осуществления антиген вызывает гуморальный ответ (например, включающий продуцирование антиген-специфических антител); в некоторых вариантах осуществления антиген вызывает клеточный ответ (например, с вовлечением T-клеток, рецепторы которых специфически взаимодействуют с антигеном). В некоторых вариантах осуществления антиген вызывает гуморальный ответ и клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления антиген связывается с антителом, и может вызывать или не вызывать конкретный физиологический ответ в организме. Как правило, антиген может представлять собой, или содержать, любую химическую молекулу, такую как, например, малая молекула, нуклеиновая кислота, полипептид, углевод, липид, полимер (в некоторых вариантах осуществления отличный от биологического полимера (например, отличный от нуклеотидного или аминокислотного полимера)) и так далее. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой, или содержит, полипептид. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой, или содержит, полисахарид. Специалисты в данной области понимают, что, как правило, антиген может быть предоставлен в выделенной или чистой форме, или, альтернативно, может быть предоставлен в необработанной форме (например, вместе с другими материалами, например, в экстракте, таком как клеточный экстракт или другой относительно необработанный содержащий антиген источник). В некоторых вариантах осуществления антигены, используемые по настоящему изобретению, предоставлены в необработанной форме. В некоторых вариантах осуществления антиген представляет собой рекомбинантный антиген.

Связанные с: Два объекта являются «связанными» друг с другом, при использовании этого термина в настоящем изобретении, если присутствие, уровень и/или форма одного коррелирует с соответствующими характеристиками другого. В некоторых вариантах осуществления два или более объектов физически «связаны» между собой, если они взаимодействуют, прямо или опосредованно, так, что они находятся и/или остаются в физической близости друг с другом. В некоторых вариантах осуществления два или более объектов, которые физически связаны между собой, являются ковалентно связанными между собой; в некоторых вариантах осуществления два или более объектов, которые физически связаны между собой, не являются ковалентно связанными между собой, но являются связанными нековалентно, например, за счет аффинности взаимодействия, водородных связей, ван-дер-ваальсовых сил, гидрофобных взаимодействий, магнетизма, а также их сочетаний.

Каркасный полимер: Используемый в настоящем изобретении термин «каркасный полимер» означает полимер, с которым конъюгированы, или могут быть конъюгированы, один или более полисахаридов (например, антигенных полисахаридов). В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер представляет собой полимер и один или более полисахаридов (например, антигенных полисахаридов), конъюгированных с полимером.

Связывание: Следует понимать, что используемый в настоящем изобретении термин «связывание», как правило, означает нековалентную ассоциацию между, или среди, двумя, или более, объектами. «Прямое связывание» включает физический контакт между объектами или фрагментами; непрямое связывание включает физическое взаимодействие путем физического контакта с одним или более промежуточными объектами. Связывание между двумя или более объектами можно, как правило, оценивать в любом из различных контекстов - включая случаи, когда взаимодействующие объекты или фрагменты изучают в изоляции или в контексте более сложных систем (например, в ковалентной или иной ассоциации с носителем и/или в биологической системе или клетке).

Белок-носитель: Используемый в настоящем изобретении термин «белок-носитель» означает белок или пептид, который вызывает или усиливает иммунный ответ на связанный с ним, или находящийся в комплексе с ним, гаптен. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ, вызванный или усиленный белком-носителем, представляет собой ответ на гаптен. В некоторых вариантах осуществления не развивается какой-либо существенный ответ на сам белок-носитель; в некоторых вариантах осуществления ответ на белок-носитель может быть обнаружен. В некоторых вариантах осуществления белок-носитель находится в комплексе с одной или более другими молекулами.

Клик-химия: Используемый в настоящем изобретении термин «клик-химия» означает быструю и высокопроизводительную реакцию, например, описанную K. B. Sharpless в 2001 г. В некоторых вариантах осуществления в реакции клик-химии образуются побочные продукты, которые могут быть удалены без применения хроматографии. В некоторых вариантах осуществления в реакции клик-химии образуются только побочные продукты, которые могут быть удалены без применения хроматографии. В некоторых вариантах осуществления реакция клик-химии является стереоспецифической. В некоторых вариантах осуществления реакцию клик-химии можно проводить с использованием одного или более легко удаляемых растворителей. В некоторых вариантах осуществления реакцию клик-химии можно проводить с использованием одного или более слабых растворителей. В некоторых вариантах осуществления в реакции клик-химии используют катализируемую медью реакцию азид-алкинового циклоприсоединения для соединения одного или более молекулярных объектов. В некоторых вариантах осуществления один или более молекулярных объектов не ограничены молекулярными размерами. В некоторых вариантах осуществления реакция клик-химии может быть биоортогональной; например, ни реагенты, ни функциональные группы их продуктов не взаимодействуют с функционализированными биомолекулами, и/или реакция протекает легко в мягких нетоксичных условиях, например, при комнатной температуре и, предпочтительно, в воде. В некоторых вариантах осуществления реакция клик-химии может представлять собой катализируемое медью циклоприсоединение Хьюсгена, азид-алкиновое [3+2] биполярное циклоприсоединение, лигирование Штаудингера, или азид-фосфиновое лигирование. В некоторых вариантах осуществления клик-химию можно использовать для связывания между собой двух полимеров (например, двух нуклеиновых кислот или нуклеиновую кислоту и белок или пептид, или два гликополимера, и так далее).

Колонизация (например, слизистой оболочки или ЖК тракта): Используемый в настоящем изобретении термин «колонизация» означает способность микроорганизма создавать нишу в анатомической зоне, например, слизистой оболочке, участке повреждения, органе и так далее.

Комбинированная терапия: Используемый в настоящем изобретении термин «комбинированная терапия» относится к ситуациям, когда пациент одновременно подвергается воздействию двух или более терапевтических режимов (например, двух или более лекарственных средств). В некоторых вариантах осуществления два или более режимов могут быть применены одновременно; в некоторых вариантах осуществления такие режимы могут быть применены последовательно (например, все «дозы» первого режима вводят до введения какой-либо из доз второго режима); в некоторых вариантах осуществления такие средства вводят в перекрывающихся режимах дозирования. В некоторых вариантах осуществления «применение» комбинированной терапии может включать применение одного или более средств или методов лечения для пациента, получающего другое средство(а) или метод(ы) лечения, в сочетании. Для ясности, для комбинированной терапии не требуется, чтобы отдельные средства были введены совместно в одной композиции (или даже обязательно в одно и то же время), хотя в некоторых вариантах осуществления два или более средств, или их активных фрагментов, могут быть введены совместно в комбинированной композиции, или даже в комбинированном соединении (например, в виде части одного химического комплекса или ковалентно связанного объекта).

Композиция: Специалисты в данной области понимают, что используемый в настоящем изобретении термин «композиция» может быть использован для обозначения дискретного физического объекта, который содержит один или более определенных компонентов. Как правило, если не указано иначе, композиция может иметь любую форму - например, газ, гель, жидкость, твердое вещество и так далее.

Производное: Используемый в настоящем изобретении термин «производное» означает структурный аналог эталонного вещества. То есть, «производное» представляет собой вещество, которое имеет значительное структурное сходство с эталонным веществом, например, общую центральную или консенсусную структуру, но также и отличается некоторыми дискретными признаками. В некоторых вариантах осуществления производное представляет собой вещество, которое может быть получено из эталонного вещества путем химических манипуляций. В некоторых вариантах осуществления производное представляет собой вещество, которое может быть получено путем проведения процесса синтеза, в значительной степени аналогичного (например, имеющего множество общих этапов) тому, который приводит к получению эталонного вещества.

Домен: Используемый в настоящем изобретении термин «домен» означает секцию или часть объекта. В некоторых вариантах осуществления «домен» связан с конкретным структурным и/или функциональным признаком объекта таким образом, что, когда домен физически отделен от остальной части исходного объекта, он в значительной степени, или полностью, сохраняет конкретный структурный и/или функциональный признак. Альтернативно или дополнительно, домен может представлять собой, или включать, часть объекта, которая при отделении от этого (исходного) объекта и связывании с другим объектом (реципиентом) в значительной степени сохраняет и/или передает объекту-реципиенту один или более структурных и/или функциональных признаков, которые характеризуют его в исходном объекте. В некоторых вариантах осуществления домен представляет собой секцию или часть молекулы (например, малой молекулы, углевода, липида, нуклеиновой кислоты или полипептида). В некоторых вариантах осуществления домен представляет собой секцию полипептида; в некоторых таких вариантах осуществления домен характеризуется конкретным структурным элементом (например, конкретной аминокислотной последовательностью или мотивом последовательности, α-спиральной структурой, β-складчатой структурой, биспиральной структурой, случайной спиральной структурой и так далее), и/или конкретным функциональным признаком (например, активностью связывания, ферментативной активностью, активностью сворачивания, активностью сигнализации и так далее).

Лекарственная форма или стандартная лекарственная форма: Специалисты в данной области понимают, что термин «лекарственная форма» может быть использован для обозначения физически дискретной единицы активного средства (например, терапевтического или диагностического средства) для введения пациенту. Как правило, каждая такая единица содержит заранее определенное количество активного средства. В некоторых вариантах осуществления такое количество представляет собой количество стандартной дозы (или ее целой части), подходящее для введения в соответствии с режимом введения, который был выбран для достижения желаемого или полезного результата при введении соответствующей популяции (то есть, в соответствии с терапевтическим режимом дозирования). Специалисты в данной области понимают, что общее количество терапевтической композиции, или средства, введенное конкретному пациенту, определяет один или более практикующих врачей, и его можно вводить во множестве лекарственных форм.

Режим дозирования: Специалисты в данной области понимают, что термин «режим дозирования» может быть использован для обозначения набора стандартных доз (как правило, более одной), индивидуально вводимых пациенту, как правило, с некоторыми интервалами времени. В некоторых вариантах осуществления конкретное лекарственное средство имеет рекомендованный режим дозирования, который может включать введение одной или более доз. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение множества доз, при этом каждую из них вводят через некоторый промежуток времени. В некоторых вариантах осуществления временные интервалы между введениями отдельных доз являются одинаковыми; в некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение множества доз, и имеют место по меньшей мере два разных временных интервала между введением отдельных доз. В некоторых вариантах осуществления все дозы в режиме дозирования являются одинаковыми в отношении вводимого количества. В некоторых вариантах осуществления разные дозы в режиме дозирования являются разными в отношении вводимого количества. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение первой дозы в первом количестве дозы, с последующим введением одной или более дополнительных доз во втором количестве дозы, отличающемся от первого количества дозы. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования включает введение первой дозы в первом количестве дозы, с последующим введением одной или более дополнительных доз во втором количестве дозы, таком же, как первое количество дозы. В некоторых вариантах осуществления режим дозирования приводит к достижению желаемого или полезного результата при введении соответствующей популяции (то есть, представляет собой терапевтический режим дозирования).

Эпитоп: Используемый в настоящем изобретении термин «эпитоп» охватывает любой фрагмент, который специфически узнается связывающим компонентом иммуноглобулина (например, антителом или рецептором). В некоторых вариантах осуществления эпитоп состоит из множества химических атомов или групп на антигене. В некоторых вариантах осуществления такие химические атомы или группы экспонируются на поверхности, когда антиген принимает соответствующую трехмерную конформацию. В некоторых вариантах осуществления такие химические атомы или группы физически расположены в пространстве в непосредственной близости друг от друга, когда антиген принимает такую конформацию. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере некоторые такие химические атомы или группы физически отдаляются друг от друга, когда антиген принимает альтернативную конформацию (например, линеаризуется).

Экзополисахарид: Используемый в настоящем изобретении термин «экзополисахарид» относится к природным высокомолекулярным полимерам, состоящим из остатков сахара и секретируемым микроорганизмами в окружающую их среду. Экзополисахариды могут быть названы взаимозаменяемо внеклеточными полисахаридами (ВПС). ВПС обеспечивают функциональную и структурную целостность биопленок и считаются фундаментальным компонентом, определяющим физико-химические свойства биопленки. ВПС составляют от 50% до 90% общего органического вещества биопленок.

Фрагмент: «Фрагмент» материала или объекта, описанного в настоящем изобретении, имеет структуру, которая включает дискретную часть целого, но лишена одного или более фрагментов, имеющихся в целом объекте. В некоторых вариантах осуществления фрагмент состоит из такой дискретной части. В некоторых вариантах осуществления фрагмент включает дискретную часть целого, при этом дискретная часть имеет одну или более функциональных характеристик, общих с целым объектом. В некоторых вариантах осуществления фрагмент состоит из такой дискретной части. В некоторых вариантах осуществления фрагмент состоит из, или содержит характерный структурный элемент или группу, имеющиеся в целом объекте. В некоторых вариантах осуществления фрагмент полимера содержит, или состоит из, по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, или более, мономерных единиц (например, остатков), которые присутствуют в целом полимере. В некоторых вариантах осуществления фрагмент полимера содержит, или состоит из, по меньшей мере примерно 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 25%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или более, мономерных единиц (например, остатков), которые присутствуют в целом полимере. В некоторых вариантах осуществления целый материал или объект может быть назван «исходным» целым.

Гомология: Используемый в настоящем изобретении термин «гомология» относится к общему родству между полимерными молекулами, например, между молекулами нуклеиновой кислоты (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК) и/или между полипептидными молекулами. В некоторых вариантах осуществления полимерные молекулы считают «гомологичными» друг другу, если их последовательности имеют идентичность по меньшей мере 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. В некоторых вариантах осуществления полимерные молекулы считают «гомологичными» друг другу, если их последовательности имеют сходство по меньшей мере 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%.

Идентичность: Используемый в настоящем изобретении термин «идентичность» относится к общему родству между полимерными молекулами, например, между молекулами нуклеиновой кислоты (например, молекулами ДНК и/или молекулами РНК) и/или между полипептидными молекулами. В некоторых вариантах осуществления полимерные молекулы считают «в значительной степени идентичными» друг другу, если их последовательности имеют идентичность по меньшей мере 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99%. Рассчитывать процент идентичности двух нуклеотидных или полипептидных последовательностей, например, можно путем выравнивания двух последовательностей для целей оптимального сравнения (например, делеции могут быть внесены в одну или обе из первой и второй последовательностей для оптимального выравнивания, и неидентичные последовательности можно не учитывать для целей сравнения). В конкретных вариантах осуществления длина последовательности, выравниваемой для целей сравнения, составляет по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или практически 100% от длины эталонной последовательности. Затем сравнивают нуклеотиды в соответствующих положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же остатком (например, нуклеотидом или аминокислотой), что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы идентичны в этом положении. Процент идентичности между двумя последовательностями зависит от числа идентичных положений в обеих последовательностях, с учетом числа делеций и длины каждой делеции, которые необходимо внести для оптимального выравнивания двух последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя последовательностями можно выполнять с использованием математического алгоритма. Например, процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определять с использованием алгоритма Майерса-Миллера (CABIOS, 1989, 4: 11-17), который включен в программу ALIGN (версия 2.0). В некоторых иллюстративных вариантах осуществления для сравнений нуклеотидных последовательностей, выполняемых при помощи программы ALIGN, используют таблицу весов замен остатков PAM120, штраф за удлинение делеции 12 и штраф за внесение делеции 4. Альтернативно, процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями можно определять с использованием программы GAP в пакете программ GCG, используя матрицу NWSgapDNA.CMP.

«Улучшение», «увеличение», «ингибирование» или «уменьшение»: Используемые в настоящем изобретении термины «улучшение», «увеличение», «ингибирование», «уменьшение», или их грамматические эквиваленты, указывают на изменение значений относительно исходного уровня или другого эталонного показателя. В некоторых вариантах осуществления соответствующий эталонный показатель может представлять собой, или включать, показатель в конкретной системе (например, у одного индивидуума) при сопоставимых во всем остальном условиях, за исключением присутствия (например, до и/или после) конкретного средства или воздействия, или в присутствии соответствующего сопоставимого эталонного средства. В некоторых вариантах осуществления соответствующий эталонный показатель может представлять собой, или включать, показатель в сопоставимой системе, который, как известно или как ожидается, будет отвечать определенным образом в присутствии соответствующего средства или воздействия.

Выделенные: Используемый в настоящем изобретении термин означает вещество, и/или объект, которое было (1) отделено от по меньшей мере некоторых из компонентов, с которыми оно было связано, когда было исходно получено (или в природе и/или в экспериментальных условиях), и/или (2) сконструировано, продуцировано, получено и/или изготовлено рукой человека. Выделенные вещества, и/или объекты, могут быть отделены от приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более приблизительно 99% других компонентов, с которыми они были исходно связаны. В некоторых вариантах осуществления выделенные средства являются на приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 91%, приблизительно 92%, приблизительно 93%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или более приблизительно 99% чистыми. В настоящем изобретении вещество называют «чистым», если оно в значительной степени свободно от других компонентов. В некоторых вариантах осуществления, как понятно специалистам в данной области, вещество все-еще может считаться «выделенным» или даже «чистым» после объединения с некоторыми другими компонентами, такими как, например, один или более носителей или эксципиентов (например, буфер, растворитель, вода и так далее); в таких вариантах осуществления степень, в процентах, изолированности или чистоты вещества рассчитывают без учета таких носителей или эксципиентов. В качестве одного примера, в некоторых вариантах осуществления биологический полимер, такой как полипептид или полинуклеотид, существующий в природе, считают «выделенным», если a) в силу своего происхождения, или источника происхождения, он не связан с некоторыми или всеми компонентами, которые сопровождают его в его естественном состоянии в природе; b) он является в значительной степени свободным от других полипептидов или нуклеиновых кислот того же вида от биологического вида, который продуцирует его в природе; c) он экспрессируется или иным образом связан с компонентами из клетки, или другой экспрессионной системы, не принадлежащей биологическому виду, который продуцирует его в природе. Таким образом, например, в некоторых вариантах осуществления полипептид, который химически синтезирован или синтезирован в клеточной системе, отличной от той, которая продуцирует его в природе, считают «выделенным» полипептидом. Альтернативно или дополнительно, в некоторых вариантах осуществления полипептид, к которому были применены один или более методов очистки, можно считать «выделенным» полипептидом в той степени, в которой он был отделен от других компонентов a) с которыми он связан в природе; и/или b) с которыми он был связан, когда исходно был продуцирован.

Линкер: Используемый в настоящем изобретении термин «линкер» означает часть многокомпонентного средства, которая соединяет разные компоненты друг с другом. Например, специалисты в данной области понимают, что полипептид, структура которого включает два или более функциональных или организационных доменов, часто включает последовательность аминокислот между такими доменами, которая связывает их друг с другом. В некоторых вариантах осуществления полипептид, содержащий элемент линкера, в целом, имеет структуру общей формулы S1-L-S2, где S1 и S2 могут быть одинаковыми или разными, и представляют собой два домена, связанные друг с другом линкером. В некоторых вариантах осуществления полипептидный линкер имеет длину по меньшей мере 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 или более аминокислот. В некоторых вариантах осуществления линкер характеризуется тем, что он не принимает жесткую трехмерную структуру, а, скорее, обеспечивает гибкость полипептиду. Множество различных элементов линкера, которые могут быть соответствующим образом использованы при конструировании полипептидов (например, слитых полипептидов), известны в данной области (Holliger et al., 1993; Poljak, 1994).

Фармацевтическая композиция: Используемый в настоящем изобретении термин «фармацевтическая композиция» означает композицию, в которой активное средство составлено совместно с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями. В некоторых вариантах осуществления активное средство присутствует в стандартном количестве дозы, подходящем для введения в терапевтическом режиме, который имеет статистически значимую вероятность достижения заранее определенного терапевтического эффекта при введении соответствующей популяции. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может быть специально составлена для введения в твердой или жидкой форме, включая формы, адаптированные для: перорального введения, например, жидкие лекарственные формы (водные или неводные растворы или суспензии), таблетки, например, предназначенные для трансбуккальной, подъязычной и системной абсорбции, болюсы, порошки, гранулы, пасты для нанесения на язык; парентерального введения, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидуральной инъекции, в виде, например, стерильного раствора или суспензии, или препарата с замедленным высвобождением; топического нанесения, например, в виде крема, мази, пластыря с контролируемым высвобождением или спрея, наносимого на кожу, в легкие или ротовую полость; интравагинального или интраректального введения, например, в виде пессария, крема или пены; подъязычного; глазного; чрескожного введения; назального, легочного введения и введения на другие слизистые поверхности.

Фармацевтически приемлемые: В настоящем изобретении термин «фармацевтически приемлемые», используемый применительно к носителю, разбавителю или эксципиенту, которые используют для формулирования композиции, раскрытой в настоящем изобретении, означает, что носитель, разбавитель или эксципиент должны быть совместимы с другими ингредиентами композиции и не наносить вред реципиенту.

Полисахарид: Используемый в настоящем изобретении термин «полисахарид» означает полимерную углеводную молекулу, состоящую из длинных цепей моносахаридных единиц, связанных между собой гликозидными связями, которая при гидролизе распадается на составляющие ее моносахариды или олигосахариды. Полисахариды имеют структуру в диапазоне от линейной до сильно разветвленной. Примеры включают запасающие полисахариды, такие как крахмал и гликоген, структурные полисахариды, такие как целлюлоза и хитин, а также микробные полисахариды и антигенные полисахариды, присутствующие в микроорганизмах, включая, но без ограничения, OPS, CPS, COPS и LPS.

Профилактика или предотвращение: В настоящем изобретении при использовании в связи с возникновением заболевания, нарушения и/или состояния термины «профилактика» или «предотвращение» означают уменьшение риска развития заболевания, нарушения и/или состояния, и/или отсрочку начала проявления одного или более признаков или симптомов заболевания, нарушения или состояния. Предотвращение можно считать полным, если начало развития заболевания, нарушения или состояния было отсрочено на заранее определенный период времени.

Белок: Используемый в настоящем изобретении термин «белок» означает полипептид (то есть, цепь из по меньшей мере двух аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями). Белки могут включать фрагменты, отличные от аминокислот (например, могут представлять собой гликопротеины, протеогликаны и так далее), и/или могут быть иным образом обработаны или модифицированы. Специалисты в данной области понимают, что «белок» может представлять собой полную полипептидную цепь, которая продуцируется клеткой (с сигнальной последовательностью или без нее), или может представлять собой ее характерную часть. Специалисты в данной области понимают, что белок может иногда содержать более одной полипептидной цепи, например, связанные одной или более дисульфидными связями или связанные другим способом. Полипептиды могут содержать L-аминокислоты, D-аминокислоты, или и те, и другие, и могут иметь любые из множества аминокислотных модификаций или аналогов, известных в данной области. Полезные модификации включают, например, концевое ацетилирование, амидирование, метилирование и так далее. В некоторых вариантах осуществления белки могут содержать природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, синтетические аминокислоты и их сочетания. Термин «пептид», как правило, используют для обозначения полипептида, имеющего длину менее приблизительно 100 аминокислот, менее приблизительно 50 аминокислот, менее 20 аминокислот или менее 10 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления белки представляют собой антитела, фрагменты антител, их биологически активные части и/или их характерные части.

Полипептид: Используемый в настоящем изобретении термин «полипептид», как правило, является признанным в данной области обозначением полимера из по меньшей мере трех аминокислот. Специалисты в данной области понимают, что термин «полипептид» должен быть достаточно общим, чтобы охватывать не только полипептиды, имеющие полную последовательность, приведенную в настоящем изобретении, но также охватывать полипептиды, которые представляют собой функциональные фрагменты (то есть, фрагменты, сохраняющие по меньшей мере одну активность) таких полных полипептидов. Кроме того, специалисты в данной области понимают, что белковые последовательности, как правило, могут допускать некоторую степень изменения без нарушения активности. Таким образом, любой полипептид, который сохраняет активность и имеет, в целом, по меньшей мере приблизительно 30-40% идентичности последовательности, часто более приблизительно 50%, 60%, 70% или 80%, и также, как правило, включает по меньшей мере одну область с гораздо более высокой степенью идентичности, часто более 90% или даже 95%, 96%, 97%, 98% или 99% в одной или более высоко консервативных областях, как правило, включающих по меньшей мере 3-4 и часто до 20 или более аминокислот, с другим полипептидом того же класса, охвачен соответствующим используемым в настоящем изобретении термином «полипептид». Полипептиды могут содержать L-аминокислоты, D-аминокислоты, или и те, и другие, и могут иметь любые из множества аминокислотных модификаций или аналогов, известных в данной области. Полезные модификации включают, например, концевое ацетилирование, амидирование, метилирование и так далее. В некоторых вариантах осуществления белки могут содержать природные аминокислоты, неприродные аминокислоты, синтетические аминокислоты и их сочетания.

Предотвращение: Используемый в настоящем изобретении термин «предотвращение» означает отсрочку начала развития и/или уменьшение частоты и/или степени тяжести одного или более симптомов конкретного заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления предотвращение оценивают на базе популяции, таким образом, считают, что средство «предотвращает» конкретное заболевание, нарушение или состояние, если статистически значимое уменьшение развития, частоты и/или интенсивности одного или более симптомов заболевания, нарушения или состояния наблюдается в популяции, предрасположенной к заболеванию, нарушению или состоянию. Предотвращение можно считать полным, если начало развития заболевания, нарушения или состояния было отсрочено на заранее определенный период времени.

Рекомбинантные: Используемый в настоящем изобретении термин «рекомбинантные» означает полипептиды, которые были спроектированы, сконструированы, получены, экспрессированы, созданы, изготовлены и/или выделены рекомбинантными методами, например, полипептиды, экспрессированные с использованием рекомбинантного экспрессионного вектора, трансфицированного в клетку-хозяина; полипептиды, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих полипептидов; полипептиды, полученные от животного (например, мыши, кролика, овцы, рыбы и так далее), которое является трансгенным, или иным образом было изменено для экспрессии гена или генов, или генных компонентов, которые кодируют и/или управляют экспрессией полипептида или одного или более его компонентов, частей, элементов или доменов; и/или полипептиды, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими методами, включающими сплайсинг или лигирование выбранных элементов нуклеотидных последовательностей друг с другом, химический синтез выбранных элементов последовательности и/или получение иным образом нуклеиновой кислоты, которая кодирует и/или управляет экспрессией полипептида или одного или более его компонентов, частей, элементов или доменов. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательности встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательности сконструированы in silico. В некоторых вариантах осуществления один или более из таких выбранных элементов последовательности получены в результате мутагенеза (например, in vivo или in vitro) известного элемента последовательности, например, из природного или синтетического источника, такого как, например, имеющийся в зародышевой линии исходного интересующего организма (например, человека, мыши и так далее).

Эталон: Используемый в настоящем изобретении термин «эталон» описывает стандарт, или контроль, с которым проводят сравнение. Например, в некоторых вариантах осуществления представляющие интерес средство, животное, индивидуума, популяцию, образец, последовательность или значение сравнивают с эталонным, или контрольным, средством, животным, индивидуумом, популяцией, образцом, последовательностью или значением. В некоторых вариантах осуществления эталон, или контроль, тестируют и/или определяют практически одновременно с тестированием или определением представляющего интерес объекта. В некоторых вариантах осуществления эталон, или контроль, представляет собой исторический эталон, или контроль, необязательно, воплощенный в материальном носителе. Обычно, как понятно специалистам в данной области, эталон, или контроль, определяют или характеризуют в условиях или обстоятельствах, сопоставимых с теми, в которых проводят оценку. Специалисты в данной области понимают, когда имеет место достаточное сходство для оправдания опоры на, и/или сравнения с конкретным возможным эталоном или контролем.

Ответ: Используемый в настоящем изобретении термин «ответ» на лечение может означать любое полезное изменение состояния пациента, которое вызвано, или коррелирует с, лечением. Такое изменение может включать стабилизацию состояния (например, предотвращение ухудшения, которое имело бы место в отсутствие лечения), уменьшение симптомов состояния и/или улучшение перспектив лечения состояния, и так далее. Он может означать ответ пациента или ответ опухоли. Ответ опухоли или пациента можно измерять в соответствии с самыми разными критериями, включая клинические критерии и объективные критерии. Методы оценки ответа включают, но без ограничения, клиническое обследование, позитронную эмиссионную томографию, рентгенографию грудной клетки, КТ-сканирование, МРТ, ультразвуковое, эндоскопическое, лапароскопическое исследование, определение присутствия и уровня опухолевых маркеров в образце, полученном от пациента, цитологический и/или гистологический анализ. Многие из этих методов направлены на определение размера опухоли или определение общей опухолевой нагрузки иным образом. Методы и руководства для оценки ответа на лечение описаны в Therasse et. al. (2000) «New guidelines to evaluate the response to treatment in solid tumors», Европейской организации по изучению и лечению рака, Национального института рака США, Национального института рака Канады. Точные критерии ответа могут быть выбраны любым соответствующим образом, при условии, что при сравнении групп опухолей и/или пациентов, сравниваемые группы оценивают на основании одинаковых или сопоставимых критериев для определения степени ответа. Специалист в данной области сможет выбирать соответствующие критерии.

Риск: Как будет понятно из контекста, «риск» развития заболевания, нарушения и/или состояния означает вероятность, что у конкретного индивидуума разовьется заболевание, нарушение, и/или состояние. В некоторых вариантах осуществления риск выражают в процентах. В некоторых вариантах осуществления риск составляет от 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 до 100%. В некоторых вариантах осуществления риск выражают как риск относительно риска, связанного с эталонным образцом или группой эталонных образцов. В некоторых вариантах осуществления эталонный образец, или группа эталонных образцов, связан с известным риском заболевания, нарушения, состояния и/или события. В некоторых вариантах осуществления эталонные образцы, или группа эталонных образцов, получены от индивидуумов, сопоставимых с конкретным индивидуумом. В некоторых вариантах осуществления относительный риск составляет 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более.

Серотип: Используемый в настоящем изобретении термин «серотип», также называемый сероваром, относится к определенной вариации среди видов бактерий или вирусов, или среди иммунных клеток разных индивидуумов. Эти микроорганизмы, вирусы или клетки коллективно классифицируют на основании их клеточных поверхностных антигенов, что делает возможной эпидемиологическую классификацию микроорганизмов на подвидовом уровне. Группу сероваров с общими антигенами можно называть серогруппой или, иногда, серокомплексом.

Короткий олигосахарид: Для целей настоящего изобретения олигосахарид, как правило, считают «коротким», если он имеет менее 4, или менее 3, остатков в любой линейной цепи.

Пациент: Используемый в настоящем изобретении термин «пациент» означает организм, как правило, млекопитающее (например, человека, в некоторых вариантах осуществления включая человека до рождения). В некоторых вариантах осуществления пациент страдает от соответствующего заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления пациент предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию. В некоторых вариантах осуществления пациент проявляет один или более симптомов или признаков заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления пациент не проявляет какие-либо симптомы или признаки заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления пациент является пациентом с одним или более признаками, характерными для наличия предрасположенности или риска развития заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления пациент является пациентом. В некоторых вариантах осуществления пациент является индивидуумом, которому поставлен диагноз, и/или применяется и/или была применена терапия.

Предрасположенность: Индивидуум, который «предрасположен» к заболеванию, нарушению или состоянию, имеет риск развития заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, который предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию, не проявляет какие-либо симптомы заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления у индивидуума, который предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию, не было диагностировано заболевание, нарушение и/или состояние. В некоторых вариантах осуществления индивидуум, который предрасположен к заболеванию, нарушению или состоянию, является индивидуумом, который был подвергнут условиям, связанным с развитием заболевания, нарушения или состояния. В некоторых вариантах осуществления риск развития заболевания, нарушения и/или состояния является риском, основанным на оценке популяции (например, членов семьи индивидуумов, страдающих от заболевания, нарушения или состояния).

Уменьшение симптомов: В соответствии с настоящим изобретением, имеет место «уменьшение симптомов», когда один или более симптомов конкретного заболевания, нарушения или состояния уменьшаются по величине (например, интенсивности, степени тяжести и так далее) и/или частоте. Для ясности, отсрочку начала проявления конкретного симптома считают одной из форм уменьшения частоты данного симптома.

Терапевтически эффективное количество: Используемый в настоящем изобретении термин «терапевтически эффективное количество» означает количество, которое производит желаемый эффект, ради которого оно было введено. В некоторых вариантах осуществления термин означает количество, которое является достаточным при введении популяции, страдающей от, или предрасположенной к заболеванию, нарушению и/или состоянию, в соответствии с терапевтическим режимом дозирования для лечения заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество представляет собой количество, которое приводит к уменьшению частоты и/или степени тяжести, и/или к отсрочке начала проявления одного или более симптомов заболевания, нарушения и/или состояния. Специалисты в данной области понимают, что термин «терапевтически эффективное количество» не обязательно означает, что было проведено успешное лечение конкретного индивидуума. Скорее, терапевтически эффективное количество может представлять собой такое количество, которое обеспечивает конкретный желаемый фармакологический ответ у значительного количества пациентов при введении пациентам, которые нуждаются в таком лечении. В некоторых вариантах осуществления ссылка на терапевтически эффективное количество может быть ссылкой на количество, измеренное в одной или более конкретных тканях (например, ткани, пораженной заболеванием, нарушением или состоянием) или жидкостях (например, крови, слюне, сыворотке, поте, слезах, моче и так далее). Специалисты в данной области понимают, что в некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество конкретного средства или терапевтического препарата может быть составлено и/или введено в одной дозе. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество средства может быть составлено и/или введено в нескольких дозах, например, в виде части режима дозирования. В некоторых вариантах осуществления терапевтически эффективное количество может означать количество иммуногенной композиции или вакцины, которое достаточно для вызывания иммунного ответа. Например, «терапевтически эффективное количество» означает нетоксическое, но достаточное количество, которое может быть использовано для лечения, ослабления или предотвращения инфекции и/или заболевания (например, бактериальной инфекции, пневмококковой инфекции и так далее) у какого-либо пациента.

Лечение: Используемый в настоящем изобретении термин «лечение» (а также «лечить» или «терапия») относится к любому применению терапии, которое приводит к частичному или полному ослаблению, облегчению, смягчению, ингибированию, отсрочке начала проявления, уменьшению степени тяжести и/или уменьшению частоты одного или более симптомов, признаков и/или причин конкретного заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления такое лечение может быть применено к пациенту, который не проявляет признаки соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния, и/или к пациенту, который проявляет лишь ранние признаки заболевания, нарушения и/или состояния. Альтернативно или дополнительно, такое лечение может быть применено к пациенту, который проявляет один или более признанных признаков соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления лечение может быть применено к пациенту, который был диагностирован, как страдающий от соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния. В некоторых вариантах осуществления лечение может быть применено к пациенту, который, как известно, имеет один или более факторов предрасположенности, которые статистически коррелируют с повышенным риском развития соответствующего заболевания, нарушения и/или состояния.

Вариант: Используемый в настоящем изобретении в контексте молекул, например, нуклеиновых кислот, белков или малых молекул, термин «вариант» означает молекулу, которая имеет значительную структурную идентичность с эталонной молекулой, но отличается структурно от этой эталонной молекулы, например, присутствием или отсутствием, или уровнем одной или более химических групп, в сравнении с эталонной молекулой. В некоторых вариантах осуществления вариант также отличается функционально от его эталонной молекулы. Как правило, решение о том, есть ли основания считать конкретную молекулу «вариантом» эталонной молекулы, основано на степени ее структурной идентичности с эталонной молекулой. Как понимают специалисты в данной области, любая биологическая или химическая эталонная молекула имеет определенные характерные структурные элементы. Вариант, по определению, является отдельной молекулой, которая имеет общие один или более таких характерных структурных элементов, но отличается по меньшей мере в одном аспекте от эталонной молекулы. В качестве нескольких примеров, полипептид может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества аминокислот, имеющих определенные положения относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве и/или вносящих вклад в формирование конкретного структурного мотива и/или биологической функции; нуклеиновая кислота может иметь характерный элемент последовательности, состоящий из множества нуклеотидных остатков, имеющих определенные положения относительно друг друга в линейном или трехмерном пространстве. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, может отличаться от эталонного полипептида, или нуклеиновой кислоты, вследствие одного или более отличий аминокислотной или нуклеотидной последовательности и/или одного или более отличий в химических группах (например, углеводах, липидах, фосфатных группах), которые являются ковалентно связанными компонентами полипептида или нуклеиновой кислоты (например, которые присоединены к каркасу полипептида или нуклеиновой кислоты). В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет общую идентичность последовательности с эталонным полипептидом, или нуклеиновой кислотой, которая составляет по меньшей мере 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% или 99%. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, отличается по меньшей мере одним характерным элементом последовательности от эталонного полипептида, или нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет один или более видов биологической активности. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет общие один или более видов биологической активности с эталонным пептидом, или нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, лишен(а) одного или более видов биологической активности эталонного пептида, или нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет сниженный уровень одного или более видов биологической активности, в сравнении с эталонным полипептидом, или нуклеиновой кислотой. В некоторых вариантах осуществления интересующий полипептид, или нуклеиновую кислоту, считают «вариантом» эталонного пептида, или нуклеиновой кислоты, если он(она) имеет аминокислотную, или нуклеотидную, последовательность, которая идентична последовательности эталона, но имеет небольшое количество изменений последовательности в конкретных положениях. Как правило, менее приблизительно 20%, приблизительно 15%, приблизительно 10%, приблизительно 9%, приблизительно 8%, приблизительно 7%, приблизительно 6%, приблизительно 5%, приблизительно 4%, приблизительно 3% или приблизительно 2% остатков в варианте замещены, вставлены или делетированы в сравнении с эталоном. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6, приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3, приблизительно 2, или приблизительно 1 замещенный остаток в сравнении с эталоном. Часто вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет очень небольшое количество (например, менее приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3, приблизительно 2 или приблизительно 1) замещенных, вставленных или делетированных функциональных остатков (то есть, остатков, которые участвуют в конкретной биологической активности) в сравнении с эталоном. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет не более приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3, приблизительно 2 или приблизительно 1 добавления или делеции, и, в некоторых вариантах осуществления, не имеет добавления или делеции, в сравнении с эталоном. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид, или нуклеиновая кислота, имеет менее приблизительно 25, приблизительно 20, приблизительно 19, приблизительно 18, приблизительно 17, приблизительно 16, приблизительно 15, приблизительно 14, приблизительно 13, приблизительно 10, приблизительно 9, приблизительно 8, приблизительно 7, приблизительно 6 и, обычно, менее приблизительно 5, приблизительно 4, приблизительно 3 или приблизительно 2 добавлений или делеций в сравнении с эталоном. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид, или нуклеиновая кислота, встречается в природе. В некоторых вариантах осуществления эталонный полипептид, или нуклеиновая кислота, представляет собой полипептид, или нуклеиновую кислоту, человека.

Вакцинация: Используемый в настоящем изобретении термин «вакцинация» означает введение композиции, предназначенной для инициации иммунного ответа, например, на вызывающий заболевание агент. Для целей настоящего изобретения вакцинацию можно проводить до, в процессе и/или после воздействия вызывающего заболевание агента и, в конкретных вариантах осуществления, до, в процессе и/или вскоре после воздействия агента. В некоторых вариантах осуществления вакцинация включает несколько введений, надлежащим образом разнесенных во времени, вакцинной композиции.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ КОНКРЕТНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Настоящее изобретение относится, в целом, к композициям, системам и способам, которые включают находящиеся в комплексе белки и полисахариды, например, вакцины из находящихся в комплексе белков и полисахаридов. Такие комплексы могут быть использованы, например, для индукции и/или усиления иммунного защитного ответа у пациентов, имеющих риск внутрибольничной инфекции.

Внутрибольничная инфекция представляет собой инфекцию, приобретаемую в больнице или другой организации здравоохранения в течение по меньшей мере приблизительно 48 часов после поступления. Чтобы подчеркнуть как больничные, так и не больничные условия, внутрибольничную инфекцию иногда называют инфекцией, связанной с оказанием медицинской помощи (ИСМП или ИСОМП). В некоторых вариантах осуществления внутрибольничная инфекция может быть приобретена в больнице, доме престарелых, реабилитационном центре, поликлинике или других клинических условиях. В некоторых вариантах осуществления внутрибольничная инфекция передается в клинических условиях предрасположенному к ней пациенту различными способами. В некоторых вариантах осуществления медицинский персонал может распространять внутрибольничную инфекцию, помимо передачи через зараженное оборудование, постельное белье или воздушно-капельным путем. В некоторых вариантах осуществления источником внутрибольничной инфекции может быть внешнее окружение, другой инфицированный пациент, персонал, который может быть инфицирован, или, в некоторых случаях, источник внутрибольничной инфекции может быть неизвестен. В некоторых случаях микроорганизм, вызывающий внутрибольничную инфекцию, происходит из собственной микробиоты кожи пациента, становясь оппортунистическим после операции или других процедур, которые нарушают защитный барьер кожи. Хотя источником заражения пациента может являться его собственная кожа, такая инфекция все еще считается внутрибольничной, поскольку она развивается в условиях оказания медицинской помощи.

Резистентность к противомикробным средствам

Люди все больше понимают и ценят роль вакцин в решении проблемы резистентности к противомикробным средствам (ПМР). Вакцины могут уменьшать распространенность резистентности за счет уменьшения потребности в использовании противомикробных средств и могут уменьшить ее последствия за счет сокращения общего числа случаев. Путем уменьшения количества патогенов, которые могут быть ответственны за конкретный клинический синдром, вакцины могут позволять использовать антибиотики более узкого спектра для эмпирической терапии. Эти эффекты могут быть усилены за счет популяционного иммунитета, с распространением защиты на не вакцинированных людей в популяции. Поскольку большая часть селекции на резистентность происходит вследствие селекции на не вовлеченные в процесс представители нормальной микрофлоры, вакцинация может уменьшать давление селекции на резистентность даже для патогенов, не включенных в вакцину. Некоторые вакцины оказали непропорциональное влияние на лекарственно-устойчивые клоны видов-мишеней, полезный эффект, который мог бы быть более обдуманно использован при разработке вакцин (Lipsitch and Siber, 2016). Полезные эффекты вакцин в борьбе с ПМР по каждому из этих механизмов могут быть усилены за счет непрямой защиты, или популяционного иммунитета (Fine, 1993), который имеет место, когда вакцинированные индивидуумы не подвергаются инфицированию или колонизации и, таким образом, не передают патоген другим. В этом случае число инфекций, резистентных инфекций и применение противомикробных средств может быть уменьшено не только для вакцинированных индивидуумов, но также и для контактирующих с ними лиц. И наконец, для вакцин против микроорганизмов, которые бессимптомно колонизируют носоглотку, кожу, кишечник или другие участки тела, существует теоретическая возможность того, что уменьшение плотности микробных популяций за счет вакцинации приведет к уменьшению возможности генетического обмена элементами резистентности (Levin et al., 1979; Levin and Cornejo, 2009).

Вакцинами, представляющими особый интерес, являются вакцины, направленные на наиболее важные возбудители ИСМП, которые часто являются устойчивыми ко многим антибиотикам (ЦКПЗ, 2013; Chang et al., 2015). Наиболее распространенные возбудители ИСМП включают грамотрицательные бактерии с множественной резистентностью; в недавних публикациях сообщается об изолятах со всего мира, которые стали резистентными к средствам, являющимся последней надеждой, полимиксину B и колистину (Du et al., 2015: Liu et al., 2016). Резистентность к средствам первой и второй линии также является проблемой в случае грамположительных микроорганизмов. Вид Candida является важным возбудителем мукозальных и диссеминированных инфекций у пациентов с иммунной недостаточностью, а также после противомикробной терапии (ЦКПЗ, 2013). Грамотрицательные виды E. coli, Pseudomonas, Klebsiella и Acinetobacter также становятся все более резистентными ко многим антибиотикам (McGann et al., 2016; Collignon, 2009; Agodi et al., 2011, отчет ВОЗ, 2014). Чтобы устранить этот пробел в знаниях, ЦКПЗ начал трехэтапное исследование в 2009 году по разработке и проведению многоуровневого обследования распространенности ИСМП и использования противомикробных средств. Исследования распространенности были проведены в других странах для осознания масштабов и глубины проблемы, связанной с такой инфекцией. Кульминацией усилий ЦКПЗ в 2011 году стало проведение масштабного опроса, в котором была оценена распространенность ИСМП в больницах неотложной помощи, определена распространенность этих инфекций в зависимости от участка инфицирования и патогена, как показано в Таблице 1, и получены обновленные оценки национального бремени этих инфекций (Magill et al., 2014).

Опросы были проведены в США в 183 больницах (Magill et al., 2014). Из 11282 пациентов, 452 имели 1 или более ИСМП (4,0%; 95% доверительный интервал, 3,7-4,4). Из 504 таких инфекций, наиболее распространенными типами были пневмония (21,8%), инфекции операционного поля (21,8%) и желудочно-кишечные (ЖК) инфекции (17,1%). C. difficile являлся наиболее часто упоминаемым патогеном (вызывающим 12,1% инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи). Инфекции, связанные с медицинскими устройствами (то есть, связанная с центральным катетером инфекция кровотока, связанная с катетером инфекция мочевыводящих путей и связанная с вентилирующим устройством пневмония), на которые традиционно были направлены программы по предотвращению ИСМП, составляли 25,6% таких инфекций. По оценкам авторов изобретения, в больницах неотложной помощи в Соединенных Штатов Америки (США) в 2011 г. находились 648000 пациентов с 721800 инфекциями, связанными с оказанием медицинской помощи. Вакцинация против K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli, или их сочетания, в больничных условиях значительно повлияла бы на частоту случаев наиболее распространенных ИСМП, таких как пневмония, инфекции операционного поля и мочевыводящих путей, а также привела бы к уменьшению распространенности резистентности к антибиотикам, как показано в Таблице 1.

Таблица 1: Многоуровневая оценка распространенности ИСМП: в зависимости от типа инфекции (Magill et al., 2014)

Патоген	Все участки	Пневмония	Инфекции операционного поля	ИКР	ИМП	Инфекции ЖКТ
K. pneumoniae	9,9%	11,8%	13,6%	8%	23,1%*	1,2%
P. aeruginosa	7,1%	12,7%*	6,4%*	4%	10,8%*	1,2%
A. baumannii	1,6%	3,6%*	1,8%	0%	0%	0%
E. coli	9,3%	2,7%	12,7%*	10%	27,7%*	1,2%
S. aureus	10,7%	16,4%*	15,5%*	14%	3,1%	1,2%
C. difficile	12,1%	0%	0%	0%	0%	70,9%*
Candida	6,3%	3,6%	2,7%	22%*	4,6%	3,5%
^*Большинство бактерий с множественной резистентностью к антибиотикам находятся в этих группах

Иммуногенные комплексы

Настоящее изобретение относится к иммуногенным комплексам, которые включают каркасные полимеры, полисахариды и полипептиды.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенные комплексы представляют собой множественные системы представления антигенов (MAPS). Некоторые системы MAPS ранее были описаны в WO 2012/155007. Как правило, иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, представляет собой новый вариант комплексов MAPS-типа, которые включают (i) каркасный полимер, включающий полимер и один или более полисахаридов (например, антигенных полисахаридов), конъюгированных с полимером; и (ii) один или более полипептидов (например, антигенных полипептидов и/или полипептидов-носителей) в не ковалентном комплексе с полимером и/или антигенным полисахаридом. Некоторые иллюстративные каркасные полимеры показаны в иммуногенных комплексах, представленных на Фигурах 7A-7D. В некоторых вариантах осуществления вариантный комплекс MAPS представляет собой BP-1 MAPS. В некоторых вариантах осуществления вариантный комплекс MAPS представляет собой BP-1.2 MAPS. В некоторых вариантах осуществления вариантный комплекс MAPS представляет собой BP-2a MAPS. В некоторых вариантах осуществления вариантный комплекс MAPS представляет собой BP-2b MAPS. В некоторых вариантах осуществления вариантный комплекс MAPS представляет собой BP-3 MAPS.

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов находятся в не ковалентном комплексе с каркасным полимером, и/или антигенным полисахаридом, конъюгированным с указанным полимером, за счет образования по меньшей мере одной пары аффинная молекула/комплементарная аффинная молекула, включающей (i) первую аффинную молекулу, связанную с полимером и/или антигенным полисахаридом; и (ii) комплементарную аффинную молекулу, связанную с одним или более полипептидными антигенами. В некоторых вариантах осуществления один или более полисахаридов химически связаны с полимером. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов получены из грамотрицательных бактерий и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления один или более микробных антигенных полисахаридов получены из антигенных полисахаридов K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидов ковалентно связаны (например, слиты) с комплементарной аффинной молекулой, описанной в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 по массе. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,1 по массе. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 0,01 до приблизительно 1 по массе. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 по массе. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 по массе. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов конъюгированы с каркасным полимером в соотношении от приблизительно 1 до приблизительно 10 по массе.

В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов получены из одного или более патогенов. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов получены из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 или 25 серотипов или штаммов патогена.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер содержит одну или более аффинных молекул, конъюгированных с каркасным полимером. В некоторых вариантах осуществления антигенные полисахариды содержат одну или более аффинных молекул, конъюгированных с антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер и антигенные полисахариды конъюгированы с одной или более аффинными молекулами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер конъюгирован с одной или более аффинными молекулами, и антигенные полисахариды не конъюгированы с аффинной молекулой. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер не конъюгирован с аффинной молекулой, и антигенные полисахариды конъюгированы с одной или более аффинными молекулами. В некоторых вариантах осуществления аффинные молекулы включают биотин или производные биотина.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер содержит множество аффинных молекул, конъюгированных с каркасным полимером. В некоторых вариантах осуществления антигенные полисахариды содержат множество аффинных молекул, конъюгированных с антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер и антигенные полисахариды конъюгированы с множеством аффинных молекул. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер конъюгирован с множеством аффинных молекул, и антигенные полисахариды не конъюгированы с аффинной молекулой. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер не конъюгирован с аффинной молекулой, и антигенные полисахариды конъюгированы с множеством аффинных молекул. В некоторых вариантах осуществления аффинные молекулы включают биотин или производные биотина.

В некоторых вариантах осуществления полисахариды и/или полипептиды, которые могут быть включены в иммуногенные комплексы, получены рекомбинантными методами или методами синтеза. В некоторых вариантах осуществления полисахариды и/или полипептиды, которые могут быть включены в иммуногенные комплексы, выделены и/или получены из природных источников. Иллюстративные полисахариды и/или полипептиды описаны ниже.

Klebsiella

Подавляющее большинство инфекций Klebsiella связаны с госпитализацией. Как оппортунистические патогены, Klebsiella spp. в основном атакуют индивидуумов с иммунной недостаточностью, которые госпитализированы и страдают от тяжелых основных заболеваний, таких как сахарный диабет или хроническая обструктивная болезнь легких. Возбудителем внутрибольничных инфекций Klebsiella является в основном K. pneumoniae, самый важный для медицины вид рода. По оценкам, Klebsiella spp. является возбудителем в 8% случаев всех внутрибольничных бактериальных инфекций в США и Европе (Podschun and Ullmann, 1998). Не было отмечено значительных географических различий в частоте встречаемости, за исключением гипервирулентных K1-инкапсулированных штаммов, которые встречаются преимущественно в Азии и редко встречаются в Европе и Западном полушарии. В США Klebsiella является возбудителем в 3-7% случаев всех внутрибольничных бактериальных инфекций, что ставит ее в число восьми наиболее важных инфекционных патогенов в больницах (Horan et al., 1988; Schaberg et al., 1991); и данные, полученные из Соединенного королевства (Bergogne-Berezin, 1995) и из Германии (Ullmann, 1986), на удивление аналогичны тем, о которых сообщает ЦКПЗ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полисахаридов и/или полипептидов Klebsiella.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полисахаридов из LPS, и/или CPS полисахаридов Klebsiella. В некоторых вариантах осуществления полисахариды из LPS представляют собой OPS. В некоторых вариантах осуществления полисахариды из LPS представляют собой COPS. Капсулы продуцируются почти всеми штаммами Klebsiella; они представляют собой самый наружный слой поверхностных структур, соприкасающийся с окружающей средой хозяина, и доказано, что они являются высоко иммуногенными и нетоксичными (Cryz et al., 1985). Недостатком вакцины против CPS Klebsiella pneumoniae (KP) является большое число капсульных (K) антигенов (более 80 разных антигенов). Однако в исследованиях частоты встречаемости капсульных типов среди бактериемических изолятов Klebsiella, было обнаружено, что лишь 25 серотипов составляют 70% всех бактериемических штаммов (Cryz et al., 1986a). С учетом этих серо-эпидемиологических данных была составлена 24-валентная KP CPS вакцина, которая, как было впоследствии доказано, является безопасной и иммуногенной (Edelman et al., 1994). Однако простые полисахариды сами по себе являются недостаточно иммуногенными для индукции и поддержания долгосрочного и эффективного ответа памяти, и часто должны быть конъюгированы с белками, чтобы быть эффективными. Разработка 24-валентной полисахаридной конъюгатной KP вакцины является сложной и проблематичной, поскольку для объединения 24 гликоконъюгатов в одной вакцине может потребоваться уравновешивание иммуногенности каждого компонента.

Вследствие его эндотоксических свойств, LPS считают важным в патологии септицемии. До последнего времени, как правило, считалось, что O-антигены LPS Klebsiella маскированы CPS, и, следовательно, не экспонированы на бактериальной поверхности. Однако в нескольких исследованиях было продемонстрировано экспонирование на поверхности и доступность для антител O-антигенов в штаммах, экспрессирующих конкретные капсульные серотипы (Tomas et al., 1988). В отличие от K-антигенов, известно лишь восемь O-типов, при этом O1 является наиболее часто встречающимся O-типом в клинических изолятах. На четыре изолята KP (O1, O2, O3, O5) приходится большинство клинических изолятов (Hansen et al., 1999). Сообщалось, что введение моноклональных антител (мАт) к антигену O1 Klebsiella производило защитное действие в мышиной модели летальной эндотоксемии (Mandine et al., 1990).

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает белок или полипептид пилей 3 типа Klebsiella. В отличие от других фимбрий, пили 3 типа вызывают агглютинацию эритроцитов, обработанных танином. Несмотря на то, что его название, манноза-резистентный, Klebsiella-подобный гемагглютинин (MR/K-HA), подразумевает, что этот фимбриальный тип синтезируется только Klebsiella, более поздние исследования продемонстрировали, что пили 3 типа имеются у многих родов кишечных бактерий (Clegg and Gerlach, 1987). Кроме того, пили 3 типа, очевидно, не идентичны во всех родах энтеробактерий, поскольку серологические исследования показали значительное антигенное разнообразие (Old and Adegbola, 1985). Первоначально описанные как адгезионные органеллы Klebsiella, населяющих корни растений, эти пили, как позднее было обнаружено, способны связываться с различными клетками человека. Штаммы K. pneumoniae, экспрессирующие пили 3 типа, прикрепляются к эндотелиальным клеткам, эпителию дыхательных путей и уроэпителиальным клеткам (Hornick et al., 1992; Tarkkanen et al., 1997; Würker et al, 1990). В почках эти пили опосредуют бактериальную адгезию к базальным мембранам канальцев, капсулам Боумена и почечным кровеносным сосудам (Tarkkanen et al., 1990). MrkA является основным белком фимбриального комплекса III типа и участвует в адгезии к клетке-хозяину и образовании биопленок (Murphy and Clegg, 2012), стратегии, используемой бактериальными патогенами при инфицировании (Burmolle et al., 2008). MrkA, но не адгезин (MrkD), как показано ранее, способствует образованию биопленок (Langstraat et al., 2001). Антиген MrkA имеет высокую степень консервативности последовательности в разных изолятах KP и, в целом, является доступным в качестве внеклеточной мишени (Wang et al., 2016). MrkA из двух наиболее преобладающих патогенных изолятов, K. pneumoniae и Klebsiella oxytoca, имеют гомологию 95%. Кроме того, гомология MrkA у репрезентативных представителей семейства Enterobacteriaceae составляет >90% и, таким образом, эти данные о последовательности предоставляют потенциальную возможность разработки основанной на MrkA стратегии против K. pneumoniae и всех грамотрицательных бактерий.

Полисахариды Klebsiella pneumoniae

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полисахаридов K. pneumoniae. Помимо CPS (например, K-антигена), OPS является другим важным фактором вирулентности для K. pneumoniae. Существуют по меньшей мере 9 подтипов OPS K. pneumoniae, каждый из которых имеет разную химическую структуру полисахарида. В некоторых вариантах осуществления полисахариды OPS включены в иммунный комплекс, описанный в настоящем изобретении. Каждое используемое в настоящем изобретении обозначение серотипа указано в соответствии со Справочно-исследовательским центром изучения Escherichia и Klebsiella, сотрудничающим с Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ).

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Klebsiella, которые представляют собой полисахариды, или их производные, из одного или более серотипов K. pneumoniae, выбранных из O1 (и d-Gal-III вариантов), O2 (и d-Gal-III вариантов), O2ac, O3, O4, O5, O7, O8 и O12. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает полисахариды, или их производные, из одного или более из серотипов O1, O2, O3 и O5 Klebsiella, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает полисахариды, или их производные, из каждого из серотипов O1, O2, O3 и O5 Klebsiella.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Klebsiella, которые представляют собой, или получены из, OPS. В некоторых вариантах осуществления OPS представляет собой, или получен из серотипа O1, O2, O3, O5 Klebsiella, а также их вариантов и/или сочетания. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает OPS Klebsiella, выбранный из, или полученный из, одного или более из серотипов O1, O2, O3 и O5, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает OPS Klebsiella из, или полученный из, каждого из серотипов O1, O2, O3 и O5.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Klebsiella, которые представляют собой, или получены из, CPS. В некоторых вариантах осуществления CPS представляет собой, или получен из K1, K2, K10, K16 и K19 Klebsiella. В некоторых вариантах осуществления CPS представляет собой, или получен из K19 Klebsiella.

Полипептиды Klebsiella pneumoniae

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полипептидов K. pneumoniae. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой полипептид, или производное, фимбриального белка I типа K. pneumoniae, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 1, опубликованной в Gerlach et al., 2012, J Bacteriology, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 1 фимбриального белка I типа K. pneumoniae

mkiktlamivvsalslsstaaladtttvnggtvhfkgevvnaacavdagsidqtvqlgqvrsaklatagstssavgfniqlddcdttvatkasvafagtaidssnttvlalqnsaagsatnvgvqildntgtplaldgatfsaattlndgpniipfqaryyatgaatagianadatfkvqye

В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой полипептид, или производное, консервативного фимбриального белка III типа MrkA K. pneumoniae, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 2, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 2 консервативного фимбриального белка III типа MrkA K. pneumoniae

MKKVLLSAAMATAFFGMTAAHAADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQ

В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой полипептид, или производное, фимбриального белка III типа MrkA K. pneumoniae, или его иммуногенный фрагмент, например, фрагмент с повторяющимися последовательностями для обеспечения стабилизирующих взаимодействий с мономерным белком MrkA. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 3, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид K. pneumoniae представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 3 стабилизированного фимбриального белка III типа MrkA K. pneumoniae

ADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVS

Pseudomonas

Pseudomonas является основным возбудителем ИСМП, в частности, при иммунной недостаточности вследствие нейтропении и у пациентов с механической вентиляцией легких, и является главной причиной смерти пациентов с кистозным фиброзом. Инфекция Pseudomonas также имеет место в случае ожоговых ран, повреждений глаз (например, роговицы), травме и так далее. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полисахаридов и/или полипептидов Pseudomonas.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает O-антиген Pseudomonas. Ранее, компания Wellcome Research направляла основные усилия на разработку вакцины на основе этого антигена, объединяя очищенные экстракты, содержащие O-антиген 16 из 20 серотипов, в вакцине PEV-1. Результаты в общей сложности пяти клинических исследований фаз 1-2 были опубликованы с 1976 по 1984 годы (Jones et al., 1976, 1978, 1979, 1980; Langford and Hiller, 1984). Данные по изучению безопасности вакцины указывают на то, что она была хорошо переносима. Сероконверсия оказалась относительно постоянной в вакцинированных группах здоровых добровольцев, а также пациентов с ожогами или кистозным фиброзом (КФ). Вакцинация оказывала переменное влияние на колонизацию ожоговой раны, от незначительного или нулевого до значительного. В одном исследовании посев крови показал снижение количества бактерий почти в 10 раз вследствие вакцинации. В каждом исследовании с участием пациентов с ожогами имело место снижение смертности, которое варьировало в пределах 70-100%, хотя количество смертей из-за P. aeruginosa не всегда точно поддается определению. В исследованиях КФ (Langford and Hiller, 1984), судя по всему, отсутствовала как клиническая польза, так и отличие в колонизации P. aeruginosa при вакцинации, и отсутствовала корреляция между титрами антител в ELISA и клиническими или бактериологическими показателями. В Swiss Serum Institute, Berna Biotech и Crucell была разработана восьмивалентная O-антиген-экзотоксин A конъюгатная вакцина (Aerugen), которая прошла через три клинических испытания фаз 1-2, результаты которых опубликованы (Schaad, et al., 1991; Lang, et al., 1995; Cryz et al., 1994). Их вводимая внутримышечно (в/м) вакцина, судя по всему, была хорошо переносимой, и сероконверсия для всех серотипов была признана значимой во всех исследованиях. Вакцинация приводила к значительному уменьшению колонизации в большинстве исследований, и сообщалось об отсутствии связанных с PA смертей в группах применения вакцины или плацебо. В исследовании Crucell фазы 3 с участием 476 пациентов с КФ результаты для вакцины не достигли желаемого конечного результата и не повторили результаты, полученные в предыдущих исследованиях.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает жгутик Pseudomonas, или его антигенный фрагмент. В ранних исследованиях эффективности (Holder et al., 1982; Holder and Naglich, 1986; Montie, et al., 1987) установлено, что жгутик как a, так и b, типа мог обеспечивать специфическую для типа защиту от гибели в мышиных моделях ожогов, однако жгутик типа b, похоже, был несколько более эффективен в этом. В доклинических исследованиях компании IMMUNO AG (Crowe, et al., 1991) были использованы индивидуальные вакцины, состоящие из жгутика типа a0, a0a1a2, a0a2, a0a3, a0a3a4 и b, и определено, что антиген b, судя по всему, является лучшим иммуногеном, обеспечивая более высокую степень защиты в мышиной модели иммунной недостаточности, чем препараты с типом a. Результаты исследования фазы 1 в той же публикации показали, что все из этих иммуногенов вызывали продуцирование сывороточных антител с высокими титрами и продолжительным действием, как и одиночный иммуноген типа b в последующем исследовании фазы 2 (Döring, et al., 1995), где также наблюдали сероконверсию IgG, IgA и sIgA в бронхоальвеолярных смывах. Введение комбинированной вакцины с тип a (a0a1a2) + тип b жгутиками пациентам с КФ (фаза 3) приводило к продуцированию сывороточных IgG с высокими титрами и продолжительным действием. Однако, хотя имел место некоторый защитный эффект от легочной инфекции P. aeruginosa, присутствие серотипов, не связанных с вакциной, не позволило четко интерпретировать результат (Döring and Dorner, 1997; Döring, et al. 2007). В последующем обзоре Döring и Pier (2008) предположили, что двухвалентная флагеллярная вакцина может быть неоптимальной, и тем не менее, видимо, отсутствуют данные по одиночной вакцине, содержащей жгутик типа b и все из подтипов типа a.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает флагеллин Pseudomonas, или его антигенный фрагмент. Исследования субъединиц жгутика, флагеллина, не продвинулись дальше исследовательской фазы. В исследования были включены очищенный флагеллин (Campodonico, et al., 2010; Faezi, et al., 2013), ДНК вакцина с флагеллином (Saha, et al., 2007), а также конъюгат флагеллин/полиманнуроновая кислота (Campodonico, et al., 2011). Хотя все из них являются иммуногенными и защитными, они, судя по всему, не достигают уровней, которых достигают флагеллярные препараты. Также была изучена пассивная иммунизация с использованием сыворотки против типа b (Barnea, et al., 2006), мАт против типа a (Barnea, et al., 2009) и сыворотки против типа a (Faezi, et al., 2011). Все препараты приводили к уменьшению смертности в мышиной модели ожога.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает PcrV Pseudomonas (секреторной системы III типа), или его антигенный фрагмент. Ключевым фактором вирулентности, связанным с тяжестью заболевания, является секреторная система III типа (T3SS) P. aeruginosa, которая инъецирует бактериальные токсины непосредственно в цитоплазму клеток-хозяев. Белок PcrV, расположенный на конце инжектисомного комплекса T3SS, необходим для функционирования T3SS и является надежно подтвержденной мишенью в животных моделях для разработки иммунологических стратегий профилактики, направленных на P. aeruginosa. Основываясь на предыдущих результатах исследований PcrV, в которых активная и пассивная иммунизация (Sawa, et al., 1999; Holder, et al., 2001; Shime, et al., 2001; Frank, et al., 2002) демонстрировала защиту в различных животных моделях, в KaloBios были разработаны «Humaneered™, высокоаффинные пегилированные Fab'» (KB-001), которые были изучены в качестве пассивной терапии в доклинических (Baer, et al., 2009) и клинических испытаниях (Francois et al., 2012; Milla et al., 2014). Хотя как мышиные, так и гуманизированные («humaneered»), мАт и их Fab’-фрагменты продемонстрировали эффективность в исследованиях на животных, при клиническом испытании KB-001 не были обнаружены существенные отличия в количественных показателях колонизации P. aeruginosa, симптомах или спирометрии, и новый усовершенствованный вариант KB-001A для лечения инфекции P. aeruginosa у пациентов с кистозным фиброзом не соответствовал основным показателям эффективности в клиническом испытании фазы 2 с участием людей (ClinTrials.gov, 2014). Что касается использования в качестве активной вакцины, до настоящего изобретения было проведено мало исследований с белковым антигеном PcrV.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает экзополисахарид Pseudomonas. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает PsL Pseudomonas. Этот экзополисахарид важен для адгезии P. aeruginosa к клеткам млекопитающих, а также для образования и поддержания биопленок, продуцируемых немукоидными и мукоидными изолятами P. aeruginosa. Полисахарид PsL удерживает вместе клетки биопленок, таким образом, в этом заключается важная роль PsL в адгезии (Ma et al., 2006). Функциональный скрининг выявил, что мАт к одному эпитопу PsL демонстрируют превосходную активность в ОФУ и анализах адгезии к клеткам, и обеспечивают значительную защиту во многих животных моделях.

Полисахарид PsL представляет собой доступный для антител независимый от серотипа поверхностный элемент, который распространен как среди немукоидных, так и мукоидных, клинических изолятов (DiGiandomenico et al., 2012). У животных анти-PsL антитела опосредуют ОФУ в присутствии эффекторных клеток и ингибируют связывание P. aeruginosa с эпителиальными клетками. Предположительно анти-PsL специфическое мАт Cam-003 пассивно защищало и уменьшало бактериальную нагрузку в органах мышей зависимым от дозы образом (DiGiandomenico et al., 2012). мАт Cam-003 также оказывало защитное действие против множества серотипов P. aeruginosa в модели мышиной пневмонии. Аналогичные результаты были получены в мышиных моделях скарификации роговицы или ожога, в обоих случаях Cam-003 было эффективно для уменьшения инфекции. MEDI 3902 представляет собой биспецифическое антитело, нацеленное на независимый от серотипа фактор вирулентности TTSS PcrV и экзополисахарид PsL фактора персистенции (DiGiandomenico et al., 2014). Завершено исследование фазы 1 по изучению безопасности MEDI 3902 для предотвращения пневмонии (связанной с вентилированием легких пневмонии), вызываемой Pseudomonas (https://clinicaltrials.gov/NCT02255760). Что касается использования в качестве активной вакцины, до настоящего изобретения было проведено мало исследований с антигенным экзополисахаридом PsL.

Полисахариды Pseudomonas aeruginosa

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полисахаридов P. aeruginosa. Известно приблизительно 20 серотипов O-антигена при определении методом IATS. O-антигенный полисахарид молекулы является нетоксической потенциальной мишенью для разработки вакцины. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более OPS, LPS и/или экзополисахаридов Pseudomonas. В некоторых вариантах осуществления полисахариды из LPS представляют собой OPS. В некоторых вариантах осуществления полисахариды из LPS представляют собой COPS.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Pseudomonas, которые представляют собой полисахариды, или их производные, из одного или более серотипов P. aeruginosa, выбранных из O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O10, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19 и O20 (IATS). В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает один или более полисахаридов Pseudomonas, которые представляют собой полисахариды, или их производные, из одного или более серотипов P. aeruginosa, выбранных из O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10 и O11, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает полисахариды Pseudomonas, которые представляют собой полисахариды, или их производные, из каждого из серотипов P. aeruginosa, выбранных из O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10 и O11.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Pseudomonas, которые представляют собой, или получены из, OPS. В некоторых вариантах осуществления OPS представляет собой OPS, или его производное, из Pseudomonas типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O7, O8, O9, O1O, O11, O12, O13, O14, O15, O16, O17, O18, O19 и O2O, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления OPS представляет собой OPS, или его производное, из Pseudomonas типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O1O, или O11, или их сочетания. В некоторых вариантах осуществления OPS представляет собой OPS, или его производное, из каждой из Pseudomonas типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O1O или O11.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Pseudomonas, которые представляют собой, или являются производными капсульного или подобного капсульному внеклеточного полисахарида. В некоторых вариантах осуществления капсульный или подобный капсульному полисахарид представляет собой полисахарид, или его производное, из альгината, Psl или Pel Pseudomonas.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс включает один или более полисахаридов Pseudomonas, которые представляют собой, или получены из экзополисахарида. В некоторых вариантах осуществления экзополисахарид представляет собой, или получен из, PsL. В некоторых вариантах осуществления PsL содержит по меньшей мере один эпитоп, который связывает моноклональное антитело, содержащее последовательность SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое связывает по меньшей мере один эпитоп PsL, представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 4, или его PsL-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое связывает по меньшей мере один эпитоп PsL, представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 5, или его PsL-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело, которое связывает по меньшей мере один эпитоп PsL, представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 4, или его PsL-связывающий фрагмент, и полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 5, или его PsL-связывающий фрагмент.

Последовательность SEQ ID NO: 4 в PsL-связывающем мАт Cam-003

QVRLQQSGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSTSPYFWSWLRQPPGKGLEWIGYIHSNGGTNYNPSLKSRLTISGDTSKNQFSLNLSFVTAADTALYYCARTDYDVYGPAFDIWGQGTMVTV

Последовательность SEQ ID NO: 5 в PsL-связывающем мАт Cam-003

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVL

Полипептиды Pseudomonas aeruginosa

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает один или более полипептидов P. aeruginosa. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой полипептид, или его производное, флагеллина подтипа A1 FliC P. aeruginosa, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 6, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 6 флагеллина подтипа A1 FliC P. aeruginosa

MALTVNTNIASLNTQRNLNNSSASLNTSLQRLSTGSRINSAKDDAAGLQIANRLTSQVNGLNVATKNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRMRDLSLQSANGSNSDSERTALNGEVKQLQKELDRISNTTTFGGRKLLDGSFGVASFQVGSAANEIISVGIDEMSAESLNGTYFKADGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFSDGDTISYVSKAGKDGSGAITSAVSGVVIADTGSTGVGTAAGVTPSATAFAKTNDTVAKIDISTAKGAQSAVLVIDEAIKQIDAQRADLGAVQNRFDNTINNLKNIGENVSAARGRIEDTDFAAETANLTKNQVLQQAGTAILAQANQLPQSVLSLLR

В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой полипептид, или его производное, флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 7, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 7 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa

MALTVNTNIASLNTQRNLNASSNDLNTSLQRLTTGYRINSAKDDAAGLQISNRLSNQISGLNVATRNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRIRDLALQSANGSNSDADRAALQKEVAAQQAELTRISDTTTFGGRKLLDGSFGTTSFQVGSNAYETIDISLQNASASAIGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSVASVDISTADGAQNAIAVVDNALAAIDAQRADLGAVQNRFKNTIDNLTNISENATNARSRIKDTDFAAETAALSKNQVLQQAGTAILAQANQLPQAVLSLLR

В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой полипептид, или его производное, домена D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенного TLR5-связывающего мотива, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 10, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 10 домена D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенного TLR5-связывающего мотива

GSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSS

В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой полипептид, или его производное, фактора вирулентности PcrV секреторной системы третьего типа (TTSS) P. aeruginosa, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид с SEQ ID NO: 8, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид P. aeruginosa представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8, или его иммуногенный фрагмент.

SEQ ID NO: 8 фактора вирулентности PcrV секреторной системы третьего типа (TTSS) P. aeruginosa

MEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI

Escherichia coli

Смертность в результате сепсиса, вызванного E. coli, составляет 20%-40% даже при оптимальной противомикробной терапии и поддерживающей терапии (Grandsen et al., 1990; Kreger et al., 1980; Rayner and Willcox, 1988; Bryan et al., 1983; Cross et al., 1983). Безусловно, существует потребность в новых профилактических и терапевтических подходах, включая дополнительное лечение антителами к этим и другим грамотрицательным бактериям. Хотя O-антиген-специфичные антитела защищают от инфекции, вызываемой гомологичными бактериальными штаммами, исследователи считают, что иммунотерапия такими антителами имеет ограниченную ценность ввиду разнообразия серотипов грамотрицательных бактерий (Baumgartner, 1990). Однако эпидемиологические исследования бактериальных серотипов, связанных с внекишечной инвазивной инфекцией E. coli, выявили, что ограниченное количество O-серогрупп являются причиной приблизительно 60% случаев бактериемии (Grandsen et al., 1990; Cross et al., 1984; McCabe et al., 1978). Соответственно, сохраняется потребность в эффективных технологиях профилактики и/или лечения таких инфекций.

Способы очистки полисахаридов

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам очистки одного или более полисахаридов, описанных в настоящем изобретении, от одного или более клеточных компонентов бактерий. В некоторых вариантах осуществления способы включают очистку O-антигенного полисахарида от одного или более клеточных компонентов бактерий. В некоторых вариантах осуществления способы включают очистку CPS от одного или более клеточных компонентов бактерий.

В некоторых вариантах осуществления бактерии являются грамотрицательными. В некоторых вариантах осуществления бактерии представляют собой K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления клеточные компоненты включают белок. В некоторых вариантах осуществления клеточные компоненты включают нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления клеточные компоненты включают липиды. В некоторых вариантах осуществления клеточные компоненты включают полисахариды. В некоторых вариантах осуществления клеточные компоненты являются частью лизата.

В некоторых вариантах осуществления способ очистки полисахарида от одного или более клеточных компонентов бактерий включает создание контакта клеточных компонентов с окисляющим реагентом и кислотой, с получением смеси. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент представляет собой нитрит натрия. В некоторых вариантах осуществления кислота представляет собой уксусную кислоту. В некоторых вариантах осуществления значение pH смеси составляет от приблизительно 3 до приблизительно 5. В некоторых вариантах осуществления способ включает отделение O-антигенного полисахарида от одного или более клеточных компонентов в смеси. В некоторых вариантах осуществления отделенный OPS содержит свободный альдегид на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления отделенный OPS содержит остаток 2,5-ангидроманнозы, содержащий свободный альдегид, на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления способ включает извлечение OPS, при этом извлеченный OPS является практически свободным от одного или более других клеточных компонентов. В некоторых вариантах осуществления извлеченный OPS содержит свободный альдегид на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления извлеченный OPS содержит остаток 2,5-ангидроманнозы, содержащий свободный альдегид, на его восстанавливающем конце.

В некоторых вариантах осуществления способ очистки полисахарида от одного или более клеточных компонентов грамотрицательных бактерий включает создание контакта клеточных компонентов с кислотным реагентом, с получением смеси. В некоторых вариантах осуществления значение pH смеси составляет от приблизительно 3 до приблизительно 5. В некоторых вариантах осуществления способ включает нагревание смеси до температуры от приблизительно 80°C до приблизительно 135°C. В некоторых вариантах осуществления способ включает отделение корового и O-антигенного полисахарида (COPS) от одного или более клеточных компонентов в смеси. В некоторых вариантах осуществления отделенный COPS содержит KDO на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления отделенный COPS содержит кетон в KDO на его восстанавливающем конце. В некоторых вариантах осуществления способ включает извлечение COPS, при этом извлеченный COPS является практически свободным от одного или более других клеточных компонентов. В некоторых вариантах осуществления извлеченный COPS содержит кетон на его восстанавливающем конце.

Пары аффинных молекул

Как описано в настоящем изобретении, в некоторых вариантах осуществления иммунные комплексы по изобретению включают один или более полипептидов в не ковалентном комплексе с одним или более полимерами и/или одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидов образуют комплекс за счет аффинного взаимодействия с одним или более полимерами и/или одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления иммунные комплексы по изобретению включают один или более полипептидов в не ковалентном комплексе с одним или более полимерами и/или одним или более антигенными полисахаридами, образованном за счет одной или более пар аффинная молекула/комплементарная аффинная молекула. В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс включает (i) первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении, конъюгированную с одним или более полимерами и/или конъюгированную с одним или более антигенными полисахаридами, и (ii) слитый белок, который представляет собой, или содержит, комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении, и полипептид. При связывании первой аффинной молекулы и комплементарной аффинной молекулы один или более полипептидов образуют не ковалентный комплекс с одним или более полимерами и/или одним или более антигенными полисахаридами.

В некоторых вариантах осуществления пару аффинная молекула/комплементарная аффинная молекула выбирают из одного или более из: биотина/биотин-связывающего белка, антитела/антигена, фермента/субстрата, рецептора/лиганда, металла/металл-связывающего белка, углевод/углевод-связывающего белка, липида/липид-связывающего белка и His-метки/His-метку-связывающей молекулы.

В некоторых вариантах осуществления первая аффинная молекула представляет собой биотин (или его производное, или фрагмент), и комплементарная аффинная молекула представляет собой биотин-связывающий белок, или его биотин-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок представляет собой ризавидин, авидин, стрептавидин, брадавидин, тамавидин, лентиавидин, зебавидин, нейтравидин, каптавидин™, или их биотин-связывающие фрагменты, или их сочетание. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок представляет собой ризавидин, или его биотин-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок содержит полипептид с SEQ ID NO: 13, или его биотин-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок содержит полипептид с SEQ ID NO: 14, или его биотин-связывающий фрагмент.

Слитые белки

В некоторых вариантах осуществления иммунный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает слитый белок, который представляет собой, или содержит, комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении, и один или более полипептидов, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления такие слитые белки имеют свойства носителя и/или антигенные свойства. В некоторых вариантах осуществления слитый белок представляет собой, или содержит, биотин-связывающий белок, или его биотин-связывающий домен, и полипептид.

В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок содержит полипептид с SEQ ID NO: 13, или его биотин-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 13, или его биотин-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления биотин-связывающий белок содержит полипептид с SEQ ID NO: 14, или его биотин-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления полипептид представляет собой, или содержит, полипептид, имеющий по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 14, или его биотин-связывающий фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит один или более линкеров и/или гистидиновую метку. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 (GGGGSSS). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 15.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина FlaB P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 11 (домен D2 флагеллина FlaA1 P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 12 (домен D2 флагеллина FlaA2 P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV секреторной системы III типа (TTSS) P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит комплементарную аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин-связывающий белок, описанный в настоящем изобретении), и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина подтипа B FliC P. aeruginosa, лишенный TLR5-связывающего мотива), или его иммуногенный фрагмент, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 26.

Каркасные полимеры

Как описано в настоящем изобретении, в некоторых вариантах осуществления иммунные комплексы по изобретению включают каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, полисахарид, полипептид или синтетический дендример. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, поли-L-лизин (PLL). В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, линейный поли-L-лизин или дендример L-лизина. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой CPS, полученный из грамотрицательных или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления CPS представляет собой CPS K. pneumoniae, экзополисахарид P. aeruginosa и/или CPS E. coli. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой CPS KP K19. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой дендример синтетического моносахарида или олигосахарида. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет размер от приблизительно 50 КДа до приблизительно 2000 КДа. В некоторых вариантах осуществления полимер имеет антигенные свойства. В некоторых вариантах осуществления полимер не является антигенным. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой, или содержит, один или более антигенных полисахаридов. В некоторых вариантах осуществления один или более антигенных полисахаридов могут представлять собой OPS K. pneumoniae, OPS P. aeruginosa, или их сочетание.

Каркасный полимер 1 (BP-1)

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с полимером. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антигенный полисахарид представляет собой O-антигенный полисахарид, коровый O-антиген или коровый полисахарид. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает по меньшей мере один полимер (например, полисахарид), который является биотинилированным, и по меньшей мере один антигенный полисахарид (например, по меньшей мере один O-антигенный полисахарид), который является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид химически связан с частично окисленным полимером (например, полисахаридом) при помощи спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой короткий спейсер. В некоторых вариантах осуществления короткий спейсер содержит первичный амин на каждом конце спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер может представлять собой дигидразид адипиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид содержит первичную аминогруппу. В некоторых вариантах осуществления первичная аминогруппа представляет собой α-аминогруппу L-аланина внешнего ядра O-полисахарида P. aeruginosa или аминогруппу, которая была введена в восстанавливающий конец O-антигенного полисахарида за счет химического связывания спейсерной молекулы, содержащей первичную группу на каждом конце, путем восстановительного аминирования восстанавливающим реагентом. В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид, содержащий первичную аминогруппу, химически связывают путем смешивания O-антигенного полисахарида, содержащего первичную аминогруппу, с частично окисленным полимером (например, полисахаридом), содержащим альдегидную группу и биотин, содержащий первичный амин, с получением смеси; и восстановительного аминирования смеси восстанавливающим реагентом, с получением каркасного полимера, при этом полимер (например, полисахарид) является биотинилированным, но химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является частично окисленным окисляющим реагентом. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент представляет собой периодат натрия. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий реагент включает цианоборогидрид натрия или борогидрид натрия.

Каркасный полимер 1.2 (BP-1.2)

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер, который включает по меньшей мере один биотинилированный полимер (например, биотинилированный полисахарид) и по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, получают путем объединения не биотинилированного O-антигенного полисахарида, который содержит первичную аминогруппу (естественным образом или с линкером), с частично окисленным полисахаридом, содержащим одну или более альдегидных групп и один или более остатков биотина, введенных в ортогональный сайт путем проведения реакции с карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), и с использованием карбоксилатов остатков уроновой кислоты полисахарида, и восстановительного аминирования смеси восстанавливающим реагентом для химического связывания O-антигенного полисахарида (то есть, антигенного полисахарида) с полисахаридом (то есть, полимером), за счет чего образуется каркасный полимер, который включает биотинилированный полисахарид, химически связанный с не биотинилированным антигенным полисахаридом (то есть, не биотинилированным O-антигенным полисахаридом). В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид химически связан с частично окисленным полимером (например, полисахаридом) при помощи спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой короткий спейсер. В некоторых вариантах осуществления короткий спейсер содержит первичный амин на каждом конце спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер может представлять собой дигидразид адипиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является частично окисленным окисляющим реагентом. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент включает периодат натрия. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий реагент включает цианоборогидрид натрия или борогидрид натрия.

В некоторых вариантах осуществления OPS, содержащий альдегид или кетон, аминируют на его восстанавливающем конце, с использованием короткого спейсера, содержащего первичный амин на каждом конце (например, дигидразид адипиновой кислоты ADH), путем восстановительного аминирования цианоборогидридом натрия (NaBH3CN), с получением дериватизированного гидразидом OPS. В некоторых вариантах осуществления каркас CPS KP19 биотинилируют одним или более остатками биотина, введенными в ортогональный сайт путем проведения реакции карбоксилатов остатков уроновой кислоты полисахарида с карбодиимидом (EDC), N-гидроксисукцинимидом (NHS) и производным биотина, содержащим первичный амин (таким как, например, амин-ПЭГ3-биотин). В некоторых вариантах осуществления биотинилированный полимер CPS KP 19 затем частично окисляют периодатом, получая одну или более альдегидных групп, смешивают с дериватизированным гидразидом OPS и проводят восстановительное аминирование смеси восстанавливающим реагентом, таким как цианоборогидрид натрия (NaBH3CN), с получением каркасного полимера BP-1.2, содержащего один или более фрагментов биотина на остатках уроновой кислоты полимерного каркаса и без биотина на O-антигенном полисахариде.

Каркасный полимер 1.3 (BP-1.3)

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер, который включает по меньшей мере один биотинилированный полимер (например, биотинилированный полисахарид) и по меньшей мере один не биотинилированный O-антигенный полисахарид, получают путем объединения не биотинилированного O-антигенного полисахарида, который содержит первичную аминогруппу (естественным образом или с линкером), с CDAP-активированным полисахаридом с одним или более остатками биотина, введенными в ортогональный сайт путем проведения реакции с карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS), и с использованием карбоксилатов остатков уроновой кислоты полисахарида, с получением каркасного полимера, который включает биотинилированный полисахарид, химически связанный с не биотинилированным антигенным полисахаридом (то есть, не биотинилированным O-антигенным полисахаридом). В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид химически связан с CDAP-активированным полимером (например, полисахаридом) при помощи спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой короткий спейсер. В некоторых вариантах осуществления короткий спейсер содержит первичный амин на каждом конце спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер может представлять собой дигидразид адипиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является не биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления OPS, содержащий альдегид или кетон, аминируют на его восстанавливающем конце, с использованием короткого спейсера, содержащего первичный амин на каждом конце (например, дигидразид адипиновой кислоты ADH), путем восстановительного аминирования цианоборогидридом натрия (NaBH3CN), с получением дериватизированного гидразидом OPS. В некоторых вариантах осуществления каркас CPS KP19 биотинилируют одним или более остатками биотина, введенными в ортогональный сайт путем проведения реакции карбоксилатов остатков уроновой кислоты полисахарида с карбодиимидом (EDC), N-гидроксисукцинимидом (NHS) и производным биотина, содержащим первичный амин (таким как, например, амин-ПЭГ3-биотин). В некоторых вариантах осуществления биотинилированный полимер CPS KP 19 затем активируют CDAP, смешивают с дериватизированным гидразидом OPS, с получением каркасного полимера BP-1.3, содержащего один или более фрагментов биотина на остатках уроновой кислоты полимерного каркаса, и без биотина на O-антигенном полисахариде.

Каркасный полимер 2a (BP-2a)

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с полимером, и включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антигенный полисахарид представляет собой O-антигенный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает по меньшей мере один полимер (например, полисахарид), который является биотинилированным, и по меньшей мере один O-антигенный полисахарид, который является биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид химически связан с частично окисленным полисахаридным каркасом при помощи спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер представляет собой короткий спейсер. В некоторых вариантах осуществления короткий спейсер содержит первичный амин на каждом конце спейсера. В некоторых вариантах осуществления спейсер может представлять собой дигидразид адипиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления полимер (например, полисахарид) является частично окисленным окисляющим реагентом. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент включает периодат натрия. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий реагент включает цианоборогидрид натрия или борогидрид натрия.

Каркасный полимер 2b (BP-2b)

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с антигенным полисахаридом. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полисахарид. В некоторых вариантах осуществления антигенный полисахарид представляет собой O-антигенный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает по меньшей мере один полимер (например, полисахарид), который является не биотинилированным, и по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер, который включает по меньшей мере один не биотинилированный полимер (например, не биотинилированный полисахарид) и по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид, получают путем биотинилирования O-антигенного полисахарида, содержащего O-полисахаридные повторы и один или более коровых альфа-KDO и/или гептозных фрагментов, при помощи CDAP и биотина, содержащего первичный амин, с получением смеси биотинилированного O-антигенного полисахарида; частичного окисления смеси биотинилированного OPS периодатом натрия для введения альдегидов в коровые KDO и/или гептозные фрагменты и/или остатки OPS; восстановительного аминирования биотинилированного полисахарида дигидразидом адипиновой кислоты; смешивания биотинилированного и аминированного OPS с частично окисленным полимером (например, полисахаридом), с получением смеси; и восстановительного аминирования смеси; с получением каркасного полимера, который включает полимер (например, полисахарид), который является не биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид, который является биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления O-антигенный полисахарид является частично окисленным окисляющим реагентом. В некоторых вариантах осуществления окисляющий реагент включает периодат натрия. В некоторых вариантах осуществления восстанавливающий реагент включает цианоборогидрид натрия или борогидрид натрия.

Каркасный полимер 3 (BP-3)

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, включает каркасный полимер, включающий полимер, конъюгированный с одним или более антигенными полисахаридами. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает первую аффинную молекулу, описанную в настоящем изобретении (например, биотин), конъюгированную (например, сшитую или ковалентно связанную) с антигенным полисахаридом. В некоторых вариантах осуществления полимер представляет собой полимер поли-L-лизин (PLL). В некоторых вариантах осуществления антигенный полисахарид представляет собой O-антигенный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер включает по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид и полимер PLL.

В некоторых вариантах осуществления каркасный полимер, который включает по меньшей мере один не биотинилированный полимер (например, не биотинилированный полимер PLL) и по меньшей мере один биотинилированный O-антигенный полисахарид, получают путем восстановительного аминирования O-антигенного полисахарида, содержащего концевые альдегиды или KDO, с ε-NH₂ группами полимера PLL, с получением полимера OPS-PLL; обработки, или не обработки, смеси ацилирующим реагентом для блокирования непрореагировавших ε-NH₂ групп полимера PLL; дериватизации OPS при помощи CDAP, с получением смеси производных; и проведения реакции смеси производных с биотином, содержащим первичный амин; с получением каркасного полимера, при этом блокированный полимер N-ацетилированный-PLL или неблокированный PLL является не биотинилированным, и химически связанный O-антигенный полисахарид является биотинилированным.

В некоторых вариантах осуществления ацилирующий реагент представляет собой уксусный ангидрид или ацетилхлорид.

В некоторых вариантах осуществления реакцию «клик-химии» используют для связывания полимера (например, полисахарида), имеющего алкиновую функциональную группу на его карбоксилатных группах, с окисленными полисахаридными альдегидами на O-антигенном полисахариде, дериватизированном азидогруппой на его восстанавливающем конце. Связывание реакцией клик-химии 2 полисахаридов проводят с катализатором в водной среде. Связывание реакцией клик-химии O-антигенного полисахарида с полисахаридом можно использовать в обратимых вариантах, либо с азидогруппой, присоединенной к OPS и алкиновой группой, присоединенной к полисахариду, либо наоборот. Биотинирование можно проводить с использованием такой химии избирательно либо на полисахариде, с получением каркасного полимера 1, либо на O-антигенном полисахариде, с получением каркасного полимера 2b.

В некоторых вариантах осуществления катализатором для алкин-азидного циклоприсоединения является сульфат меди. В некоторых вариантах осуществления алкиновую группу для дериватизации полисахарида выбирают из группы, состоящей из 1-амино-3-бутина, 1-амино-4-пентина, DBCO-амина и алкин-ПЭГ4-амина.

В некоторых вариантах осуществления азидную группу для дериватизации O-антигенного полисахарида на его восстанавливающем конце выбирают из группы, состоящей из амино-ПЭГ-азида, азидо-ПЭГ3-амина, азидопропиламина и азидобутиламина.

Применение иммуногенных комплексов

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, который включает один или более антигенных полисахаридов, характеризуется тем, что одно или более из потенциальной возможности опсонизации или иммуногенности одного или более антигенных полисахаридов увеличивается относительно ранее определенного уровня, при измерении методом ELISA и/или в функциональном анализе антител. В некоторых вариантах осуществления одно или более из потенциальной возможности опсонизации или иммуногенности одного или более антигенных полисахаридов увеличивается по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза или 5 раз относительно ранее определенного уровня, при измерении методом ELISA и/или в функциональном анализе антител. В некоторых вариантах осуществления ранее определенный уровень представляет собой преиммунный уровень. В некоторых вариантах осуществления эпитопная валентность одного или более антигенных полисахаридов превышает по меньшей мере в 1 раз, 2 раза, 3 раза, 4 раза или 5 раз таковую у нативного полисахарида. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов представляют собой белки-носители для одного или более антигенных полисахаридов.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на уровне, превышающем уровень в случае композиции, содержащей только антигенный полисахарид, и не содержащий каркасный полимер, при измерении методом ELISA. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на уровне, превышающем уровень в случае композиции, содержащей только каркасный полимер, и не содержащей антигенный полисахарид, при измерении методом ELISA.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту индуцирует иммунный ответ против одного или более патогенов у пациента на уровне, превышающем уровень в случае композиции, содержащий только антигенный полисахарид, и не содержащей каркасный полимер. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту индуцирует иммунный ответ против одного или более патогенов у пациента на уровне, превышающем уровень в случае композиции, содержащей каркасный полимер, и не содержащей антигенный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой выработку антител или B-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой CD4+ T-клеточный ответ, включая Th1, Th2, или Th17 ответ, или CD8+ T-клеточный ответ, или CD4+/CD8+ T-клеточный ответ. В некоторых вариантах осуществления иммунный ответ представляет собой выработку антител или B-клеточный ответ; и T-клеточный ответ.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на более высоком уровне, чем в случае композиции, содержащей только полипептидный антиген, и не содержащей каркасный полимер, при измерении методом ELISA. В некоторых вариантах осуществления один или более патогенов выбирают из K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает иммунный ответ против одного или более из K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает иммунный ответ против грамотрицательных и/или грамположительных бактерий. В некоторых вариантах осуществления грамотрицательные бактерии выбирают из K. pneumoniae, P. aeruginosa, E. coli., а также их сочетания. В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, после введения пациенту вызывает продуцирование антител, которые узнают нативный MrkA на экспрессирующих MrkA K. pneumoniae.

В некоторых вариантах осуществления иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, содержит один или более полипептидных антигенов. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов представляют собой бактериальный полипептид, грибковый полипептид и/или вирусный полипептид. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидных антигенов представляют собой полипептид из Klebsiella, Pseudomonas и/или E. coli.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из антигенных полисахаридов представляет собой экзополисахарид PsL P. aeruginosa. В некоторых вариантах осуществления PsL содержит по меньшей мере один эпитоп, который связывает моноклональное антитело, содержащее последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 4, и/или последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 5 (Cam-003). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1 (фимбриальный белок I типа K. pneumoniae). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 (консервативный фимбриальный белок III типа MrkA K. pneumoniae), или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3 мономерного стабилизированного MrkA, или ее иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген представляет собой флагеллин подтипа A FliC P. aeruginosa, флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa, или его иммуногенный фрагмент. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полипептидный антиген содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 6 (подтип A1), аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 9 (подтип A2), или ее иммуногенный фрагмент.

Получение иммуногенных комплексов

Настоящее изобретение относится к способам получения иммуногенных комплексов, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления способ получения иммуногенных комплексов включает образование комплекса из по меньшей мере одного биотинилированного каркасного полимера с по меньшей мере одним биотин-связывающим слитым белком. В некоторых вариантах осуществления слитый белок содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с любой из SEQ ID NO: 16-26.

Заболевания, нарушения и состояния

В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении (например, композиция, содержащая иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении), вызывает продуцирование антител против одного или более патогенов у пациента на более высоком уровне, чем в случае композиции, содержащей антигенный полисахарид, и не содержащей каркасный полимер, при измерении методом ELISA. В некоторых вариантах осуществления один или более патогенов выбирают из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении (например, композиция, содержащая иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении), вызывает иммунный ответ против одного или более патогенов у пациента. В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, вызывает иммунный ответ против одного или более патогенов у пациента на более высоком уровне, чем в случае композиции, содержащей антигенный полисахарид, и не содержащий каркасный полимер. В некоторых вариантах осуществления один или более патогенов выбирают из Klebsiella, Pseudomonas и E. coli.

В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении (например, композицию, содержащую иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении), используют для лечения или предотвращения инфекции. В некоторых вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию ожоговой раны, ЖК инфекцию, инфекцию операционного поля, инфекцию мочевыводящих путей, инфекцию роговицы, инфекцию кожи и/или мягких тканей, инфекцию диабетических язв, инфекцию, связанную с медицинским устройством (например, катетером, хирургическим имплантатом, протезом). В некоторых вариантах осуществления после введения пациенту иммуногенную композицию, описанную в настоящем изобретении, используют для лечения или предотвращения пневмонии, сепсиса и/или колонизации.

Иммуногенные композиции и составы

Изобретение также относится к композициям, содержащим один или более иммуногенных комплексов, описанных в настоящем изобретении. Например, иммуногенная композиция, например, вакцинная композиция, может содержать один или более иммуногенных комплексов, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления такие композиции могут содержать множество иммуногенных комплексов одного типа, описанных в настоящем изобретении. Дополнительно или альтернативно, такие композиции могут содержать множество иммуногенных комплексов более, чем одного типа, описанных в настоящем изобретении. В некоторых вариантах осуществления иммуногенные комплексы, описанные в настоящем изобретении, составлены в фармацевтическую композицию. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может представлять собой вакцину. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция представляет собой поливалентную или мультивалентную вакцину. В некоторых вариантах осуществления валентность вакцинной композиции означает число типов иммуногенных комплексов, присутствующих в вакцинной композиции. Валентность вакцины, описанной в настоящем изобретении, не ограничена в отношении общего количества антигенов, присутствующих в указанной фармацевтической композиции, иммуногенном комплексе или вакцине, или в отношении числа штаммов патогенов, против которых введение указанной фармацевтической композиции, иммуногенного комплекса, иммуногенной композиции или вакцинной композиции, может индуцировать защитный иммунный ответ. В качестве неограничивающего примера 12-валентная вакцинная композиция может содержать более чем 12 антигенных компонентов (например, пептидных и/или полисахаридных компонентов), и может индуцировать защитный иммунный ответ против более чем 12 патогенов или патогенных штаммов.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1-50 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1-25 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1-15 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1-10 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1-5 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцина представляет собой поливалентную вакцину.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 1 тип иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 2 типа иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 4 типа иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 6 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 8 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 10 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит 12 типов иммуногенных комплексов. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных комплексов в таких количествах, что масса OPS в вакцинной композиции из каждой иммуногенной композиции отличается, например, они присутствуют в массовом отношении, отличном от приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных комплексов в таких количествах, что масса OPS в вакцинной композиции из каждой иммуногенной композиции является приблизительно одинаковой, например, они присутствуют в массовом отношении приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления масса OPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 1 мкг. В некоторых вариантах осуществления масса OPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 2 мкг. В некоторых вариантах осуществления масса OPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 3 мкг. В некоторых вариантах осуществления масса OPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 4 мкг. В некоторых вариантах осуществления масса OPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 5 мкг.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных комплексов в таких количествах, что суммарная масса OPS и CPS в вакцинной композиции из каждой иммуногенной композиции отличается, например, они присутствуют в массовом отношении, отличном от приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных комплексов в таких количествах, что суммарная масса OPS и CPS в вакцинной композиции из каждой иммуногенной композиции отличается, например, они присутствуют в массовом отношении, отличном от приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных комплексов в таких количествах, что суммарная масса OPS и CPS в вакцинной композиции из каждой иммуногенной композиции является приблизительно одинаковой, например, они присутствуют в массовом отношении приблизительно 1:1. В некоторых вариантах осуществления суммарная масса OPS и CPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 1 мкг. В некоторых вариантах осуществления суммарная масса OPS и CPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 2 мкг. В некоторых вариантах осуществления суммарная масса OPS и CPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 3 мкг. В некоторых вариантах осуществления суммарная масса OPS и CPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 4 мкг. В некоторых вариантах осуществления суммарная масса OPS и CPS в вакцине из каждой иммуногенной композиции составляет приблизительно 5 мкг.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит два или более типов иммуногенных композиций, выбранных из

(a) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(b) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(b’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(c) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(d) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(d’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(e) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(e’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(f) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(f’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(g) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(g’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(h) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(h’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(i) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(j) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(k) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и

(l) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером.

(a’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(c’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(i’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(j’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(k’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(l’) иммуногенной композиции, содержащей каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(b) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(c) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(d) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(e) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(f) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(g) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(h) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(i) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(j) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(k) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и

(l) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(b) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(d) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(e) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(f) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(g) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(h) иммуногенную композицию, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в не ковалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(a) иммуногенной композиции, содержащей KP O1 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA;

(a’) иммуногенной композиции, содержащей KP O1 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(b) иммуногенной композиции, содержащей KP O2 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA;

(b’) иммуногенной композиции, содержащей KP O2 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(c’) иммуногенной композиции, содержащей KP O3 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(d) иммуногенной композиции, содержащей KP O5 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA;

(d’) иммуногенной композиции, содержащей KP O5 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(e) иммуногенной композиции, содержащей PA O1 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA;

(e’) иммуногенной композиции, содержащей PA O1 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(f) иммуногенной композиции, содержащей PA O2 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA;

(f’) иммуногенной композиции, содержащей PA O2 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(g) иммуногенной композиции, содержащей PA O3 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA;

(g’) иммуногенной композиции, содержащей PA O3 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(h) иммуногенной композиции, содержащей PA O4 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA;

(h’) иммуногенной композиции, содержащей PA O4 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(i) иммуногенной композиции, содержащей PA O5 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA;

(i’) иммуногенной композиции, содержащей PA O5 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(j) иммуногенной композиции, содержащей PA O6 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA;

(j’) иммуногенной композиции, содержащей PA O6 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(k) иммуногенной композиции, содержащей PA O10 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA;

(k’) иммуногенной композиции, содержащей PA O10 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV;

(l) иммуногенной композиции, содержащей PA O11 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA; и

(l’) иммуногенной композиции, содержащей PA O11 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV.

В некоторых вариантах осуществления один или более из типов иммуногенных композиций дополнительно включают один или более полимеров. В некоторых вариантах осуществления OPS конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит иммуногенную композицию, выбранную из

(a) иммуногенной композиции, содержащей сочетание OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae и слитый белок FlaBD2-MrkA; и

(b) иммуногенной композиции, содержащей сочетание OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa и слитый белок FlaBD2-MrkA.

В некоторых вариантах осуществления один или более из типов иммуногенных композиций дополнительно включают один или более полимеров. В некоторых вариантах осуществления OPS K. pneumoniae конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) иммуногенную композицию, содержащую

(i) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae и любое их сочетание; и

(ii) слитый белок FlaBD2-MrkA; и/или

(b) иммуногенную композицию, содержащую

(i) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa и любое их сочетание; и

(ii)слитый белок FlaBD2-MrkA.

В некоторых вариантах осуществления один или более из типов иммуногенных композиций дополнительно включают один или более полимеров. В некоторых вариантах осуществления OPS конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит иммуногенную композицию, выбранную из

(a) иммуногенной композиции, содержащей сочетание OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, слитый белок FlaBD2-PcrV и слитый белок FlaBD2-MrkA; и

(b) иммуногенной композиции, содержащей сочетание OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, слитый белок FlaBD2-PcrV и слитый белок FlaBD2-MrkA.

В некоторых вариантах осуществления вакцина дополнительно включает один или более полимеров. В некоторых вариантах осуществления OPS конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгированы с полимером. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгированы с полимером. В некоторых вариантах осуществления полимер включает капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления полимер включает PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae; и

(b) один или более полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с одной или более из последовательностей SEQ ID NO: 1-3, 6-12 или 16-26.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция дополнительно включает один или более полимеров. В некоторых вариантах осуществления один или более OPS конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидов конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и один или более полипептидов конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления полимер включает капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления полимер включает PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae;

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

(c) один или более полипептидов, содержащих аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с одной или более из последовательностей SEQ ID NO: 1-3, 6-12 или 16-26.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae; и

(b) слитый белок FlaBD2-MrkA.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

(b) слитый белок FlaBD2-MrkA.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae;

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae; и

(b) слитый белок FlaBD2-PcrV.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

(b) слитый белок FlaBD2-PcrV.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae;

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae;

(b) слитый белок FlaBD2-MrkA; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция дополнительно включает один или более полимеров. В некоторых вариантах осуществления OPS конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS, слитый белок FlaBD2-MrkA и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления полимер включает PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

(b) слитый белок FlaBD2-MrkA; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae;

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

(c)слитый белок FlaBD2-MrkA; и

(d) слитый белок FlaBD2-PcrV.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, при этом OPS K. pneumoniae конъюгирован с одним или более полимерами; и

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидов конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и один или более полипептидов конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления полимер включает PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, при этом OPS P. aeruginosa конъюгирован с одним или более полимерами; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, при этом OPS K. pneumoniae конъюгирован с одним или более первыми полимерами;

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, при этом OPS P. aeruginosa конъюгирован с одним или более вторыми полимерами; и

В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидов конъюгированы с одним или более первыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидов конъюгированы с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полипептидов конъюгированы с одним или более первыми полимерами и одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров и один или более вторых полимеров являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров и один или более вторых полимеров являются разными. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров включают капсульный полисахарид из первого патогена. В некоторых вариантах осуществления один или более вторых полимеров включают капсульный полисахарид из второго патогена. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются разными бактериями. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются одинаковыми бактериями одного и того же серотипа. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются одинаковыми бактериями разных серотипов. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров включают PLL. В некоторых вариантах осуществления один или более вторых полимеров включают PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, при этом OPS K. pneumoniae конъюгирован с одним или более полимерами; и

(b) слитый белок FlaBD2-MrkA.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления полимер включает PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(b) слитый белок FlaBD2-MrkA.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, при этом OPS K. pneumoniae конъюгирован с одним или более полимерами;

В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более первыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более первыми полимерами и одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров и один или более вторых полимеров являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров и один или более вторых полимеров являются разными. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров включают капсульный полисахарид из первого патогена. В некоторых вариантах осуществления один или более вторых полимеров включают капсульный полисахарид из второго патогена. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются разными бактериями. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются одинаковыми бактериями одного и того же серотипа. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются одинаковыми бактериями разных серотипов. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров включают PLL. В некоторых вариантах осуществления один или более вторых полимеров включают PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(b) слитый белок FlaBD2-PcrV.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления полимер включает PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более первыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более первыми полимерами и одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров и один или более вторых полимеров являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров и один или более вторых полимеров являются разными. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров включают капсульный полисахарид из первого патогена. В некоторых вариантах осуществления один или более вторых полимеров включают капсульный полисахарид из второго патогена. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются разными бактериями. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются одинаковыми бактериями одного и того же серотипа. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются одинаковыми бактериями разных серотипов. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров включают PLL. В некоторых вариантах осуществления один или более вторых полимеров включают PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, при этом OPS K. pneumoniae конъюгирован с одним или более полимерами;

(b) слитый белок FlaBD2-MrkA; и

В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления OPS, слитый белок FlaBD2-MrkA и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгированы с одним или более полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления полимер включает PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, при этом OPS P. aeruginosa конъюгирован с одним или более полимерами;

(b) слитый белок FlaBD2-MrkA; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, при этом OPS P. aeruginosa конъюгирован с одним или более вторыми полимерами;

(d) слитый белок FlaBD2-PcrV.

В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров и один или более вторых полимеров являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров и один или более вторых полимеров являются разными. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров включают капсульный полисахарид из первого патогена. В некоторых вариантах осуществления один или более вторых полимеров включают капсульный полисахарид из второго патогена. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются разными бактериями. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются одинаковыми бактериями одного и того же серотипа. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются одинаковыми бактериями разных серотипов. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров включают PLL. В некоторых вариантах осуществления один или более вторых полимеров включают PLL. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более первыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более первыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более первыми полимерами и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более первыми полимерами и слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более первыми полимерами и одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более первыми полимерами и одним или более вторыми полимерами.

(a) иммуногенной композиции, содержащей KP O1 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA;

(a’) иммуногенной композиции, содержащей KP O1 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(b) иммуногенной композиции, содержащей KP O2 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA;

(b’) иммуногенной композиции, содержащей KP O2 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(c’) иммуногенной композиции, содержащей KP O3 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(d) иммуногенной композиции, содержащей KP O5 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA;

(d’) иммуногенной композиции, содержащей KP O5 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(e) иммуногенной композиции, содержащей PA O1 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA;

(e’) иммуногенной композиции, содержащей PA O1 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(f) иммуногенной композиции, содержащей PA O2 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA;

(f’) иммуногенной композиции, содержащей PA O2 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(g) иммуногенной композиции, содержащей PA O3 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA;

(g’) иммуногенной композиции, содержащей PA O3 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(h) иммуногенной композиции, содержащей PA O4 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA;

(h’) иммуногенной композиции, содержащей PA O4 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(i) иммуногенной композиции, содержащей PA O5 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA;

(i’) иммуногенной композиции, содержащей PA O5 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(j) иммуногенной композиции, содержащей PA O6 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA;

(j’) иммуногенной композиции, содержащей PA O6 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(k) иммуногенной композиции, содержащей PA O10 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA;

(k’) иммуногенной композиции, содержащей PA O10 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV;

(l) иммуногенной композиции, содержащей PA O11 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-MrkA; и

(l’) иммуногенной композиции, содержащей PA O11 OPS, ковалентно связанный со слитым белком FlaBD2-PcrV.

(a) иммуногенной композиции, содержащей полимер, KP O1 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или KP O1 OPS;

(a’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, KP O1 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или KP O1 OPS;

(b) иммуногенной композиции, содержащей полимер, KP O2 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или KP O2 OPS;

(b’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, KP O2 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или KP O2 OPS;

(c) иммуногенной композиции, содержащей полимер, KP O3 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или KP O3 OPS;

(c’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, KP O3 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или KP O3 OPS;

(d) иммуногенной композиции, содержащей полимер, KP O5 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или KP O5 OPS;

(d’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, KP O5 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или KP O5 OPS;

(e) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O1 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или the PA O1 OPS;

(e’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O1 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или the PA O1 OPS;

(f) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O2 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или the PA O2 OPS;

(f’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O2 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O2 OPS;

(g) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O3 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O3 OPS;

(g’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O3 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O3 OPS;

(h) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O4 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O4 OPS;

(h’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O4 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O4 OPS;

(i) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O5 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O5 OPS;

(i’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O5 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O5 OPS;

(j) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O6 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O6 OPS;

(j’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O6 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O6 OPS;

(k) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O10 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O10 OPS;

(k’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O10 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O10 OPS;

(l) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O11 OPS и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O11 OPS; и

(l’) иммуногенной композиции, содержащей полимер, PA O11 OPS и слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или PA O11 OPS.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один полимер включает капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления полимер включает PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит иммуногенную композицию, выбранную из

(a) иммуногенной композиции, содержащей полимер, сочетание OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или по меньшей мере одним из типов OPS; и

(b) иммуногенной композиции, содержащей полимер, сочетание OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок ковалентно связан с полимером и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит иммуногенную композицию, выбранную из

(a) иммуногенной композиции, содержащей один или более первых полимеров, сочетание OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок FlaBD2-PcrV ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более первых полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS, и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок FlaBD2-MrkA ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более первых полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS; и

(b) иммуногенной композиции, содержащей один или более вторых полимеров, сочетание OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок FlaBD2-PcrV ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более вторых полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS, и слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок FlaBD2-MrkA ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более вторых полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более первыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более первыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более первыми полимерами и слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более первыми полимерами и слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-MrkA конъюгирован с одним или более первыми полимерами и одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления слитый белок FlaBD2-PcrV конъюгирован с одним или более первыми полимерами и одним или более вторыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров и один или более вторых полимеров являются одинаковыми. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров и один или более вторых полимеров являются разными. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров включают капсульный полисахарид из первого патогена. В некоторых вариантах осуществления один или более вторых полимеров включают капсульный полисахарид из второго патогена. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются разными бактериями. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются одинаковыми бактериями одного и того же серотипа. В некоторых вариантах осуществления первый патоген и второй патоген являются одинаковыми бактериями разных серотипов. В некоторых вариантах осуществления один или более первых полимеров включают PLL. В некоторых вариантах осуществления один или более вторых полимеров включают PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров;

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae; и

(c) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с одной или более из последовательностей SEQ ID NO: 1-3, 6-12 или 16-26, при этом полипептид ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают PLL.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae;

(d) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с одной или более из последовательностей SEQ ID NO: 1-3, 6-12 или 16-26, при этом полипептид ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae; и

(c) слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок FlaBD2-MrkA ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae;

(d) слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок FlaBD2-MrkA ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae; и

(c) слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок FlaBD2-PcrV ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae;

(d) слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок FlaBD2-PcrV ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae;

(c) слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок FlaBD2-MrkA ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae;

(d) слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок FlaBD2-MrkA ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS; и

(e) слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок FlaBD2-PcrV ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, при этом OPS K. pneumoniae ковалентно связан с одним или более полимерами; и

(b) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с одной или более из последовательностей SEQ ID NO: 1-3, 6-12 или 16-26, при этом полипептид ковалентно связан с по меньшей мере частью полимера и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, при этом OPS P. aeruginosa ковалентно связан с одним или более полимерами; и

(b) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с одной или более из последовательностей SEQ ID NO: 1-3, 6-12 или 16-26, при этом полипептид ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae, при этом OPS K. pneumoniae ковалентно связан с одним или более полимерами;

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, при этом OPS P. aeruginosa ковалентно связан с одним или более полимерами; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(b) слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок FlaBD2-MrkA ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более полимеров,

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(b) слитый белок FlaBD2-PcrV, при этом слитый белок FlaBD2-PcrV ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS.

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(b) слитый белок FlaBD2-MrkA, при этом слитый белок FlaBD2-MrkA ковалентно связан с по меньшей мере частью одного или более полимеров и/или по меньшей мере одним из типов OPS; и

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(a) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, при этом OPS P. aeruginosa ковалентно связан с одним или более полимерами;

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит

(b) один или более из OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa, при этом OPS P. aeruginosa ковалентно связан с одним или более полимерами;

В некоторых вариантах осуществления вакцинная композиция содержит:

(a) первую иммуногенную композицию, содержащую полимер, KP O1 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-MrkA, ковалентно связанный с полимером;

(b) вторую иммуногенную композицию, содержащую полимер, KP O2 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-PcrV, ковалентно связанный с полимером;

(c) третью иммуногенную композицию, содержащую полимер, KP O3 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-MrkA, ковалентно связанный с полимером;

(d) четвертую иммуногенную композицию, содержащую полимер, KP O5 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-PcrV, ковалентно связанный с полимером;

(e) пятую иммуногенную композицию, содержащую полимер, PA O1 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-PcrV, ковалентно связанный с полимером;

(f) шестую иммуногенную композицию, содержащую полимер, PA O2 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-PcrV, ковалентно связанный с полимером;

(g) седьмую иммуногенную композицию, содержащую полимер, PA O3 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-PcrV, ковалентно связанный с полимером;

(h) восьмую иммуногенную композицию, содержащую полимер, PA O4 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-PcrV, ковалентно связанный с полимером;

(i) девятую иммуногенную композицию, содержащую полимер, PA O5 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-MrkA, ковалентно связанный с полимером;

(j) десятую иммуногенную композицию, содержащую полимер, PA O6 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-MrkA, ковалентно связанный с полимером;

(k) одиннадцатую иммуногенную композицию, содержащую полимер, PA O10 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-MrkA, ковалентно связанный с полимером; и

(l) двенадцатую иммуногенную композицию, содержащую полимер, PA O11 OPS, конъюгированный с полимером, и слитый белок FlaBD2-MrkA, ковалентно связанный с полимером.

В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере один из полимеров включает капсульный полисахарид. В некоторых вариантах осуществления капсульный полисахарид представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19. В некоторых вариантах осуществления один или более полимеров включают PLL.

Оптимальные количества компонентов для конкретной вакцины могут быть установлены в стандартных исследованиях, включающих наблюдение соответствующих иммунных ответов у пациентов. После начальной вакцинации пациенты могут получать одну или несколько бустер-иммунизаций через адекватные временные интервалы.

Иммуногенные комплексы, описанные в настоящем изобретении, и/или их препараты, могут быть составлены в стандартной лекарственной форме для легкости введения и однородности доз. Конкретный терапевтически эффективный уровень дозы для любого конкретного пациента или микроорганизма может зависеть от различных факторов, включая степень тяжести или степень риска инфицирования; активность конкретной используемой вакцины или вакцинной композиции; другие характеристики конкретной используемой вакцины или вакцинной композиции; возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол пациента, диету пациента, фармакокинетическое состояние пациента, время введения (например, относительно других видов деятельности пациента, таких как прием пищи, сон, прием других лекарственных препаратов, в том числе доз других вакцин, и так далее), путь введения, скорость экскреции конкретной используемой вакцины или вакцинной композиции; вакцины, используемые в сочетании или параллельно с используемой вакцинной композицией; и аналогичные факторы, хорошо известные в области медицины.

Иммуногенные комплексы для использования по настоящему изобретению могут быть составлены в композиции (например, фармацевтические композиции) известными методами. Вакцинный препарат в общих чертах описан в Vaccine Design (Powell and Newman, 1995). Например, иммуногенное количество вакцинного препарата может быть составлено с одним или более органическими или неорганическими, жидкими или твердыми, фармацевтически приемлемыми материалами носителя. Получение пневмококковых полисахаридных и конъюгатных вакцин описано, например, в патенте USSN 11/395593, выпущенном 31 марта 2006 г., содержание которого включено в настоящий документ посредством ссылки.

Как правило, фармацевтически приемлемый носитель(и) включает растворители, дисперсионные среды и тому подобное, которые сочетаются с фармацевтическим введением. Например, материалы, которые служат в качестве фармацевтически приемлемых носителей, включают, но без ограничения, сахара, такие как лактоза, глюкоза, декстроза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как натрий-карбоксиметилцеллюлоза, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошковый трагакант; солод; желатин; тальк; эксципиенты, такие как масло какао и суппозиторные воски; масла, такие как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; полиолы, такие как глицерин, пропиленгликоль и жидкий полиэтиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллаурат; агар; буферные средства, такие как гидроксид магния; альгиновую кислоту; апирогенную воду; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатные буферные растворы, а также другие нетоксичные совместимые смазывающие средства, такие как лаурилсульфат натрия и стеарат магния, кроме того, консерванты и антиоксиданты также могут присутствовать в композиции, в соответствии с решением формулирующего препарат специалиста (Martin, 1975).

Вакцины могут быть составлены путем объединения одного или более иммуногенных комплексов, раскрытых в настоящем изобретении, с носителями и/или другими необязательными компонентами любыми доступными способами, включая, например, общепринятое смешивание, гранулирование, растворение, лиофилизацию или аналогичные методы.

Вакцинные композиции, которые могут быть использованы в предложенных способах, могут находиться в лиофилизированном состоянии вплоть до приблизительно того времени, когда они будут использованы, в этот момент они могут быть восстановлены растворителем непосредственно перед введением. В некоторых вариантах осуществления вакцинные компоненты или композиции лиофилизируют в присутствии одного или более других компонентов (например, адъювантов) и восстанавливают солевым раствором непосредственно перед введением. Альтернативно, индивидуальные компоненты, или наборы компонентов, можно отдельно лиофилизировать и/или хранить (например, в наборе для вакцинации); компоненты восстанавливают и либо смешивают перед использованием, либо вводят отдельно пациенту.

Лиофилизация может способствовать большей стабильности композиции (например, за счет предотвращения или уменьшения разрушения полисахаридных антигенов). Лиофилизация вакцин или вакцинных компонентов хорошо известна в данной области. Как правило, жидкую вакцину, или вакцинный компонент, лиофилизируют, часто в присутствии предотвращающего слеживание средства (такого как, например, сахара, например, сахароза или лактоза). В некоторых вариантах осуществления предотвращающее слеживание средство присутствует, например, в начальной концентрации 10-200 мг/мл. Лиофилизацию, как правило, выполняют в виде серии этапов, например, цикл начинают при -69°C, постепенно доводят до -24°C в течение 3 ч, затем поддерживают эту температуру в течение 18 ч, после чего постепенно доводят до -16°C в течение 1 ч, затем поддерживают эту температуру в течение 6 ч, после чего постепенно доводят до +34°C в течение 3 ч, и в завершение поддерживают эту температуру в течение 9 ч.

Вакцины, или вакцинные компоненты, для использования по настоящему изобретению могут быть заключены в липосомы, кохлеаты, биоразлагаемые полимеры, такие как полилактид, полигликолид и полимеры на основе лактида и гликолида, или иммуностимулирующие комплексы (ISCOMS).

В некоторых ситуациях может быть желательным пролонгированное действие вакцины, используемой по настоящему изобретению, например, путем замедления абсорбции одного или более вакцинных компонентов. Такое замедление абсорбции можно осуществлять, например, путем использования жидкой суспензии кристаллического или аморфного материала с плохой растворимостью в воде. Скорость абсорбции продукта зависит от скорости его растворения, которая, в свою очередь, может зависеть от размера и формы. Альтернативно или дополнительно, замедление абсорбции можно осуществлять путем растворения или суспендирования одного или более вакцинных компонентов в масляной среде. Инъекционные формы депо также можно использовать для замедления абсорбции. Такие формы депо можно получать путем формирования микрокапсульных матриц из одного или более вакцинных компонентов в сети биоразлагаемых полимеров. В зависимости от соотношения полимера и вакцинного компонента, а также от природы конкретного используемого полимера(ов), можно контролировать скорость высвобождения.

Примеры биоразлагаемых полимеров, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают, например, поли(ортоэфиры) и поли(ангидриды). Одним конкретным иллюстративным полимером является полилактид-полигликолид.

Инъекционные препараты-депо также могут быть получены путем заключения препарата в липосомы или микроэмульсии, которые совместимы с тканями тела.

Полимерные системы доставки также можно использовать в препаратах, не являющихся депо, включая, например, пероральные препараты. Например, в пероральных препаратах можно использовать биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры, полимолочная кислота и так далее. Полисахаридные антигены или конъюгаты могут быть составлены с такими полимерами, например, для получения частиц, микрочастиц, экструдатов, твердых дисперсий, смесей, или других сочетаний, с целью облегчения получения полезных препаратов (например, пероральных препаратов).

Вакцины для использования по настоящему изобретению включают иммуногенные композиции и, кроме того, могут включать одно или более дополнительных активных средств (то есть, средств, которые оказывают биологический эффект - не инертных ингредиентов). Следует понимать, что такие дополнительные средства можно формулировать вместе с одним или более другими вакцинными компонентами, или можно хранить отдельно и объединять в момент, или приблизительно в момент, введения. В некоторых вариантах осуществления такие дополнительные компоненты можно вводить отдельно от некоторых, или от всех, других вакцинных компонентов, в соответствующем временном окне для достижения соответствующего эффекта.

Например, при изготовлении вакцин принято включать один или более адъювантов. Адъюванты, как правило, представляют собой средства, которые усиливают иммунный ответ на антиген. В некоторых вариантах осуществления используют адъюванты, которые усиливают иммунный ответ Th1-типа.

В некоторых вариантах осуществления используют адъюванты, которые усиливают иммунный ответ Th17-типа.

Адъюванты

В некоторых вариантах осуществления иммуногенные комплексы, описанные в настоящем изобретении, составляют и/или вводят в комбинации с адъювантом. В некоторых вариантах осуществления адъювант выбирают из группы, состоящей из гидроксида алюминия, фосфатированного гидроксида алюминия, фосфата алюминия, агониста TLR, агониста TLR2 (например, сапонина (например, QS21 и так далее), порина и так далее), агониста TLR3 (например, дцРНК, полиI:полиC, поли-ICLC, Hiltonol^® и так далее), агониста TLR4 (например, монофосфориллипида A (MPL A)), агониста TLR5 (например, флагеллина); агониста TLR 7, 8 или 9 (например, CpG-олигонуклеотида и так далее).

В некоторых вариантах осуществления адъюванты, подходящие для использования по настоящему изобретению, включают, но без ограничения:

(1) соли алюминия (квасцы), такие как гидроксид алюминия, фосфат алюминия, сульфат алюминия и так далее;

(2) эмульсионные препараты типа масло в воде (с добавлением или без добавления других специфических иммуностимулирующих средств, таких как мурамилпептиды (описанные ниже) или компоненты клеточной стенки бактерий, такие как, например,

(a) MF59 (PCT публикация № WO 90/14837), содержащий 5% сквалена, 0,5% Tween 80 и 0,5% Span 85 (необязательно, содержащий различные количества MTP-PE (смотри ниже, хотя и не обязательно)), составленный в субмикронные частицы с использованием микрофлюидизатора, такого как микрофлюидизатор модели 110Y (Microfluidics, Newton, MA),

(b) SAF, содержащий 10% сквалена, 0,4% Tween 80, 5% блок-сополимера плюроника L121 и thr-MDP (смотри ниже), либо микрофлюидизированный в субмикронную эмульсию, либо перемешанный на вихревой мешалке для получения эмульсии с более крупными частицами, и

(c) адъювантная система Ribi™ (RAS), (Corixa, Hamilton, MT) содержащая 2% сквалена, 0,2% Tween 80 и один или более компонентов клеточной стенки бактерий, из группы, состоящей из 3-O-дезацил-монофосфолипида A (MPL™), описанного в патенте США № 4912094 (Corixa), димиколата трегалозы (TDM) и скелета клеточной стенки (CWS), предпочтительно, MPL+CWS (Detox™);

(3) адъюванты на основе сапонинов, такие как Quil A или STIMULON™ QS-21 (Antigenics, Framingham, MA) (патент США № 5057540), могут быть использованы, или полученные из них частицы, такие как ISCOM (иммуностимулирующие комплексы);

(4) бактериальные липополисахариды, синтетические аналоги липида A, такие как соединения аминоалкилглюкозаминфосфата (AGP), или их производные или аналоги, которые доступны от компании Corixa и которые описаны в патенте США № 6113918; одним таким AGP является 2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]этил-2-дезокси-4-O-фосфоно-3-O-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоил]-2-[(R)-3-тетрадеканоилокситетрадеканоиламино]-b-D-глюкопиранозид, который также известен как 529 (прежнее название RC529), который составляют в водной форме или в форме стабильной эмульсии, синтетические полинуклеотиды, такие как олигонуклеотиды, содержащие мотив(ы) CpG (патент США № 6207646); агонисты TLR3 (синтетическая дцРНК, полиI:полиC, Hiltonol^®, которые доступны от компании InvivoGen);

(5) цитокины, такие как интерлейкины (например, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18 и так далее), интерфероны (например, гамма-интерферон), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), фактор некроза опухоли (TNF), костимулирующие молекулы B7-1 и B7-2 и так далее;

(6) обезвреженные мутанты бактериального АДФ-рибозилирующего токсина, такие как холерный токсин (CT), либо дикого типа, либо мутантная форма, например, в которой глутаминовая кислота в аминокислотном положении 29 заменена другой аминокислотой, предпочтительно, гистидином, в соответствии с опубликованной международной патентной заявкой номер WO 00/18434 (смотри также WO 02/098368 и WO 02/098369), коклюшный токсин (PT) или термолабильный токсин E. coli (LT), в частности LT-K63, LT-R72 и новый мутант LT, обозначенный LT(R192G/L211A) или dmLT, могут вызывать Th17-ответы на вакцинные антигены (Andreasen, 2009; Norton, 2011; Norton, 2012; Leach, 2012; Toprani, 2017), CT-S109, PT-K9/G129 (смотри, например, WO 93/13302 и WO 92/19265); и

(7) другие вещества, которые действуют как иммуностимулирующие средства, повышая эффективность композиции, например, дельта-инулин (Advax^®), Matrix M.

Мурамилпептиды включают, но без ограничения, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нормурамил-L-аланин-2-(1’-2’-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин (MTP-PE) и так далее.

Вакцины для использования по настоящему изобретению могут включать, или быть введены одновременно с другими противомикробными терапевтическими средствами. Например, такие вакцины могут включать, или быть введены с одним или более средствами, которые уничтожают или замедляют рост патогена. Такие средства включают, например, пенициллин, ванкомицин, эритромицин, азитромицин и кларитромицин, цефотаксим, цефтриаксон, левофлаксин, гатифлоксацин.

Альтернативно или дополнительно, вакцины для использования по настоящему изобретению могут включать, или быть введены с одной или более другими вакцинами или вариантами терапии. Например, один или более не пневмококковых антигенов могут быть включены, или введены вместе с вакцинами.

Введение

В некоторых вариантах осуществления иммуногенные комплексы вводят пациенту, имеющему риск развития заболевания, например, госпитализированным пациентам. Следует понимать, что индивидуум может считаться имеющим риск развития заболевания без диагностирования каких-либо симптомов заболевания. Например, если известно, что индивидуум находился, или планирует находиться, в ситуациях, связанных с относительно высоким риском воздействия инфекции, этот индивидуум будет считаться имеющим высокий риск развития заболевания (например, госпитализированный пациент, пожилой пациент, живущий в доме для престарелых, и так далее).

Можно использовать эффективные пути введения, такие как, например, пероральный, назальный, энтеральный, парентеральный, внутримышечный или внутривенный, подкожный, внутрикожный, ректальный, вагинальный, топический, внутриглазной, легочный пути введения или контактное нанесение. В некоторых вариантах осуществления вакцинные композиции можно вводить инъекцией (например, внутримышечной, внутрибрюшинной, внутрикожной и/или подкожной); или доставлять через слизистую оболочку (например, в ротовую полость/пищеварительный тракт, дыхательные и/или мочеполовые пути). Интраназальное введение вакцин может быть особенно полезным в некоторых контекстах, например, для лечения пневмонии или среднего отита (поскольку носоглоточное носительство пневмококков может быть более эффективно предотвращено, результатом чего является ослабление инфекции на самой ранней стадии). В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть желательным введение разных доз вакцины разными путями; в некоторых вариантах осуществления может быть желательным введение разных компонентов одной дозы разными путями.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фармацевтические композиции (например, вакцины) вводят внутрикожно. Общепринятая методика внутрикожной инъекции, «процедура манту», включает стадии очистки кожи, с последующим вытягиванием одной руки и введением иглы небольшого калибра (калибра 26-31), со скосом иглы, направленным вверх, под углом 10-15°. После введения скошенной части иглы ствол иглы опускают и продвигают вперед, обеспечивая небольшое давление для поднятия его под кожей. Затем жидкость вводят инъекцией очень медленно, создавая пузырь или вздутие на поверхности кожи, а затем медленно вынимают иглу.

Устройства, специально разработанные для введения жидких средств в, или через, кожу описаны, например, в WO 99/34850 и EP 1092444, кроме того, устройства для струйных инъекций описаны, например, в WO 01/13977; патенте США № 5480381, патенте США № 5599302, патенте США № 5334144, патенте США № 5993412, патенте США № 5649912, патенте США № 5569189, патенте США № 5704911, патенте США № 5383851, патенте США № 5893397, патенте США № 5466220, патенте США № 5339163, патенте США № 5312335, патенте США № 5503627, патенте США № 5064413, патенте США № 5520639, патенте США № 4596556, патенте США № 4790824, патенте США № 4941880, патенте США № 4940460, WO 97/37705 и WO 97/13537. Другие способы внутрикожного введения вакцинных препаратов могут включать использование обычных шприцев и игл, или устройств, разработанных для баллистической доставки твердых вакцин (WO 99/27961), или чрескожных пластырей (WO 97/48440; WO 98/28037); или нанесение на поверхность кожи (трансдермальная или чрескожная доставка, WO 98/20734; WO 98/28037).

Как описано выше, фармацевтические композиции (например, вакцины) можно вводить в виде одной дозы или нескольких доз. Следует понимать, что введение представляет собой введение в одной «дозе», при условии, что все соответствующие компоненты вводят пациенту в пределах временного окна; нет необходимости в том, чтобы каждый компонент присутствовал в одной композиции. Например, введение двух разных иммуногенных композиций в течение менее 24 ч считается введением в одной дозе. В качестве примера иммуногенные композиции, имеющие разные антигенные компоненты, могут быть введены в разных композициях, но в виде части одной дозы. Как отмечено выше, такие отдельные композиции могут быть введены разными путями или одним и тем же путем. Альтернативно или дополнительно, в вариантах осуществления, в которых вакцина содержит сочетание иммуногенных композиций и дополнительные виды активных средств, иммуногенные композиции могут быть введены одним путем, а второе активное средство может быть введено тем же путем, или иным путем.

Фармацевтические композиции (например, вакцины) вводят в таких количествах и в течение таких периодов времени, которые необходимы для достижения желаемого результата. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения вакцинная композиция содержит терапевтически эффективное количество по меньшей мере одной иммуногенной композиции. Точное количество, необходимое для достижения терапевтически эффективного количества, может варьировать в зависимости от иммуногенной композиции, а также для разных пациентов, в зависимости от биологического вида, возраста и общего состояния здоровья пациента, стадии заболевания, конкретной фармацевтической смеси, способа введения и тому подобного.

Количество полисахаридного антигена(ов) или конъюгата(ов) в каждой дозе фармацевтической композиции (например, вакцины) выбирают таким образом, чтобы вакцина при введении, как описано в настоящем изобретении, могла индуцировать соответствующий защитный иммунный ответ без значительных неблагоприятных побочных эффектов. Используемый в настоящем изобретении термин «защитный иммунный», или «иммунопротективный», ответ означает иммунный ответ, достаточный для защиты иммунизированного пациента от эффективного инфицирования конкретным патогеном или патогенами, против которых направлена вакцина (например, инфицирования K. pneumoniae). Такие количества могут варьировать в зависимости от используемой конкретной иммуногенной композиции, или композиций, и от ее представления.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, вызывает Th1 и/или Th17 клеточный ответ после введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, вызывает опсонический/бактерицидный ответ против одной или более из K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli после введения пациенту. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, приводит к уменьшению скорости передачи инфекции и/или колонизации слизистых поверхностей одной или более из K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli после введения пациенту.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, содержащая иммуногенный комплекс, описанный в настоящем изобретении, приводит к уменьшению скорости передачи инфекции и/или колонизации ЖК тракта одной или более из K. pneumoniae, P. aeruginosa и E. coli при заражении.

Некоторые варианты осуществления относятся к способу иммунизации пациента против инфекции, вызываемой K. pneumoniae, включающему введение пациенту эффективного количества иммуногенного комплекса, описанного в настоящем изобретении. Некоторые варианты осуществления относятся к способу иммунизации пациента против инфекции, вызываемой K. pneumoniae, включающему введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении.

Некоторые варианты осуществления относятся к способу иммунизации пациента против инфекции, вызываемой P. aeruginosa, включающему введение пациенту эффективного количества иммуногенного комплекса, описанного в настоящем изобретении. Некоторые варианты осуществления относятся к способу иммунизации пациента против инфекции, вызываемой P. aeruginosa, включающему введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции.

Некоторые варианты осуществления относятся к способу иммунизации пациента против инфекции, вызываемой E. coli, включающему введение пациенту эффективного количества иммуногенного комплекса, описанного в настоящем изобретении. Некоторые варианты осуществления относятся к способу иммунизации пациента против инфекции, вызываемой E. coli, включающему введение пациенту эффективного количества фармацевтической композиции.

Дозирование

В соответствии с настоящим изобретением, введение фармацевтической композиции (например, вакцины) может включать доставку только одной дозы или, альтернативно, может включать введение начальной дозы, с последующим введением одной или нескольких дополнительных иммунизирующих доз через адекватные временных интервалы. Схема иммунизации представляет собой программу для введения одной или более конкретных доз одной или более конкретных пневмококковых вакцин, одним или более конкретными путями введения, пациенту одного или более конкретного возраста.

Настоящее изобретение относится к способам иммунизации, включающим введение по меньшей мере одной дозы вакцины молодому пациенту. В некоторых вариантах осуществления молодой пациент имеет возраст 18 лет или менее. В некоторых вариантах осуществления молодой пациент ранее получал одну или более доз конъюгатной пневмококковой полисахаридной вакцины; в других вариантах осуществления молодой пациент ранее не получал пневмококковые вакцины. В некоторых вариантах осуществления молодой пациент ранее был инфицирован или подвергался воздействию инфекции, вызываемой Klebsiella, Pseudomonas и/или E. coli.

Настоящее изобретение относится к способам иммунизации, включающим введение по меньшей мере одной дозы вакцины взрослому пациенту. В некоторых вариантах осуществления взрослый пациент имеет возраст более приблизительно 50 лет. В некоторых вариантах осуществления взрослый пациент имеет возраст более приблизительно 65 лет. В некоторых вариантах осуществления взрослый пациент ранее получал одну или более доз конъюгатной пневмококковой полисахаридной вакцины; в других вариантах осуществления взрослый пациент ранее не получал пневмококковые вакцины. В некоторых вариантах осуществления взрослый пациент ранее был инфицирован или подвергался воздействию инфекции, вызываемой Klebsiella, Pseudomonas и/или E. coli.

Схемы иммунизации настоящее раскрытие относится к для вызывания или индукции у пациента иммунного ответа (например, защитного иммунного ответа), достаточного для уменьшения по меньшей мере одного показателя, выбранного из группы, состоящей из заболеваемости, распространенности, частоты случаев и/или степени тяжести по меньшей мере одной инфекции, заболевания или нарушения, и/или по меньшей мере одного суррогатного маркера инфекции, заболевания или нарушения, в популяции и/или субпопуляции пациентов. Дополнительная схема иммунизации представляет собой схему, эффект которой связан с эффектом стандартной схемы, которую она дополняет. Дополнительная схема может требовать дополнительных введений и/или сверхиммуногенных доз иммуногенных композиций, описанных в настоящем изобретении, которые имеют место в стандартной схеме, или введения вакцин, не являющихся частью стандартной схемы. Полная схема иммунизации по настоящему изобретению может включать как стандартную схему, так и дополнительную схему. Иллюстративные примеры схем вакцинации приведены для иллюстративных целей. Подробное описание способов оценки иммуногенного ответа, приведенное в настоящем изобретении, позволяет разрабатывать альтернативы иллюстративным схемам иммунизации без излишнего экспериментирования.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения первое введение пневмококковой вакцины, как правило, производят, когда пациент имеет возраст более приблизительно 50 лет, более приблизительно 55 лет, более приблизительно 60 лет, более приблизительно 65 лет или более приблизительно 70 лет.

В некоторых вариантах осуществления изобретения используют одно введение вакцины. Возможно, что цели по настоящему изобретению могут быть достигнуты при использовании одного введения, особенно когда один или более используемых вакцинных полисахаридов и/или конъюгатов, или их сочетания, является/являются сильным(и), и в такой ситуации схема с введением одной дозы является достаточной для индукции долгосрочного защитного иммунного ответа.

В конкретных вариантах осуществления желательно вводить две или более доз вакцины для большей эффективности и охвата защитного иммунного ответа. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления число доз составляет по меньшей мере две, по меньшей мере три, или более доз. Максимальное число доз не определено, однако в клинической практике рекомендуется не проводить иммунизацию чаще, чем это необходимо для достижения желаемого эффекта.

Без связи с конкретной теорией, первую дозу вакцины, вводимой в соответствии с изобретением, можно считать «примирующей» дозой. В конкретных вариантах осуществления схема иммунизации включает более одной дозы. В такой ситуации последующую дозу можно считать «бустерной» дозой.

Примирующую дозу можно вводить не получавшему ранее лечение пациенту (пациенту, который никогда ранее не получал полисахаридную вакцину). В некоторых вариантах осуществления примирующую дозу можно вводить пациенту, который ранее получал полисахаридную вакцину по меньшей мере за пять или более лет до введения начальной дозы вакцины по изобретению. В других вариантах осуществления примирующую дозу можно вводить пациенту, который ранее получал конъюгатную вакцину по меньшей мере за двадцать или более лет до введения примирующей дозы вакцины по изобретению.

Если схема иммунизации требует введения двух или более отдельных доз, принимают решение об интервале между дозами. Интервал между двумя последовательными дозами может быть одним и тем же во всей схеме иммунизации или может быть изменен по мере увеличения возраста пациента. В схемах иммунизации по настоящему изобретению после введения первой дозы вакцины выдерживают первый интервал до введения следующей дозы. Первый интервал, как правило, составляет по меньшей мере приблизительно 2 недели, 1 месяц, 6 недель, 2 месяца, 3 месяца, 6 месяцев, 9 месяцев, 12 месяцев или более. Если впоследствии вводят более одной дозы, вторые (или более) интервалы могут быть выдержаны между такими последующими дозами. В некоторых вариантах осуществления все интервалы между последующими дозами имеют одинаковую продолжительность; в других вариантах осуществления вторые интервалы могут отличаться по продолжительности. В некоторых вариантах осуществления интервал между последующими дозами может составлять по меньшей мере приблизительно 12 месяцев, по меньшей мере приблизительно 15 месяцев, по меньшей мере приблизительно 18 месяцев, по меньшей мере приблизительно 21 месяц или по меньшей мере приблизительно 2 года. В конкретных вариантах осуществления интервал между дозами может составлять вплоть до 3 лет, вплоть до приблизительно 4 лет или вплоть до приблизительно 5 лет или 10 лет, или более. В конкретных вариантах осуществления интервалы между последующими дозами могут уменьшаться по мере увеличения возраста пациента.

Специалисты в данной области понимают, что можно использовать различные возможные комбинации и подкомбинации различных временных условий для первого введения, самого короткого интервала, самого длинного интервала и общего количества введений (в абсолютном выражении или в пределах указанного периода), и все такие комбинации и подкомбинации следует считать предусмотренными авторами изобретения, даже если они специально не перечислены в настоящем изобретении.

Анализы для определения иммуногенного ответа

В некоторых вариантах осуществления способ оценки иммуногенности и/или эффективности иммуногенного комплекса (и/или композиции, содержащей иммуногенный комплекс) включает оценку иммунного ответа на иммуногенную композицию. В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют путем проведения одного или более из серии in vitro анализов. В некоторых вариантах осуществления оцениваемый иммунный ответ представляет собой B-клеточный или T-клеточный ответ.

В некоторых вариантах осуществления in vitro анализ выбирают из одного или более из ELISA, проточной цитометрии, оценки Th1/Th17 клеточного ответа, измерения уровней цитокинов и функциональных уровней антител методами ОФУ, определения уничтожения бактерий в сыворотке (SBA), агглютинации, подвижности, цитотоксичности, адгезии, агглютинации.

В некоторых вариантах осуществления оценку осуществляют путем проведения одного или более из серии in vitro анализов. В некоторых вариантах осуществления для in vivo анализа используют животную модель внутрибольничного заболевания. В некоторых вариантах осуществления животная модель представляет собой модель одного или более из пневмонии, сепсиса, ожоговых ран, ЖК инфекции или инфекции операционного поля. В некоторых вариантах осуществления в in vivo анализе определяют одно или более из бактериального клиренса, колонизации или смертности, с пассивной защитой после заражения одним или более целевыми патогенами или активной защитой после заражения одним или более целевыми патогенами. В некоторых вариантах осуществления целевой патоген представляет собой внутрибольничный патоген.

В целом, может быть желательно оценивать гуморальные ответы, клеточные ответы и/или взаимодействие между ними. При оценке гуморальных ответов можно определять титры и/или типы антител (например, суммарные IgG, IgG1, IgG2, IgM, IgA и так далее) к конкретным серотипам патогена, например, до и/или после введения начальной или бустерной дозы вакцины (и/или в сравнении с уровнями антител в отсутствие антигенной стимуляции). Клеточные ответы можно оценивать путем мониторинга таких реакций, как гиперчувствительность замедленного типа, и так далее, на белок-носитель. Клеточные ответы также можно определять непосредственно путем оценки ответа моноцитов мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) на стимуляцию интересующими антигенами. Популяции B-клеточных предшественников и клеток памяти можно оценивать в клеточных иммуноферментных анализах (ELISpot) с использованием CPS и/или OPS конкретных патогенов.

Любой из множества анализов можно использовать для определения уровней и/или активности антител в сыворотке у пациента. Подходящие анализы включают, например, анализы связывания лиганда, такие как радиоиммунные анализы (РИА), ELISA и мультиплексные анализы (Luminex, Bioplex); функциональные анализы, анализы опсонофагоцитирующей активности (ОФА); а также in vivo анализы защиты (анализы защиты у новорожденных крыс и в моделях колонизации легких у взрослых мышей и ЖКТ у грызунов, а также смертности).

В РИА обнаруживают специфические для типа антитела путем инкубации сыворотки с радиоактивно мечеными специфическими для типа полисахаридами в суспензии (например, Schiffiman et al., 1980). Комплексы антиген-антитело затем осаждают сульфатом аммония, и радиоактивно меченые осадки анализируют, определяя число импульсов в минуту (имп/мин).

В методе обнаружения ELISA серотип-специфические антитела из сыворотки вакцинированных пациентов количественно определяют путем инкубации с серотип-специфическими полисахаридами, которые были адсорбированы на твердой подложке (например, Koskela and Leinonen (1981); Kojima et al., 1990; Concepcion and Frasch, 2001). Связанное антитело обнаруживают с использованием конъюгированных с ферментом вторичных обнаруживающих антител. ELISA также позволяет определять изотип и подкласс антител иммунного ответа (то есть, IgM против IgG или IgG1 против IgG2) с использованием специфических для изотипа или подкласса вторичных антител, и этот анализ может быть адаптирован для оценки авидности серотип-специфических антител (Anttila, et al., 1998; Romero-Steiner, et al., 2005). Мультиплексные анализы (например, Luminex, Bioplex) позволяют одновременно обнаруживать антитела к нескольким серотипам. Серотип-специфические CPS и/или OPS конъюгируют со спектрально отличающимися микросферами, которые смешивают и инкубируют с разбавленной сывороткой. Связанное антитело обнаруживают при помощи фикоэритрин-конъюгированного вторичного антитела, и количественно определяют в специализированном проточном цитометре, в котором используют один лазер для идентификации типа гранул (серотип) и второй лазер для количественного определения связанного вторичного антитела (Pickering, et al., 2002; Lal, et al. 2005).

Подходом для оценки функционального антитела в сыворотке является ОФА, который позволяет количественно определять только антитела, которые способны опсонизировать бактерии, что приводит к поглощению и уничтожению бактерий. В стандартном анализе используют человеческую фагоцитирующую эффекторную клетку, источник комплемента, бактерии и разбавленную сыворотку. Определяемым показателем анализа является конечный титр сыворотки, при котором имеет место ≥50% уничтожение, в сравнении с бактериями, инкубированными только с комплементом и человеческими клетками (Romero-Steiner, et al., 1997). Этот ОФА уничтожения также может быть мультиплексирован за счет использования целевых штаммов патогенов, которые несут различные маркеры устойчивости к антибиотику (Kim, et al., 2003). Конечный титр 1:8, или более, считают положительным результатом в этих ОФА на уничтожение. Другим типом мультиплексного анализа опсонофагоцитирующей активности является анализ без уничтожения, в котором поглощение фагоцитирующими эффекторными клетками флуоресцентно окрашенного инкапсулированного патогена или флуоресцентных микросфер, конъюгированных с антигенными CPS и/или OPS из целевого патогена в присутствии разбавленной сыворотки плюс источник комплемента оценивают методом ПЦ (Martinez, et al., 1999). Опсоническую активность сывороточного антитела плюс комплемент также можно оценивать путем измерения окислительного ответа фагоцитирующих человеческих эффекторных клеок на поглощенный патоген (Munro, et al. 1985; Ojo-Amaize, et al. 1995).

Некоторые in vivo модельные системы можно использовать для оценки защиты, обеспечиваемой сывороточными антителами, продуцирование которых вызвано вакцинами по настоящему изобретению. В таких системах пассивной защиты мышам или крысам вводят патоген с разбавленной сывороткой, и определяют конечный титр сыворотки, который обеспечивает защиту от бактериемии, колонизации органов или тканей, или смертности (Stack, et al. 1998; Saeland, et al. 2000).

Композиции антител

Некоторые варианты осуществления относятся к композиции антител, содержащей антитела, выработанные в организме млекопитающего, иммунизированного иммуногенным комплексом по изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитело включает по меньшей мере одно антитело, выбранное из группы, состоящей из мАт и антиидиотипических антител. В некоторых вариантах осуществления композиция антител содержит выделенную фракцию гамма-глобулина.

Наборы

Настоящее изобретение также относится к наборам для получения иммуногенного комплекса, описанного в настоящем изобретении, которые позволяют исследователю создавать иммуногенный комплекс с предпочтительными антигенами, например, в исследовательских целях для оценки эффекта антигена, или сочетания антигенов, на иммунный ответ. Такие наборы можно готовить из легко доступных материалов и реагентов. Например, такие наборы могут включать любые один или более из следующих материалов: контейнер, содержащий каркасный полимер, сшитый с множеством первых аффинных молекул; и контейнер, содержащий комплементарную аффинную молекулу, которая связывается с первой аффинной молекулой, при этом комплементарная аффинная молекула связывается с антигеном.

В другом варианте осуществления набор может включать контейнер, содержащий полимер, например, полисахарид, контейнер, содержащий множество первых аффинных молекул, и контейнер, содержащий сшивающий реагент для сшивания первых аффинных молекул с каркасным полимером.

В некоторых вариантах осуществления набор также включает средства для присоединения комплементарной аффинной молекулы к антигену, при этом присоединение может происходить при помощи сшивающего реагента или при помощи какого-либо промежуточного слитого белка. В некоторых вариантах осуществления набор может включать по меньшей мере один костимулирующий фактор, который может быть добавлен к полимеру. В некоторых вариантах осуществления набор включает сшивающий реагент, например, но без ограничения, CDAP (1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторборат), EDC (1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимида гидрохлорид), цианоборогидрид натрия; цианоген бромид; бикарбонат аммония/иодуксусная кислота, для связывания кофактора с полимером.

Различные наборы и компоненты могут быть созданы для использования в способах, описанных в настоящем изобретении, в зависимости от запланированного применения набора, конкретного целевого антигена и потребностей пользователя.

ПРИМЕРЫ

Для более полного понимания изобретения, описанного в настоящем изобретении, приведены следующие примеры. Репрезентативные примеры включают информацию, пояснение на примере и руководство, которое можно адаптировать для осуществления на практике настоящего изобретения в его различных вариантах осуществления и его эквивалентах. Следует понимать, что данные примеры предназначены исключительно для иллюстративных целей и не должны восприниматься, как ограничивающие настоящее изобретения каким-либо образом.

Пример 1: Бактериальные штаммы

Штаммы-реагенты пересевали три раза на среде, не содержащей продукты животного происхождения, для удаления любых возможных примесей продуктов животного происхождения. Характеристики штаммов сравнивали перед пересевом, в процессе пересева и после пересева. Для Pseudomonas: окрашивание по Граму, морфология колоний, АФС, оксидазный тест, рост на агаре Мак-Конки, серотипирование IATS, кинетика роста. Для Klebsiella: окрашивание по Граму, морфология колоний, АФС, молекулярное серотипирование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), подтверждение мутаций методом ПЦР и секвенирования (по мере необходимости), K-типирование (методом ПЦР), кинетика роста.

Таблица 2: Штаммы Klebsiella и штаммы-реагенты, используемые в исследовании

Вид	Штаммы	O-тип	K-тип	Штамм-реагент^a
K. pneumoniae	B5055	1	2	ΔguaBA Δwzabc
K. pneumoniae	7380	2	Без капсулы	Дикого типа
K. pneumoniae	390	3	11	Дикого типа
K. pneumoniae	4425/51	5	57	Δwzabc
K. oxytoca	160011	1	19	Дикого типа^b
^aΔguaBA=мутант по биосинтезу гуанина (аттенуированный); Δwzabc=мутант по капсуле ^bKlebsiella oxytoca

Гены guaBA и wzabc были делетированы с использованием Red-рекомбинации лямбда. Вкратце, проводили слияние ДНК выше и ниже генов guaBA и wzabc с кассетой устойчивости к канамицину, и линейную ДНК вводили трансформацией в штаммы K. pneumoniae, которые также содержали хелперную плазмиду, способную экспрессировать гены рекомбиназы фага лямбда. После индукции эти гены стимулируют гомологичную рекомбинацию, которая позволяет заменять гены guaBA и wzabc кассетой устойчивости к канамицину. Кассету устойчивости к канамицину впоследствии удаляли с использованием фермента флиппазы, который стимулирует рекомбинацию между сайтами FRT, фланкирующими кассету. Было подтверждено, что мутанты являются чувствительными к канамицину, и делеция была подтверждена методом ПЦР и секвенированием делеции.

Таблица 3: Штаммы Pseudomonas aeruginosa (PA), используемые в исследовании

Реагент	Штаммы	Конечный штамм-реагент
O1	IATS-O1	Дикого типа
O2	IATS-O2	Дикого типа
O3	IATS-O3	Дикого типа
O4	IATS-O4	Дикого типа
O5	IATS-O5	Дикого типа
O6	IATS-O6	Дикого типа
O10	IATS-O10	Дикого типа
O11	IATS-O11	Дикого типа

Создание штамма PA, избыточно продуцирующего экзополисахарид PsL

Иллюстративные генетические подходы к реконструкции восприимчивого к индукции PsL штамма P. aeruginosa PAO1 Δpsl/pBAD-psl с использованием 1886-п.н. синтетической ДНК от компании Genscript, Piscataway, NJ, представлены на Фигуре 9B.

Промотор araC-pBAD вводили выше гена pslA P. aeruginosa PAO1 путем гомологичной рекомбинации. Фактически, ДНК выше pslA амплифицировали из P. aeruginosa PAO1 и лигировали выше кассеты устойчивости к гентамицину. Конструкт, состоящий из синтетической ДНК, содержащей промотор araC-pBAD и ген pslA, лигировали ниже кассеты устойчивости к гентамицину. Весь этот конструкт вставляли в плазмиду pEX100T для мутагенеза Pseudomonas. Мутагенез выполняли, как описано ранее (Schweizer et al., 1992). Ген устойчивости к гентамицину впоследствии удаляли, и вставку промотора araC-pBAD подтверждали методом ПЦР и секвенирования.

Пример 2: Получение O- и K-полисахаридных антигенов

Выращивание штаммов Klebsiella spp. и P. aeruginosa

Все штаммы-реагенты Klebsiella и PA пересевали три раза на среде, не содержащей продукты животного происхождения, для удаления любых возможных примесей продуктов животного происхождения. Исследовательские банки клеток (ИБК) выращивали во встряхиваемых колбах в бульоне Hy-Soy^® и асептически переносили аликвотами во флаконы с глицерином в конечной концентрации 15%. Бактерии выращивали в 8-л ферментере BioFlo 415 в среде с определенным химическим составом (CDM), содержащей одноосновный фосфат калия, фосфат аммония, лимонную кислоту, моногидрат, сульфат магния (MgSO₄), полипропиленгликоль (ППГ) (пеногаситель), 3% глицерин в качестве источника углерода, витамины и микроэлементы, а также отдельные аминокислоты, по мере необходимости. Растворенный кислород поддерживали на уровне 30% с каскадным режимом, установленным на минимальную скорость перемешивания 200 об/мин, и pH доводили до 7 гидроксидом аммония. В процессе ферментации в среду добавляли в порционном режиме, по мере необходимости, 50% глицерин, MgSO₄, следовые количества витаминов и микроэлементы. Бактерии выращивали в течение 12-18 ч до стационарной фазы, после чего культуры клеток собирали для получения полисахарида.

Очистка O-полисахарида KP и корового O-полисахарида PA

Схема последовательности операций последующего процесса очистки OPS из KP и PA представлена на Фигуре 8A. Вкратце, после завершения ферментации всю ферментационную культуру обрабатывали либо 1% уксусной кислотой при 100°C в течение 4 ч в случае клеточной культуры P. aeruginosa, либо нитритом натрия в уксусной кислоте при 4°C в случае клеточной культуры K. Pneumoniae, в течение 12 ч. После осветления методом центрифугирования и глубинной фильтрации (0,45-мкм) осветленный раствор, содержащий гидролизованный и высвобожденный OPS, подвергали проточной фильтрации вдоль потока (TFF) УФ-ДФ с 10 кДа или 30 кДа NMWCO мембраной, проводя диафильтрацию против 1M NaCl, а затем Tris-буфера. Ретентат затем пропускали через сильную анионообменную мембрану для проведения ионообменной хроматографии (ИОХ) в Tris-буфере. Отрицательно заряженные PA OPS были захвачены на мембране (Фигура 8A), а затем элюированы хлоридом натрия. Нейтральные KP OPS и нейтральные или слабокислые PA OPS получали в проточной фазе (ПФ) через ИОХ мембрану. Проточную фазу или элюат после ИОХ затем осаждали сульфатом аммония для удаления остаточного белка. KP OPS в супернатанте сульфата аммония затем подвергали двум последовательным TFF фильтрациям, начиная с 300 кДа NMWCO мембраны, после которой ПФ концентрировали и проводили диафильтрацию с использованием 5 или 10 кДа NMWCO мембраны. Ретентат этой более поздней ПФ TFF содержал очищенные нейтральные KP OPS (Фигура 8A). Очищенные нейтральные и кислые PA OPS в супернатанте сульфата аммония (NH₄SO₄) подвергали TFF с 5-10 кДа мембраной (Фигура 8A), после которой они находились в ретентате. Конечный продукт OPS имел среднюю ММ при измерении методом ЭХ-многоуглового рассеяния лазерного излучения (ЭХ-MALLS) в диапазоне 10-30 кДа в зависимости от O-типа, и имел низкое содержание эндотоксина, белка и нуклеиновых кислот.

Очистка капсульного полисахарида Klebsiella oxytoca K19 (KP K19 CPS)

Иллюстративная схема последовательности операций последующего процесса очистки KP K19 CPS представлена на Фигуре 9A. Вкратце, после инактивации формальдегидом и осветления методом прерывистого центрифугирования и поверхностной фильтрации (0,45-мкм) осветленный раствор, содержащий CPS, концентрировали и проводили диафильтрацию методом TFF с 30 кДа NMWCO мембраной. 30-кДа ретентат осаждали CTAB. Осадок повторно растворяли хлоридом кальция и осаждали 20% этанолом для удаления примесей нуклеиновых кислот и белка. После центрифугирования собранный супернатант осаждали 80% этанолом. Содержащий CPS осадок повторно растворяли в Tris-буфере и захватывали на слабой анионообменной смоле. K19 CPS, элюированный со смолы, дополнительно обрабатывали (обезвреживали) 0,1 M NaOH в 90% этаноле для удаления любого остаточного концевого липида, участвующего в его агрегации, и эндотоксина (что определяли по активности лизата амебоцитов мечехвоста (LAL)) (Фигура 9A). Конечный полисахаридный продукт K19 имел среднюю ММ 220 кДа при измерении методом ЭХ-MALLS, и имел низкое содержание эндотоксина, белка и нуклеиновых кислот.

Очистка экзополисахарида PsL PA

Схема последовательности операций последующего процесса очистки экзополисахарида PsL представлена на Фигуре 9C. Вкратце, бактериальную культуру PA осветляли центрифугированием при 10000 x g в течение 40 минут при RT, и супернатант фильтровали через 0,5-0,3-мкм глубинный фильтр. Фильтрованный супернатант подвергали диафильтрации TFF с использованием 100 кДа MWCO PES мембраны с 10 диаобъемами воды для инъекций (WFI), пермеат собирали и концентрировали с использованием 2 кДа мембраны Hydrosart 10-20x УФ, проводили диафильтрацию с 10 диаобъемами 50 мМ Tris HCl, 50 мМ NaCl, pH 7,5. Концентрированный элюат затем подвергали хроматографии на сильной анионообменной смоле (IEX), используя GE Q-Sepharose Fast Flow, и проточную фазу собирали, промывая еще одним объемом колонки элюэнта. Элюат концентрировали и подвергали диафильтрации с WFI, используя 2 кДа мембрану Hydrosart, а затем осаждали 80% этанолом при RT в течение 18 ч. После центрифугирования при 4000 x g в течение 30 мин осадок растворяли в WFI, стерилизовали фильтрованием через 0,2-мкм фильтр и лиофилизировали. Конечный очищенный полисахаридный материал анализировали методом HPAEC/PAD (высокоэффективной аниононообменной хроматографии с импульсным электрохимическим детектированием), используя капиллярный прибор Dionex ICS-4000 и колонку CarboPac PA10, а также коммерчески доступные стандарты моносахаридов, для определения моносахаридного состава, остаточный белок определяли методом Бредфорд, остаточные нуклеиновые кислоты определяли при помощи набора Q-bit Life Technologies quant-IT kit, эндотоксин определяли в анализе LAL, и общее содержание углеводов определяли в анализе с антроновым реактивом. Конечный материал также анализировали методом H-ЯМР с высоким разрешением для подтверждения его структуры и методом ЭХ-ВЭЖХ для оценки молекулярной массы.

Аналитические методы определения характеристик O- и K-антигенов

Чистоту и природу OPS и CPS, полученных методами, описанными выше, определяли следующим образом. Концентрацию остаточного белка определяли методом Бредфорд и/или BCA; концентрацию нуклеиновых кислот определяли в анализе с пико зеленым или на основании поглощения при 260 нм; уровни эндотоксина определяли с использованием анализа LAL; и сахарный состав полисахаридов определяли методом кислотного гидролиза с последующим разделением отдельных моносахаридов методом HPAEC-PAD (Dionex), как описано выше. Физическую целостность полисахаридов определяли методом 1H-ЯМР с высоким разрешением при 500, 800 или 950 МГц с использованием спектрофотометра Bruker для записи спектров и сравнения полученных спектров со спектрами, опубликованными в литературе. Природу полисахаридов и целостность эпитопов на очищенных нативных и химически дериватизированных полисахаридах в процессе и в конечных продуктах подтверждали методом ELISA с использованием специфических моноклональных антител к OPS и CPS, а также поликлональной кроличьей иммунной сыворотки против убитых нагреванием характерных для типа бактерий. Присутствие O-ацетильных групп на полисахаридах определяли в колориметрическом анализе Хестрина и методом 1H-ЯМР. Размер полисахаридов определяли методом ЭХ-ВЭЖХ (Фигуры 8B и 8C) и ЭХ-MALLS, используя колонки соответствующего размера. Концентрацию полисахаридов определяли в анализе с антроновым реактивом.

Пример 3: Общий способ биотинилирования OPS и CPS

Биотинилирование полисахаридов (PS), содержащих гидроксильные группы, осуществляли с использованием CDAP в качестве активирующего реагента. Полисахариды растворяли в не содержащей LPS воде (категории «для клеточных культур»; HyClone) до конечной концентрации 1-5 мг/мл. В момент времени 0 некоторый объем CDAP (свежеприготовленного в концентрации 100 мг/мл в ацетонитриле) добавляли в конечном соотношении 1 мг CDAP на 1 мг PS при перемешивании на вихревой мешалке. Через 30 с добавляли некоторый объем 0,2 M триэтиламина (TEA; Sigma-Aldrich) для повышения pH до 8 (в случае нейтральных PS объем TEA равен объему CDAP; в случае кислых PS объем TEA удвоен). Через 2,5 мин некоторый объем производного биотина (Pierce EZ-Link амин-ПЭГ3-биотин, 20 мг/мл в воде) добавляли до конечного соотношения 1 мг биотина на 1 мг PS, с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1-4 ч. Для более разбавленных образцов (<1 мг/мл) использовали инкубацию в течение ночи. Реакцию останавливали добавлением 25 мМ глицина, и избыток биотина удаляли путем интенсивного диализа против PBS.

В случае каркасного полимера BP-1.2 биотинилирование полимера K19 CPS продолжали путем активации карбоксилатных групп остатков уроновой кислоты 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимид гидрохлоридом (EDC, Pierce) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) для повышения эффективности или создания стабильных сухих (аминореактивных) промежуточных соединений. EDC соединяет NHS с карбоксилами, с получением NHS сложного эфира, который значительно более стабилен, чем промежуточное соединение O-ацилизомочевины, при этом допуская эффективную конъюгацию с первичными аминами при физиологических значениях pH. Амино-производное биотина (Pierce EZ-Link амин-ПЭГ3-биотин) затем использовали для биотинилирования NHS сложноэфирных промежуточных соединений K19 CPS.

Общую концентрацию сахара определяли либо в анализе с антроновым реактивом в случае OPS/CPS Klebsiella, либо в анализе с резорцинолом в случае PA OPS.

Пример 4: Конструирование антигенов рекомбинантного ризавидина и слитого белка ризавидина

Дизайн и конструирование экспрессионных конструктов слитых белков ризавидина из K. pneumoniae и P. aeruginosa

В случае флагеллинов Pseudomonas (FliC) A (FlaA) и B (FlaB), in silico конструкция жгутикового волокна на основе упаковки FliC Pseudomonas в кристалле указывает на то, что домен 2 (D2) был бы экспонирован в раствор и мог бы играть важную роль в иммуногенности (Song, 2014). Кроме того, FliC Pseudomonas активирует врожденные иммунные реакции за счет его узнавания TLR5, что, вероятно, приводит к реакционной способности, вследствие этого, авторы изобретения создали и оценили некоторые из флагеллинов Pseudomonas, в которых были удалены TLR5-связывающий домен и прилегающие области, и оставлен лишь домен 2. Полученные последовательности FlaA2-Домен2 и FlaB-Домен2, лишенные TLR5-связывающего домена, были экспрессированы либо в виде слитого белка только с ризавидином, либо с ризавидином и MrkA или PcrV Klebsiella. Схематическое изображение созданных и экспрессированных вариантов слитых белков ризавидин-антиген, полученных из Pseudomonas (FlaB; FlaA1; FlaA2; PcrV; FlaB-PcrV; FlaB-D2; FlaA2-D2; FlaB-D2-PcrV), и гибридных слитых белков ризавидина, полученных как из Klebsiella, так и из Pseudomonas (FlaB-D2-MrkA; PcrV-MrkA), представлены на Фигуре 12A.

В случае P. aeruginosa, флагеллин был выбран в качестве вероятного белка-носителя и защитного антигена, поскольку он является основным компонентом жгутиков; кроме того, как известно, антитела к флагеллину ингибируют подвижность, необходимую для диссеминированный инфекции, и, как было показано, оказывают защитное действие в животной модели инфекции. В случае флагеллина, серотип A2 является высоко консервативным, однако слегка отличается от A1 и значительно по домену 2 от серотипа B. Для оценки активности этих вариантов флагеллины серотипов A1 (FlaA1), A2 (FlaA2) и B (FlaB) клонировали и экспрессировали в виде полноразмерных белков. Домен 2 только из флагеллинов A2 и B также клонировали и экспрессировали, поскольку этот домен находится на поверхности собранных жгутиков и, вероятно, является мишенью для нейтрализующих антител. Это позволило отдельно оценить вклад TLR5-связывающего домена для адаптивного иммунного ответа. Выбранные последовательности были синтезированы и клонированы в плазмиды для прямой экспрессии в E. coli с амино-концевым слитым белком ризавидина и меткой из шести остатков гистидина для начальной аффинной очистки (Фигура 12A).

В случае P. aeruginosa, PcrV также был выбран, поскольку он кодирует концевой белок секреторного аппарата III типа. Он также известен в качестве защитного антигена, поскольку антитела, специфические для PcrV, способны защищать против инвазивной инфекции. Последовательность является высоко консервативной, в ней аминокислотные изменения имеют место лишь в 4 положениях из 294 аминокислот в 18 разных штаммах P. aeruginosa. Последовательность была синтезирована и клонирована в плазмиду для прямой экспрессии в E. coli с амино-концевым слитым белком ризавидина и меткой из шести остатков гистидина для начальной аффинной очистки (Фигура 12A).

В случае K. pneumoniae, был выбран MrkA, поскольку он кодирует основную фимбриальную субъединицу пилей 3 типа и иммунологически доминантную часть фимбрий. Фимбрии 3 типа необходимы для образования биопленок, и MrkA играет основную роль в образовании биопленок и адгезии, это свидетельствует о том, что данный антиген может обеспечивать защиту в вакцинной композиции. Установлено, что MrkA является высоко консервативным в 9 разных генотипах K. pneumoniae, с аминокислотным изменением лишь в 1 положении среди 180 аминокислот. В одном дополнительном генотипе имеет место несколько более высокое число изменений, в 9 положениях среди 180 аминокислот (Таблица 4). Для других фимбриальных субъединиц пилей 3 типа была разработана стратегия для стабилизации мономера в процессе экспрессии, называемая методом комплементации донорской цепи (Walczak, 2014). Согласно данной стратегии аминоконцевую последовательность повторяют на карбоксильном конце, так что последовательность может складываться назад и связываться в ориентации бета-цепи, обычно обеспечиваемой соседней субъединицей в структуре. Авторы изобретения попытались применить эту стратегию к субъединице MrkA пилей 3 типа K. Pneumoniae, удаляя сначала сигнальную последовательность секреции, поскольку они планировали сконцентрироваться на цитоплазматической экспрессии их слитых белков с ризавидином. Модель Ленгмюра для предполагаемого сигнала секреции приведена в публикации Chan et al. 2012, на основании выравнивания с аминокислотами 1-24 FimA E. coli. Авторы изобретения затем добавили линкер из шести остатков глицина к карбоксильному концу, с последующим повтором первых 20 аминокислот из N-конца MrkA (без сигнальной последовательности) для обеспечения комплементации донорской цепи. Последовательность была синтезирована и клонирована в плазмиду для управления экспрессией в E. coli, с амино-концевым слитым белком ризавидина и меткой из шести остатков гистидина для начальной аффинной очистки (Фигура 12A).

Таблица 4: Множественное выравнивание последовательностей MrkA K. pneumoniae с использованием Clustal 0 (1.2.1)

Для белка MrkA K. pneumoniae, который является высоко консервативным, последовательность AEO27492 (выделена жирным шрифтом) в Таблице 4 использовали в качестве исходной последовательности для создания синтетического гена.

Рекомбинантный ризавидин (rRhavi), используемый в этих исследованиях, включает аминокислоты 45-179 белка, закодированного в геноме, поскольку предсказанные сигнальные последовательности (аминокислоты 1-44) не включены. Для оптимизации уровня экспрессии rRhavi в E. coli последовательность гена, кодирующего полипептид ризавидина (45-179; SEQ ID NO: 14), модифицировали с использованием кодонов, предпочтительных для экспрессии в E. coli, и синтезировали. Кодон-оптимизированный ген клонировали в вектор pET21b для управления экспрессией белка. С целью облегчения правильного сворачивания и образования дисульфидных связей в ризавидине, для экспрессии выбирали штамм E. coli, который способствует образованию дисульфидных связей в цитоплазме, T7 SHuffle express (NEB).

Для конструирования слитых белков ризавидин-антиген последовательность ДНК, кодирующую область гибкого линкера, состоящего из семи аминокислот (GGGGSSS; SEQ ID NO: 15), непосредственно вставляли в 3'-конец синтетического гена rRhavi для обеспечения отделения от rRhavi и стимуляции правильного сворачивания образующегося слитого белка. Гены, кодирующие антигены-кандидаты (полноразмерные или нужные фрагменты), синтезировали и вставляли в экспрессионный вектор rRhavi сразу за областью линкера. Для облегчения очистки на конце конструкта добавляли метку из шести остатков гистидина.

Содержащие ДНК плазмиды, управляющие экспрессией слитых белков rRhavi, вводили трансформацией в T7 shuffle express E. coli в соответствии с инструкциями производителя. Культивирование начинали с одной колонии, которую инокулировали в 30 мл среды Луриа-Бертани (LB), содержащей ампициллин (Amp+), и культивировали в течение ночи при 30°C. В день 2, 5 мл исходной культуры инокулировали в 1 литр среды LB/Amp+ и выращивали при 30°C до достижения OD₆₀₀ ~1,2-1,6. После охлаждения культуры до 16°C добавляли IPTG до конечной концентрации 0,1 мМ. Индуцированную культуру инкубировали при 16°C со встряхиванием в течение 16-20 ч. Бактерии собирали центрифугированием при 5000 x g в течение 20 мин, и осадок замораживали при -20°C.

Иллюстративные слитые белки

Иллюстративные слитые белки ризавидина по настоящему изобретению приведены в следующем далее списке последовательностей. Для удобства аминокислотные последовательности слитых белков в однобуквенном коде приведены далее:

Rhavi-PcrV-His, SEQ ID NO: 16

MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH

Rhavi-MrkA-комплементация донорской цепи-His, SEQ ID NO: 17

Rhavi-FlaA1-His, SEQ ID NO: 18

Rhavi-FlaA2-His, SEQ ID NO: 19

Rhavi-FlaB-His, SEQ ID NO: 20

Rhavi-FlaB-Домен2-His, SEQ ID NO: 21

Rhavi-FlaA2-Домен2-His, SEQ ID NO: 22

MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMNGTYFTATGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFTDGAQISYVSKASADGTTSAVSGVAITDTGSTGAGTAAGTTTFTEANDTGSGHHHHHH

Rhavi-FlaB-PcrV-His, SEQ ID NO: 23

MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMALTVNTNIASLNTQRNLNASSNDLNTSLQRLTTGYRINSAKDDAAGLQISNRLSNQISGLNVATRNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRIRDLALQSANGSNSDADRAALQKEVAAQQAELTRISDTTTFGGRKLLDGSFGTTSFQVGSNAYETIDISLQNASASAIGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSVASVDISTADGAQNAIAVVDNALAAIDAQRADLGAVQNRFKNTIDNLTNISENATNARSRIKDTDFAAETAALSKNQVLQQAGTAILAQANQLPQAVLSLLRAAAAMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH

Rhavi-FlaB-Домен2-MrkA-комплементация донорской цепи-His, SEQ ID NO: 24

MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSAAAAMADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVSGSGHHHHHH

Rhavi-MrkA-комплементация донорской цепи-PcrV-His, SEQ ID NO: 25

MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVSAAAAMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH

Rhavi-FlaB-Домен2-PcrV-His, SEQ ID NO: 26

MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSAAAAMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH

Очистка слитых белков

Очистку начинали с ресуспендирования бактериальных осадков в 4 мл охлажденного 20 мМ Tris, pH 8,0, содержащего 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, 10 мМ MgCl₂ и 2X коктейль ингибиторов протеаз Halt (Thermo Fisher), на грамм клеточного осадка. Бактерии разрушали обработкой ультразвуком, с последующим добавлением ДНКазы I до конечной концентрации 25 мкг/мл. Нерастворимый детрит удаляли центрифугированием при 5000 x g в течение 20 мин. Осветленный лизат разбавляли эквивалентным объемом 20 мМ Tris, pH 8,0, содержащего 500 мМ NaCl, для доведения конечной концентрации буфера до 20 мМ Tris, 500 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 5 мМ MgCl₂ и 1x коктейль ингибиторов протеаз. Белки очищали путем связывания с никелевой аффинной смолой, промывали 20 мМ Tris, содержащим 500 мМ NaCl, 20 мМ имидазол, и элюировали связанный белок 20 мМ Tris, содержащим 500 мМ NaCl, 500 мМ имидазол. Фракции, соответствующие пикам элюции ожидаемого димера целевого белка, объединяли и концентрировали. Белки, элюируемые с этих колонок, дополнительно очищали гель-фильтрацией и/или ЭХ. Затем эти белки анализировали методом SDS-ПААГ, вестерн-блоттинга и ЭХ. Все слитые белки мигрировали в SDS-ПААГ в соответствии с ожидаемой ММ. Концентрацию белка в каждом образце измеряли с использованием набора для анализа белка BCA (BioRad). Очищенные белки разделяли на аликвоты, быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до будущего использования.

Краткая сводка физических характеристик иллюстративных слитых белков ризавидина и вариантов по изобретению приведена в Таблице 5. Все слитые белки ризавидина по изобретению были экспрессированы и, как показано, представляли собой димерные белки на основании результатов эксклюзионной хроматографии (ЭХ) (Таблица 5).

Таблица 5: Физические характеристики экспрессированных в E. coli слитых белков ризавидина по изобретению

Белок	Бактерии	ММ мономера (кДа)	Наличие димера, ЭХ	Наличие TLR5-связывающего домена
Rhavi-PcrV-his	P. aeruginosa	48	Да	Н/П
Rhavi-FlaB-his	P. aeruginosa	65	Да	Да
Rhavi-FlaA1-his	P. aeruginosa	56	Да	Да
Rhavi-FlaA2-his	P. aeruginosa	55	Да	Да
Rhavi-MrkA-his	K. pneumoniae	37	Да	Н/П
Rhavi-FlaBD2-his	P. aeruginosa	37	Да	Нет
Rhavi-FlaA2D2-his	P. aeruginosa	27	Да	Нет
Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	P. aeruginosa K. pneumoniae	58	Да	Нет
Rhavi-FlaB-PcrV-his	P. aeruginosa	97	Да	Да
Rhavi-PcrV-MrkA-his	P. aeruginosa K. pneumoniae	69	Да	Н/П
Rhavi-FlaBD2-PcrV-his	P. aeruginosa	70	Да	Нет

Оценка активности в отношении TLR5 слитых белков флагеллина

Для оценки правильности укладки слитых белков клетки HEK293-NFkB: Luc стимулировали путем инкубации в течение 4 часов с титрованным каждым из тестируемых белков, или комплексов, как показано на Фигуре 12B. Клетки HEK293-NFkB: Luc, как было описано ранее, отвечают на флагеллин, но не на LPS или Salmonella без жгутиков (Simon and Samuel, 2007). После лизиса клеток определяли люциферазную активность при помощи люциферазы светляков от компании Promega. В анализе измеряют активацию NF-kB (Simon and Samuel, 2007).

Результаты определения биологической активности в отношении TLR5 в анализе с использованием клеток HEK293-NFkB: Luc, а также нативных флагеллинов Pseudomonas и слитых белков Rhavi, отдельно или в виде комплекса MAPS с PnPS 6B, представлены на Фигуре 12B. Эти результаты четко показывают, что конструкты ризавидина и флагеллина FlaB, FlaA1, FlaA2 стимулировали активность TLR5 сами по себе или в виде комплекса MAPS с PnPS 6B и, следовательно, имели правильную укладку.

Иммуногенность иллюстративных слитых белков

Были получены сыворотки с высокими титрами к вариантам слитых белков для оценки in vitro активности белок-специфических антител. Определенные методом ELISA титры IgG к соответствующему иммуногену для каждого из следующих слитых белков (СБ): Rhavi-FlaB-D2; Rhavi-FlaA2-D2; Rhavi-FlaB-PcrV; Rhavi-FlaB-D2-MrkA и Rhavi-PcrV-MrkA представлены на Фигуре 14. Все СБ являются очень иммуногенными и вызывают продуцирование СБ-специфических IgG антител с высокими титрами.

Результаты определения перекрестной реактивности для FlaB и FlaA1 кроличьей сыворотки, полученной против FlaB-содержащих слитых белков ризавидина, приведены в Таблице 6.

Таблица 6: Перекрестная реактивность сыворотки от кроликов, иммунизированных FlaB-содержащими слитыми белками ризавидина, для нативного FlaB, очищенного из PA PAO1, или FlaA1, очищенного из PA PAK

	Кролик №	FlaA1 ELISA	FlaB ELISA
P0	P2	P3	P0	P2	P3
Rhavi-FlaB-D2-His	AFV791	121	356	744	22	344903	279209
Rhavi-FlaB-D2-His	AFV792	397	442	627	309	126159	154104
AFV793	162	379	763	155	434194	423514
Rhavi-FlaB-PcrV-His	AFV797	263	23995	31,497	278	317789	318117
Rhavi-FlaB-PcrV-His	AFV798	126	38872	40,911	128	250535	230702
AFV799	178	27108	41,566	139	299454	499941
Rhavi-FlaB-D2-MrkA-His	AFV800	213	217	1916	45	17602	35651
Rhavi-FlaB-D2-MrkA-His	AFV801	54	165	944	48	21320	53477
AFV802	440	161	291	298	24500	34790

Как анти-Rhavi-FlaB-D2, так и анти-Rhavi-FlaB-PcrV, кроличьи сыворотки имели высокие титры FlaB-специфического антитела, однако анти-Rhavi-FlaB-D2-MrkA сыворотки имели сравнительно низкие титры FlaB-специфического антитела. Анти-Rhavi-FlaB-PcrV сыворотки имели значительную перекрестную реактивность FlaA1-специфического антитела, это свидетельствовало о том, что компонент FlaB слитого белка имеет правильную укладку, и что перекрестно реактивные эпитопы FlaA1 предположительно находятся за пределами домена 2 флагеллина, в общих консервативных доменах D0 и D1 (Song and Yoon, 2014), которые не экспрессируются ни в Rhavi-FlaB-D2, ни в FlaB-D2-MrkA. Таким образом, вследствие его значительной перекрестной реактивности с FlaA1, Rhavi-FlaB-PcrV является превосходным слитым белком-кандидатом, который может обеспечивать широкий основанный на флагеллине иммунитет против инфекции Pseudomonas.

Пример 5: Получение иммуногенных комплексов

Получение каркасных полимеров из нативного OPS

Нативные OPS

O-полисахариды (OPS) K. pneumoniae (KP OPS) серотипов O1, O2, O3 и O5 и коровый OPS P. aeruginosa (PA OPS) серотипов O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 выделяли из ферментационной биомассы микроорганизмов, выращенных в CDM, после обработки либо кипячением при 100°C в однопроцентной уксусной кислоте в случае PA OPS, или либо уксусной кислотой и нитритом натрия (NaNO₂) в случае KP OPS. В случае PA LPS, обработка уксусной кислотой приводит к расщеплению связи KDO внутреннего ядра LPS и липида A (Фигура 1A) и получению фрагмента KDO на восстанавливающем конце COPS. В случае KP LPS, дезаминирование азотистой кислотой приводит к расщеплению связи между остатком глюкозамина внутреннего ядра и остальной частью липида A внутреннего ядра LPS и получению восстанавливающего остатка 2,5-ангидроманнозы с альдегидом на атоме углерода 1 (Фигура 1C). Структуры PA OPS (Knirel et al., 2006) и KP OPS (Vinogradov et al., 2002) представлены на Фигурах 1B и 1D, соответственно. Процесс последующей очистки PA и KP OPS показан на Фигуре 8A. Эти методы очистки приводят к получению высоких количеств (>50-100 мг/л очищенного материала) высокочистого OPS с низкими уровнями остаточного белка, нуклеиновых кислот и эндотоксина. Химическую и иммунохимическую природу ОПС подтверждали методами деполимеризации ТФУ и Dionex HPAEC-PAD, сравнением ЯМР-спектров, полученных методом 1H-ЯМР с высоким разрешением (химические связи и константы взаимодействия), с данными, опубликованными в литературе, и определением методом ELISA иммунологической реактивности со специфическими для типов KP OPS и PA OPS моноклональными антителами или иммунной сывороткой, полученной при иммунизации убитыми нагреванием целыми бактериями (Фигура 6C). Средняя ММ OPS при измерении методом ЭХ и ЭХ-MALLS находилась в диапазоне приблизительно от 10 кДа до 30 кДа, в зависимости от типа, при этом PA OPS, как правило, имеет больший размер, чем KP OPS. Совокупные результаты анализа HPAEC-PAD (Dionex) моносахаридного состава очищенных KP OPS и PA OPS приведены в Таблице 7.

Таблица 7. Анализ методом HPAEC-PAD моносахаридного состава очищенных KP OPS и PA COPS

Бактерии	O-полисахарид	HPAEC-PAD анализ моносахаридов^a	Ожидаемый состав повтора OPS^b
K. pneumoniae	O1	Галактоза	Галактоза
K. pneumoniae	O2a	Галактоза	Галактоза
K. pneumoniae	O3	Манноза	Манноза
K. pneumoniae	O5	Манноза	Манноза
P. aeruginosa	IATS O1	Фукозамин, Квиновозамин, Галактозамин	NAc-фукозамин, NAc-галактозамин, NAc-квиновозамин, 2,3-диамино-2,3-дидезокси-NAc-глюкуроновая кислота
P. aeruginosa	IATS O2	Фукозамин	2,3-диамино-2,3-дидезокси-NAc-маннуроновая кислота, 2,3-диамино-2,3-дидезокси-NAc-глюкуроновая кислота, NAc-фукозамин
P. aeruginosa	IATS O3	Рамноза, Глюкозамин	Рамноза, NAc-глюкозамин, NAc-галактуроновая кислота,
P. aeruginosa	IATS O4	Фукозамин, Квиновозамин, Рамноза	NAc-фукозамин, Рамноза, NAc-квиновозамин
P. aeruginosa	IATS O5	Фукозамин	NAc-NAc-маннуроновая кислота, NAc-NAm-маннуроновая кислота, NAc-фукозамин
P. aeruginosa	IATS O6	Квиновозамин, Рамноза^c	Рамноза, NAc-Ac-галактуроновая кислота, Nfo-галактуроновая кислота, NAc-квиновозамин
P. aeruginosa	IATS O10	Квиновозамин, Рамноза	Ac-рамноза, NAc-галактуроновая кислота, NAc-квиновозамин
P. aeruginosa	IATS O11	Фукозамин, Глюкоза	NAc-фукозамин, Глюкоза
^aПрибор определяет только нейтральные сахариды, не уроновую кислоту; полисахариды, деполимеризованные в 2M ТФУ/100°C/4 часа, если не указано иначе ^bKnirel et al. 2006 ^cопределено после 4M ТФУ/100°C/18 часов

Каркасный полимер OPS

На Фигуре 1E представлена химическая структура повторяющейся единицы капсульного полисахарида (CPS) K. oxytoca (KO) K19, который идентичен CPS K. pneumoniae K19. На Фигуре 1F представлен H-ЯМР спектр при 950 МГц очищенного KP K19 CPS. Природные KP OPS и PA OPS со средней молекулярной массой ММ 10-30 кДа были ковалентно связаны с более крупным K19 CPS (средняя ММ 218 кДа) с целью увеличения как их эффективной ММ, так и их эпитопной валентности. Каркасные полимеры OPS были биотинилированы после, или в процессе, этапа укрупнения, либо избирательно на каркасном полимере K19 CPS, с получением BP-1, BP-1.2 или BP-1.3 (Фигуры 2A-2C), либо случайным образом как на OPS, так и на CPS, с получением BP-2a (Фигура 3), либо избирательно на OPS, с получением BP-2b (Фигура 4).

Каркасные полимеры элюируются значительно раньше на колонке для эксклюзионной хроматографии, чем отдельные K19 CPS или OPS, это указывает на то, что они значительно увеличены в размерах по сравнению с отдельными компонентами, и демонстрируют уменьшение уровня свободного OPS в сравнении с количеством в исходном материале, что указывает на включение его в каркасный полимер.

Этот процесс укрупнения с использованием CPS, например, K19 CPS, в качестве каркасного полимера является универсальным процессом, который может быть применен к любым CPS/OPS или низкомолекулярным бактериальным полисахаридам и может приводить к четко определенному и воспроизводимому продукту, и при этом создает минимальные, или не создает, изменения эпитопов OPS/CPS. Как показано на Фигуре 6C, это было четко продемонстрировано после анализов антигенности методом ELISA с нативными PA OPS O1, O2, O3, O6, O10 и O11 и соответствующими конструктами PA OPS: K19 BP-1, с использованием кроличьей гипериммунной сыворотки после иммунизации УН PA (Фигура 6C). В данных экспериментах не наблюдали какие-либо отличия в антигенности между нативным PA OPS и соответствующим каркасным полимером OPS, это свидетельствовало о том, что эпитопы OPS сохранялись в процессе укрупнения.

Биотинилирование каркасных полимеров (BP)

BP-1

Сначала на восстанавливающем конце OPS добавляли короткий спейсер, содержащий первичный амин на каждом конце (например, ADH) путем восстановительного аминирования при помощи NaBH₃CN. Реакционноспособные альдегиды на KP OPS были размещены на концевых остатках 2,5-ангидроманнозы (2,5-anМan) в процессе процедуры экстракции путем обработки целого LPS нитритом натрия (Фигура 8A), при этом реакционноспособные кетоны на PA OPS были размещены на восстанавливающих концевых остатках KDO внутреннего ядра PA OPS путем обработки LPS уксусной кислотой, как показано на Фигуре 8A. ADH-дериватизированные OPS впоследствии смешивали с частично окисленным периодатом каркасом KP 19 CPS (иллюстративные хроматограммы ЭХ-ВЭЖХ этих производных представлены на Фигурах 6A и 6B) и биотином, содержащим первичный амин (таким как амин-ПЭГ3-биотин), и проводили восстановительное аминирование смеси, с получением каркасного полимера OPS, биотинилированного только на полисахаридном каркасе, который авторы изобретения назвали каркасным полимером 1 (BP-1) (Фигура 2A).

BP-1.2

Альтернативно, реакционноспособные карбоксилатные группы каркаса KP 19 CPS можно сначала биотинилировать при помощи 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS), и биотина, содержащего первичный амин (такого как амин-ПЭГ-биотин), затем окислять периодатом, смешивать с ADH-дериватизированным OPS и проводить восстановительное аминирование смеси, с получением каркасного полимера OPS, биотинилированного только на полисахаридном каркасе, который авторы изобретения назвали BP-1.2 (Фигура 2B). Альтернативно, этап с ADH можно опускать в случае PA OPS, поскольку они содержат заместитель аминокислоты аланина со свободной α-аминогруппой на атоме углерода 2 их остатков галактозамина внешнего ядра (Фигура 1A). Таким образом, эти доступные аминогруппы можно с легкостью использовать для прямого связывания путем восстановительного аминирования с окисленным периодатом полимером K19 CPS вместе с биотином, содержащим амин, с получением биотинилированного BP-1 (Фигура 2A) или BP-1.2 (Фигура 2B).

Альтернативно, OPS, содержащие альдегид или кетон на их восстанавливающем конце, дериватизируют соединением азидо-амина в присутствии восстанавливающего реагента, с получением OPS с азидогруппой на их конце. Полисахаридный каркас затем снабжают алкиновыми группами через полисахаридные карбоксилатные группы и EDC. Каркасный полисахарид затем биотинилируют с использованием CDAP и биотин-гидразидного соединения, с получением биотинилированного и алкинилированного полисахарида. Дериватизированный азидо-OPS и биотинилированный алкин-CPS затем связывают реакцией клик-химии с медным катализатором, с получением (OPS)_n-CPS BP-1, в котором каркасный полимер является биотинилированным, и OPS является не биотинилированным (Фигура 5B; схема 1). С использованием этого связывания в реакции клик-химии OPS BP-1 также можно получать, сначала вводя алкиновые группы в CPS с использованием карбоксилатных групп и EDC, а затем проводя аминирование с использованием амино-ПЭГ-азида и катализатора сульфата меди, биотинилирование CPS с использованием CDAP и гидразида биотина; биотинилированный CPS, содержащий первичные аминогруппы, смешивают с нативными OPS (содержащими альдегидные или кетонные группы на их восстанавливающих концах) и поводят восстановительное аминирование восстанавливающим реагентом, с получением OPS/CPS BP-1 (Фигура 5B; схема 2). BP-2b можно получать такой реакцией клик-химии, сначала избирательно вводя остатки биотина в OPS, дериватизированные азидогруппами на их конце, а затем проводя биотинилирование с использованием CDAP химии и гидразида биотина; и второе связывание в реакции клик-химии биотинилированного азидо-дериватизированного OPS с алкинилированным CPS, как показано на Фигуре 5B; схеме 3.

BP-2a

Альтернативно, ADH-дериватизированный OPS или не дериватизированный OPS смешивают с частично окисленным периодатом каркасом CPS KP штамма 19 и проводят восстановительное аминирование, с получением каркасного полимера OPS; каркасный полимер затем дериватизируют с использованием CDAP и биотин-ПЭГ-амина, с получением каркасного полимера, случайным образом биотинилированного биотином, как на каркасном полисахариде, так и на OPS, который авторы изобретения назвали BP-2a (BP-2a) (Фигура 3).

BP-2b

Альтернативно, OPS сначала биотинилируют с использованием CDAP и амин-ПЭГ-биотина; полученный биотинилированный OPS частично окисляют периодатом для введения альдегидов в его фрагменты KDO или гептозы внутреннего ядра и проводят восстановительное аминирование с использованием ADH; биотинилированный и аминированный OPS затем смешивают с частично окисленным периодатом каркасом KP 19 CPS и проводят восстановительное аминирование, с получением каркасного полимера OPS, избирательно биотинилированного на его OPS; авторы изобретения назвали его BP-2b (Фигура 4 и Фигура 5B, схема 3).

BP-3

Альтернативно, сначала проводят восстановительное аминирование ADH-дериватизированного OPS ε-NH₂ группами каркаса PLL, с получением каркасного полимера OPS-PLL. Полученный OPS-PLL обрабатывают ацилирующим реагентом, таким как уксусный ангидрид, для блокирования непрореагировавших аминогрупп (ε-NH₂) каркаса PLL, с получением каркасного полимера OPS-поли-N-ацетил-лизина (OPS-PNAcLL). Этот каркасный полимер OPS-PNAcLL затем биотинилируют на его OPS, сначала обрабатывая CDAP, а затем амин-ПЭГ-биотином. Этот каркасный полимер, избирательно биотинилированный на его OPS, называют BP-3 (Фигура 5A).

Непрореагировавшие OPS, биотин, CPS и остаточные реактивы для конъюгации удаляли методом ЖХБР-ЭХ с Superdex 200 или методом 50-300 кДа TFF УФ-ДФ.

Получение и очистка иллюстративных иммуногенных комплексов

Комплексы MAPS или вариантные комплексы MAPS получали путем добавления слитого белка-кандидата rRhavi-антиген к биотинилированному полисахариду в 20 мМ Tris, pH 8,0, 150 мМ NaCl, в выбранном соотношении (как правило, 3:1, белок:PS, по массе), с 0,01% тимеросала, добавленным для ингибирования микробного роста. Образец инкубировали с переворачиванием при 25°C в течение ночи, с последующим центрифугированием при 10000 x g в течение 5 мин для удаления любого нерастворимого материала (Zhang et al., 2013). Растворимый материал собирали, и комплексы MAPS или вариантные комплексы MAPS очищали эксклюзионной хроматографией на колонке Superdex 75 (нативные OPS PS MAPS) или колонке Superdex 200 (CPS MAPS и каркасный полимер-PS варианты MAPS) с 2 мМ Tris, pH 8,0, 150 мМ NaCl (Zhang et al., 2013). Соответствующие пикам фракции анализировали на содержание белка методом SDS-ПААГ восстановленных образцов без нагревания и визуализировали окрашиванием на общий белок. Фракции, содержащие комплексы MAPS или вариантные комплексы MAPS, идентифицировали в геле как окрашенные белки, задерживающиеся в геле в высокомолекулярных комплексах, а не как белки, ожидаемо мигрирующие в геле в соответствии с размером белкового димера (Zhang et al., 2013). Фракции, содержащие комплексы MAPS, объединяли, и соотношение белок/полисахарид в MAPS или варианте MAPS определяли с использованием набора для анализа белков BCA и в анализе с антроновым реактивом для полисахарида (Zhang et al., 2013). Целостность комплексов MAPS или вариантных комплексов MAPS оценивали методом SDS-ПААГ восстановленных образцов без нагревания, с визуализацией окрашиванием на общий белок (Zhang et al., 2013). Содержание свободного белка в комплексах MAPS или вариантных комплексах MAPS количественно определяли методом денситометрии содержания белковых димеров при SDS-ПААГ комплексов MAPS или вариантных комплексов MAPS без нагревания в сравнении со стандартным количеством контрольного белкового димера (Zhang et al., 2013). Молекулярную массу белка, включенного в комплексы MAPS или вариантные комплексы MAPS, анализировали методом SDS-ПААГ восстановленных, прокипяченных образцов, с визуализацией окрашиванием на общий белок и использованием стандартных белков-маркеров молекулярной массы.

KP/PA OPS получали в виде различных форм каркасных полимеров OPS (1, 2a, 2b) с использованием K19 CPS в качестве каркасного полимера, и получали вариантные комплексы MAPS со следующими продуктами слияния рекомбинантно полученного в E. coli ризавидина с белками из генома KP и PA: Rhavi-PcrV; Rhavi-MrkA; Rhavi-FlaA1; Rhavi-FlaA2; Rhavi-FlaB; Rhavi-FlaB-Домен2; Rhavi-FlaA2-Домен2; Rhavi-FlaB-PcrV; Rhavi-FlaB-Домен2-MrkA; Rhavi-MrkA-PcrV; Rhavi-FlaB-Домен2-PcrV, имеющими SEQ ID NO: 16-26, и с использованием PRO-CN в качестве контрольного белка.

Иллюстративные характеристики некоторых лотов MAPS, полученных со слитым белком ризавидина по изобретению и в комплексе с биотинилированными пневмококковыми полисахаридами PS типов 6B, 7F и 19A, приведены в Таблице 8. Иллюстративные результаты очистки для вариантных комплексов MAPS представлены на Фигурах 10 и 11. Вариантные комплексы MAPS очищали от непрореагировавшего белка методом ЭХ, и элюированные с геля фракции анализировали методом SDS-ПААГ, типичный анализ показан на Фигуре 10, где свободный белок показан элюируемым с геля в поздних фракциях, и он может быть отделен от вариантного комплекса MAPS, как исходно описано для комплексов MAPS в публикации Zhang et al., 2013. На Фигурах 11A-11C показаны результаты анализа методом SDS-ПААГ очищенных комплексов K19-PA O1 OPS BP-1 MAPS, комплексов K19-PA O2 OPS BP-1 MAPS и комплексов K19-PA O10 OPS BP-1 MAPS с PRO-CN (Фигура 11A); Rhavi-FlaB-PcrV (Фигура 11B); Rhavi-FlaB-D2-MrkA (Фигура 11C). Каждый из очищенных образцов вариантных MAPS отдельно обрабатывали с кипячением и без нагревания. Вариантные комплексы MAPS не разрушались без нагревания, и белок в вариантных комплексах MAPS оставался в самой верхней части геля (Zhang et al., 2013). При кипячении вариантные комплексы MAPS разрушались, белок высвобождался, и белковый димер, образовавшийся за счет межмолекулярного взаимодействия ризавидина, также диссоциировал (Zhang et al., 2013). Затем определяли содержание белка вариантных MAPS в анализе BCA, и содержание полисахарида определяли в анализе с антроновым реактивом. Соотношение белка и полисахарида рассчитывали, как соотношение по массе и как молярное соотношение.

Все конечные очищенные MAPS и вариантные MAPS поддавались стерилизации фильтрованием через 0,22-мкм фильтр (Таблица 8 и данные не представлены).

Таблица 8: Характеристики слитых белков ризавидина очищенных MAPS

PS	ММ PS (кДа)	Белок	ММ белка (кДа)	PS, мг/мл (антрон)	Белок, мг/мл (BCA)	Отношение белок:PS (по массе)	Моляр.отношение белок:PS	ВМС комплексы в SDS-ПААГ (без кипячения)	Соответствующего размера белок в SDS-ПААГ (кипячение)	% свободного белка (денситометрия, SDS/ПААГ, кипячен. против без кипячен.	Фильтрование через 0,22-мкм PES
6B	1092	PRO-CN	82	0,16	0,37	2,2:1	33:1	да	да	4	да
6B	1092	Rhavi-PcrV-his	48	0,13	0,21	1,7:1	38:1	да	да	7	да
6B	1092	Rhavi-FlaB-his	65	0,14	0,37	2,6:1	44:1	да	да	<1	да
6B	1092	Rhavi-FlaA1-his	56	0,13	0,21	1,6:1	31:1	да	да	5	да
6B	1092	Rhavi-FlaA2-his	56	0,12	0,12	1,0:1	20:1	да	да	<1	да
6B	1092	Rhavi-MrkA-his	37	0,14	0,20	1,4:1	42:1	да	да	<1	да

7F	901	PRO-CN	82	0,18	0,68	3,8:1	41:1	да	да	<1	да
7F	901	Rhavi-PcrV-his	48	0,14	0,19	1,4:1	25:1	да	да	<1	да
7F	901	Rhavi-FlaB-his	65	0,13	0,29	2,2:1	31:1	да	да	3	да
7F	901	Rhavi-FlaA1-his	56	0,12	0,14	1,2:1	19:1	да	да	<1	да
7F	901	Rhavi-FlaA2-his	56	0,13	0,11	0,8:1	14:1	да	да	<1	да
7F	901	Rhavi-MrkA-his	37	0,16	0,17	1,1:1	26:1	да	да	<1	да

19A	157	PRO-CN	82	0,23	0,89	3,9:1	7:1	да	да	<1	да
19A	157	Rhavi-PcrV-his	48	0,09	0,19	2,1:1	7:1	да	да	4	да
19A	157	Rhavi-FlaB-his	65	0,14	0,39	2,8:1	7:1	да	да	<1	да
19A	157	Rhavi-FlaA1-his	56	0,10	0,26	2,6:1	7:1	да	да	6	да
19A	157	Rhavi-FlaA2-his	56	0,11	0,15	1,4:1	4:1	да	да	<1	да
19A	157	Rhavi-MrkA-his	37	0,08	0,19	2,4:1	10:1	да	да	<1	да

Пример 6: Исследования иммунизации

Иммунизация животных

Перед иммунизацией кроликов комплексы MAPS или вариантные комплексы MAPS, или только PS, формулировали с адъювантом приблизительно за 48 ч до инъекции. MAPS или вариантные MAPS адсорбировали на адъюванте при конечной концентрации 10 мкг/мл PS каждого серотипа, либо отдельно, либо в виде мультивалентной смеси, с 40 мМ гистидином, pH 5,5, 150 мМ NaCl и 0,25 мг/мл гелем фосфата алюминия, с перемешиванием путем переворачивания в течение ночи при 4°C. Эту составленную смесь использовали непосредственно для иммунизаций в объеме 0,5 мл для дозы 5 мкг PS. Для более низких доз PS проводили соответствующее разбавление 40 мМ гистидином, pH 5,5, 150 мМ NaCl. Выполняли две в/м иммунизации (0,5 мл) с 2- или 4-недельным интервалом 4-месячным кроликам линии New Zealand White (Cocalico Biologicals, n=8-10 на группу). Образцы крови собирали через 2 недели после первой и второй иммунизации с 2-недельным интервалом дозирования. Образцы собирали через 2 и 4 недели после первой иммунизации и 2 недели после второй иммунизации с 4-недельным интервалом дозирования.

Для получения более высокого титра антител против носителей-кандидатов слитых белков использовали полный адъювант Фрейнда для первой иммунизации и неполный адъювант Фрейнда для второй и третьей иммунизации, соответственно. Каждый белок-носитель (0,1 мг) отдельно смешивали с адъювантом Фрейнда до конечного объема 1 мл, 0,2 мл вводили подкожной инъекцией в 4 разных участка, и 0,2 мл вводили в/м каждому кролику при каждой иммунизации. Иммунизации проводили 4-месячным кроликам линии New Zealand White (Cocalico Biologicals), (n=3 на группу) в день 0, день 14 и день 21, и образцы крови собирали через 2 недели после второй и третьей иммунизации.

Измерение уровня антител

Анализы для определения антител к капсульным полисахаридам (CPS) или OPS, или разным белковым антигенам выполняли в 96-луночных планшетах Immulon 2 HB или Greneir Bio-one средней степени связывания (Thermo Scientific Waltham Mass), покрытых (1 мкг CPS или OPS, или PS, конъюгированных с HSA/мл PBS) или белковыми антигенами (1 мкг белка/мл PBS). Планшеты блокировали 1% BSA в PBS. Добавляли антитела, разбавленные в PBS-T, и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Планшеты промывали PBS-T, добавляли вторичное HRP-конъюгированное антитело против кроличьего иммуноглобулина G (от компании Sigma) и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты промывали и обрабатывали для развития окраски субстратом пероксидазы SureBlue TMB Microwell (KPL, Gaithersburg, MD).

Титр кроличьих IgG в образцах сыворотки, специфичных для разных белковых антигенов, определяли методом ELISA и строили стандартную кривую на основании результатов для поликлональной сыворотки, используя условные единицы. Белковыми антигенами покрывали в течение ночи при комнатной температуре 96-луночные планшеты Immulon 2 HB (Thermo Scientific), используя 0,5-1 мкг белка/мл PBS и 100 мкл на лунку. Белковый раствор удаляли, планшеты блокировали PBS+1,0% BSA в течение 1 ч при комнатной температуре и промывали фосфатно-солевым буфером Дульбекко с 0,05% Tween-20 (PBS-T). Кроличью сыворотку разбавляли в PBS-T, добавляли в лунки планшета и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч. Планшеты промывали PBS-T, добавляли вторичные антитела осла против IgG кролика, конъюгированные с HRP (Santa Cruz Biotechnology), разбавленные 1 к 20000 в PBS-T, по 100 мкл в лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты промывали и обрабатывали для развития окраски субстратом пероксидазы SureBlue TMB Microwell (KPL, Gaithersburg, MD). Реакцию останавливали равным объемом 1 Н HCl, и поглощение определяли при 450 нм на планшетном ридере Spectramax (Molecular Devices). Величину УЕ, равную 12500 УЕ/мл присваивали стандартной поликлональной сыворотке, используемой в каждом планшете, и уравнение на основе 4-параметрической кривой использовали для определения величины в УЕ для каждого разбавленного образца сыворотки, основанное на поглощении при 450 нм и скорректированное на коэффициент разбавления. Критерием приемлемости стандартной кривой для поликлональной сыворотки (AFV160, специфической для PRO-CN, ризавидина и 6-гистидиновой метки) было значение R² для 4-параметрической кривой, составляющее 0,99 или более, и менее 10% КВ между дубликатами. Внутреннюю контрольную сыворотку (AFV151, специфическую для PRO-CN, ризавидина и 6-гистидиновой метки) также использовали в каждом планшете, и КВ для присвоенной величины должен был быть равен, или менее, 20% между планшетами для приемлемости данных.

Оценка функции носителя

Способность слитых белков ризавидина в качестве носителя вызывать повышенный иммунный ответ на полисахариды в комплексах MAPS оценивали и сравнивали с отдельным ризавидином и контрольным белком-носителем (PRO-CN), который ранее вызывал сильные иммунные ответы на находящиеся в комплексе полисахариды. Различные полученные слитые белки были включены в комплекс с полисахаридами с известной иммуногенностью (6B, 7F и 19A S. pneumoniae) (Zhang et al., 2013), и было проведено сравнение с контрольным сильным функциональным белком-носителем (PRO-CN). Все слитые белки были способны к объединению в комплекс с биотинилированным PS и образованию высокомолекулярных комплексов, которые могли быть очищены и впоследствии использованы для иммунизации кроликов и оценки функции носителя.

Кроликов иммунизировали комплексами MAPS, образованными пневмококковыми полисахаридами (PnPS) 6B и 19A с различными слитыми белками ризавидина. Сыворотки собирали через 2 недели после первой иммунизации (P1) и второй иммунизации (P2). Уровни кроличьих IgG к PnPS 19A и 6B в каждом образце определяли методом ELISA и выражали в УЕ, которые определяли из стандартной кривой, построенной для поликлональной сыворотки, которой было присвоено значение УЕ, равное 12500 УЕ/мл. На Фигурах 13A и 13B показано, что флагеллин B (FlaB) Pseudomonas в виде слитого белка с ризавидином (Rhavi-FlaB) и FlaB Pseudomonas, слитый с PcrV Pseudomonas в виде слитого белка с ризавидином (Rhavi-FlaB-PcrV), были способны индуцировать выработку IgG к пневмококковым полисахаридам (PnPS) 6B и 19A с титрами, аналогичными титрам в случае ранее идентифицированного белка-носителя, PRO-CN. FlaA1 и FlaA2 Pseudomonas в виде слитых белков с ризавидином (Rhavi-FlaA1 и Rhavi-FlaA2) и FlaB-Домен2 Pseudomonas, слитый с MrkA Klebsiella в виде слитого белка с ризавидином (Rhavi-FlaBD2-MrkA), продемонстрировали титры, которые были аналогичны, или в пределах 2-кратного превышения, титрам в случае Rhavi-FlaB и PRO-CN. MrkA Klebsiella и PcrV Pseudomonas продемонстрировали очень низкие, вплоть до неопределяемых, титры IgG для введенного 19A PS и низкие титры для 6B и 7F при дозе 0,044 мкг. Для преодоления слабого функционирования MrkA в качестве носителя и, в то же время, для выработки антител, направленных на MrkA, проводили его слияние с сильным носителем белком FlaB-Домен2 с целью сохранения функции носителя (Rhavi-FlaBD2-MrkA).

В Таблице 9 приведены сводные характеристики носителей иллюстративных слитых белков ризавидина по изобретению. Функцию носителя каждого слитого белка выражали в процентах от функции белка-носителя PRO-CN и сравнивали с отдельным белком ризавидином, который приводил лишь к 4% иммунного ответа на 6B и 5% иммунного ответа на 19A, в сравнении с показателями для PRO-CN. Rhavi-FlaB-PcrV, белок с двойной патогенной специфичностью (химерный белок из двух антигенов Pseudomonas, FlaB и PcrV, слитых с ризавидином), проявил себя как сильный носитель в отношении вызывания сильного PnPS-специфического иммунного ответа у кроликов на тип 6B (62%) и 19A (102%), в сравнении с PRO-CN (100%). Rhavi-FlaB также продемонстрировал сильную функцию носителя, с сильными иммунными ответами как на 6B (66%), так и на 19A (49%), в сравнении с PRO-CN. Rhavi-MrkA имел более слабую функцию в качестве белка-носителя для 6B (27%) и 19A (2%), в сравнении с PRO-CN, соответственно. Rhavi-FlaBD2 имел сильную функцию в качестве носителя для 6B (66%), и более слабую функцию в качестве носителя для 19A (20%). Химерный Rhavi-FlaBD2-MrkA, содержащий антигены как Pseudomonas (FlaBD2), так и Klebsiella (MrkA), обеспечивал функцию носителя как для 6B (34%), так и для 19A (45%), которая была приблизительно в 2-раза слабее, чем функция белка-носителя PRO-CN и превышала таковую у отдельного ризавидина. Поскольку к обоим PnPS был индуцирован иммунный ответ, который превышал 30% ответа в случае PRO-CN, и поскольку было представлено большое число специфических для патогенов белков, как Rhavi-FlaB-PcrV, так и Rhavi-FlaBD2-MrkA, варианты были выбраны в качестве потенциальных белков-носителей для образования комплекса в вариантных MAPS с каркасным полимером OPS по изобретению. В дополнение к продемонстрированной функции носителя, IgG к белку-носителю, специфические для высоко консервативного PcrV Pseudomonas и, в некоторой степени, FlaB (то есть, приблизительно 45 процентов штаммов Pseudomonas экспрессируют FlaB), а также для консервативного MrkA Klebsiella, выработанные против этих СБ, могут обеспечивать значительное дополнительное широкое защитное покрытие против заболевания, вызываемого этими 2 патогенами.

Таблица 9: Характеристики белка-носителя иллюстративных слитых белков ризавидина и вариантов

Белок	Бактерии	Наличие TLR5-связывающего домена	Функция носителя^*	% от PRO-CN геометрического среднего для 6B	% от PRO-CN геометрического среднего для 19A
PRO-CN	S. pneumoniae	Н/П	++++	100	100
Rhavi-PcrV-his	P. aeruginosa	Н/П	++	38	7
Rhavi-FlaB-his	P. aeruginosa	Да	++++	66	49
Rhavi-FlaA1-his	P. aeruginosa	Да	+++	40	9
Rhavi-FlaA2-his	P. aeruginosa	Да	+++	42	16
Rhavi-MrkA-his	K. pneumoniae	Н/П	+	27	2
Rhavi-his	S. pneumoniae	Н/П	+	4	5
Rhavi-FlaBD2-his	P. aeruginosa	Нет	+++	66	20
Rhavi-FlaA2D2-his	P. aeruginosa	Нет	+	11	5
Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	P. aeruginosa K. pneumoniae	Нет	+++	34	45
Rhavi-FlaB-PcrV-his	P. aeruginosa	Да	++++	62	102
Rhavi-PcrV-MrkA-his	P. aeruginosa K. pneumoniae	Н/П	++	30	23
*Способность слитого белка вызывать продуцирование антител к пневмококковому PS (PnPS) типа 19A и 6B, в сравнении со слитым белком PRO-CN, принятым за эталон (100 процентов (++++)).

Оценка иммуногенности

Результаты сравнительного исследования иммуногенности у кроликов различных препаратов нативных PA O6 и O10 OPS в виде комплексов MAPS со слитым белком ризавидина PRO-CN, или ризавидином, представлены на Фигуре 15. Титры OPS-специфических IgG в анализе ELISA представлены в единицах ELISA. Титры OPS-специфических IgG антител, более чем в 100 раз превышающие титры P0, не были достигнуты ни с одним из этих препаратов после 2 иммунизаций (P2). Это свидетельствует о том, что молекулярный размер нативных PA OPS (10-30 кДа) был слишком мал, эпитопная валентность была слишком низкой или молекулярная структура была неподходящей для вызывания ответа даже при использовании комплексов MAPS с белком-носителем, PRO-CN.

Исследование иммуногенности, в котором сравнивали различные варианты каркасного полимера KP-O1 OPS в виде вариантных комплексов MAPS, проводили на кроликах. BP-1, BP-2a и BP-2b варианты KP O1 OPS, связанные с капсульным полисахаридом (CPS) Klebsiella K19, оценивали на иммуногенность. Также оценивали BP-1 вариант KP O5, связанный с K19. Сравнивали иммуногенность четырех смесей вариантных комплексов MAPS; 2-валентного KP-O1 и -O5 OPS BP-1 (схематическое изображение которого представлено на Фигуре 2A); KP-O1 BP-2a (Фигура 3) и KP-O1 BP-2b (Фигура 4). Все эти полисахариды были включены в вариантные комплексы MAPS с белком-носителем PRO-CN и составлены с квасцами перед инъекцией. Титры анти-KP-O1 OPS IgG показаны в единицах ELISA для преиммунной сыворотки (P0), сывороток после первой (P1) или 2 иммунизаций (P2) на Фигуре 16. BP-2a OPS (12000 единиц EIA) приводил к титрам O1 OPS-специфических IgG, более чем в 100 раз превышающим титры P0. O1 OPS BP-1 и O5 OPS BP-1 приводили к титрам, в 10 раз превышающим титры P0.

В аналогичном исследовании иммуногенности на кроликах сравнивали различные препараты PA-O6 и -O10 OPS BP-1: 2-валентный PA-O6,-O10 OPS BP-1 PRO-CN MAPS с квасцами; 2-валентный PA-O6,-O10 OPS BP-1 PRO-CN MAPS без адъюванта (без квасцов); 2-валентный PA-O6,-O10 OPS BP-1 только полисахарид (квасцы, без белка); 2-валентный PA-O6,-O10 OPS BP-1 в смеси с PRO-CN без образования комплекса (не биотинилированный; квасцы; без образования вариантного MAPS); и одновалентный PA-IATS O6 OPS BP-1 PRO-CN MAPS с квасцами (дополнительный источник OPS штамма PA O6). Титры анти-PA-O6 и PA-O10 OPS IgG показаны в единицах ELISA для преиммунной сыворотки (P0), сывороток после одной (P1) или 2 иммунизаций (P2) на Фигуре 17. Титры PA-O6 и PA-O10 OPS-специфических IgG, более чем 100 раз превышающие титры P0, могли быть достигнуты (5000-11000 диапазон в единицах ELISA) только, когда каркасный полимер OPS присутствовал в вариантном комплексе MAPS с квасцами.

Размер KP OPS, полученного с использованием стандартизированных лабораторных условий роста в среде с определенным химическим составом, находится в диапазоне 10-15 кДа, сравнительно меньше, чем размер PA OPS (20-30 кДа), полученного в аналогичных условиях, эти различия в размерах могут, частично, служить объяснением, почему в этих сравнительных исследованиях иммуногенности PA OPS BP-1 были более иммуногенными, чем KP OPS BP-1. Конструкты KP OPS BP-2b, с другой стороны, были в значительной степени иммуногенными (Фигура 16). Другие структурные отличия в повторяющихся единицах OPS также могли оказывать влияние, например, заряд; повторяющиеся единицы как PA-O6, так и -O10, являются отрицательно заряженными, тогда как KP-O1 OPS является нейтральным.

Пример 7: Функциональные анализы антител

Анализ опсонофагоцитарного уничтожения

Анализы опсонофагоцитарного уничтожения (ОФУ) с HL-60: Анализы проводили, как описано ранее, с модификациями (Ramachandran et al., 2016). Вкратце, анализы проводили в 96-луночных круглодонных планшетах с использованием штаммов P. aeruginosa и K. pneumoniae из культур в логарифмической фазе роста, разбавленных до 3×10⁵ клеток/мл; комплемента крольчонка (BRC); PMA-дифференцированных клеток HL-60 (2×10⁷ клеток/мл) в качестве источника полиморфноядерных лейкоцитов; и кроличьей преиммунной/иммунной сыворотки в нескольких разведениях. После 45 мин инкубации при 37°C аликвоты отбирали из лунок и помещали на чашки с бактериологическим агаром (5% экстракт Hy-Yeast [Kerry Bio-Science], 10% сойтон без продуктов животного происхождения [Teknova], 5% NaCl [Americanbio] и 1,4% агар [Americanbio], называемым далее в настоящем изобретении HySoy агаром или HSA). После инкубации в течение ночи на HSA подсчитывали КОЕ. Положительный ОФУ-ответ был получен, когда показатель КОЕ для бактерий, обработанных иммунной сывороткой, уменьшался в сравнении с обработкой преиммунной сывороткой в аналогичном разведении.

На Фигуре 18A приведено сравнение ОФУ Klebsiella штамма KP 12-0581 (O1: K62) с клетками HL-60 и кроличьей иммунной сывороткой к: KP-O1 OPS BP-1 PRO-CN MAPS до иммунизации и после второй иммунизации (слева), а также KP-O1 OPS BP-2a/ризавидин PRO-CN MAPS до иммунизации и после второй иммунизации (справа). Значительное уничтожение KP наблюдали в случае анти-BP-2a иммунной сыворотки (P2) в сравнении с преиммунной сывороткой (P0) от того же кролика. Значительное уничтожение отсутствовало в случае анти-BP-1 иммунной сыворотки, что согласовалось с титрами O1-OPS-специфических IgG, полученными при использовании данных конструктов, то есть BP-2a> BP-1 в отношении соответствующих титров.

Результаты ОФУ Pseudomonas штамма PA IATS O6 с клетками HL-60 и кроличьей иммунной сывороткой к двухвалентному PA O6, O10-OPS BP-1 PRO-CN MAPS и одновалентному PA IATSO6-OPS BP-1 PRO-CN MAPS представлены на Фигуре 18B. 2 отдельные кроличьи сыворотки P2 (AFV 624; AFV 625) к PA O6, O10-BP-1 MAPS приводили к значительному ОФУ PA IATSO6 (левая панель), кроличья иммунная сыворотка (P2) против PA IATSO6-BP-1 MAPS также приводила к значительному ОФУ PA IATS O6, при этом сыворотка AFV643 (P2) создавала эффект прозоны, свидетельствующий о сильном титре анти-OPS антитела.

Четыре отдельные кроличьи иммунные сыворотки (P2), полученные с использованием 2-валентной PA-O6, -O10 OPS BP-1-PRO-CN-MAPS вакцины, вызывали надежное ОФУ бактерий Pseudomonas O10 клетками HL-60 (Фигура 18C).

ОФУ целевого штамма P. aeruginosa штамма PAO1 (O5: экспрессирующего FlaB) объединенной кроличьей анти-Rhavi-FlaB-His сывороткой и клетками HL-60 показано на Фигуре 22. В этом эксперименте имело место некоторое ОФУ (разведение до 1/100), вызываемое анти-Rhavi-FlaB-His сывороткой. Сильное ОФУ было отмечено с человеческими в/в IG, индуцированными вакциной Pseudomonas, и сывороткой против FlaB Pseudomonas. Контрольная (-) сыворотка не индуцировала ОФУ.

Анализы ОФУ с человеческими PMN

Анализы проводили, как описано ранее, с модификациями (Cross et al., 1986). Вкратце, анализы проводили в 96-луночных планшетах с использованием полиморфноядерных лейкоцитов (PMN), свежевыделенных из крови здоровых людей-доноров путем осаждения декстраном и центрифугирования в градиенте плотности Ficoll-Hypaque. Маточную суспензию PMN доводили до 23×10⁶ клеток/мл в HBSS с кальцием/магнием. Шестьдесят мкл маточной суспензии PMN добавляли в лунку планшета вместе с 10-20 мкл либо комплемента крольчонка, либо свежей нормальной человеческой сыворотки (NHS), 10 мкл бактерий (~10⁶КОЕ для MOI ~1:1) в присутствии или в отсутствие 10 мкл инактивированной нагреванием пре- или пост-иммунной сыворотки в разных разведениях. В момент времени 0 образец отбирали, разбавляли и высевали на чашки с HySoy, затем 96-луночный планшет инкубировали в течение 2 ч при 37°C со встряхиванием. Через 2 ч образцы вновь отбирали, разбавляли и высевали. После инкубации в течение ночи при 37°C производили подсчет клеток в чашках. Количество клеток в момент времени 2 ч для каждой лунки делили на количество клеток в момент времени 0, и % уничтожения рассчитывали по формуле 1,0-T_2h КОЕ/T₀ КОЕ. Альтернативно, авторы изобретения переводили КОЕ для каждой лунки в log КОЕ, вычитали log числа КОЕ для 2 ч образца из log числа КОЕ для момента времени 0, и выражали разницу в уничтожении в виде «дельта log КОЕ». Затем авторы изобретения сравнивали уничтожение в лунках, содержащих преиммунную и иммунную сыворотки, с контролем без антитела.

Анализы связывания методом проточной цитометрии

Штаммы P. aeruginosa и K. pneumoniae в середине логарифмической фазы роста концентрировали в PBS до OD₆₀₀ 0,8. В случае полисахаридных антигенов бактерии фиксировали 1% формальдегидом перед добавлением антитела. В случае белковых антигенов бактерии не фиксировали формальдегидом перед добавлением антитела с целью сохранения клеточных поверхностных антигенов. Бактерии инкубировали с кроличьей преиммунной/иммунной сывороткой в разных разведениях в течение 1 ч при комнатной температуре. Несвязанное антитело удаляли путем осаждения бактерий центрифугированием и промывания PBS, промытые клетки инкубировали с меченым Alexa Fluor 488 антителом козы против IgG кролика (Invitrogen) в течение 1 ч при комнатной температуре. Несвязанное вторичное антитело удаляли путем осаждения бактерий центрифугированием и промывания PBS. Иммунологически окрашенные бактерии фиксировали в 1% формальдегиде для уничтожения любых жизнеспособных микроорганизмов. Образцы инжектировали в проточный цитометр LSR II (BD) и анализировали с использованием FACS Diva (v. 6.1.3; BD) и FlowJo (v. 9.2; Tree Star).

Определенные методом ПЦ результаты связывания Klebsiella штамма B5055 (O1: K2) с кроличьей сывороткой к K-19: O1-и O5-OPS BP-1 и BP-2a PRO-CN MAPS показаны на Фигуре 19A. Показаны определенные методом ПЦ результаты связывания целых бактерий Klebsiella штамма B5055 с отдельными кроличьими сыворотками к 2-валентному KP O1, O5 OPS BP-1 (№651-655) (слева) и KP O1 OPS BP-2a (№666-670) (справа).

Эти определенные методом ПЦ результаты для целых бактерий хорошо коррелируют с соответствующими ELISA титрами IgG к очищенному KP O1 OPS, приведенными в Таблице 10, то есть низкий титр соответствует низкому уровню связывания при определении методом ПЦ, небольшое количество дважды положительных событий указывает на слабое связывание антитела или ограниченный доступ для антитела к OPS на поверхности KP B5055.

Таблица 10: ELISA титры анти-KP O1-OPS IgG к O1-OPS с каркасным полимером в конструктах BP-1 MAPS и BP-2a MAPS

Кроличья иммунная сыворотка	EIA титры
P0	P1	P2
KP 2-в O1, O5 BP-1 №651-655	5729	13025	53731
KP O1 BP-2a №666-670	5428	411496	119731

На Фигуре 19B приведено сравнение диаграмм разброса данных ПЦ для трех штаммов Klebsiella O1 с кроличьей иммунной сывороткой (AFV667), индуцированной комплексом KP O1 OPS BP-2a PRO-CN MAPS; на верхних панелях наблюдается слабое связывание с KP B5055 (слева), слабое связывание с K. caroli (центр) и сильное связывание с не инкапсулированным штаммом KP CVD 3001 (справа) при определении методом ПЦ. На нижней панели (Фигура 19B) приведено сравнение определенных методом ПЦ суммарных событий связывания с одними и теми же 3 штаммами Klebsiella O1 для сыворотки от кролика, вакцинированного 2-валентным KP O1, O5 OPS BP-1 (AFV651) PRO-CN MAPS, и кроличьей сыворотки (AFV667), индуцированной одновалентным KP O1 OPS BP-2a PRO-CN MAPS. Следует отметить, что имеет место значительно большее связывание антитела с конструктом O1 OPS BP-2a, чем с соответствующим конструктом BP-1 OPS, при определении методом ПЦ, и эти данные, судя по всему, коррелируют с титрами IgG к O1 OPS, то есть, KP O1 OPS BP-2a является более иммуногенным, чем его эквивалент BP-1. Эти данные по связыванию также свидетельствуют о том, что количество CPS, влияющее на экспонирование OPS для антитела, возможно, зависит от условий выращивания.

Сравнение определенного методом ПЦ связывания антитела с целыми бактериями Pseudomonas штамма PAK (O6:FlaA1) показано на Фигуре 20: с кроличьей сывороткой (объединенная сыворотка от 3 кроликов, после второй иммунизации) к 2-валентному PA-O6, -O10 нативному OPS-PRO-CN-MAPS (слева); кроличьей сывороткой (объединенная сыворотка от 3 кроликов, после второй иммунизации) к 2-валентному PA O6, O10-OPS BP-1-PRO-CN MAPS (центр); кроличьей сывороткой (объединенная сыворотка от 3 кроликов, после второй иммунизации) к одновалентному PAO6-IATS-OPS BP-1-PRO-CN MAPS; более сильное определенное методом ПЦ связывание антитела со штаммом PAK наблюдали в случае PAO6 OPS BP-1 PRO-CN MAPS при сравнении с нативной формой PA O6 OPS MAPS, это указывало на то, что существует минимальный размер OPS, критический для его иммуногенности, то есть, размер нативного PA OPS слишком мал и должен быть увеличен за счет химического связывания с каркасным полисахаридом для увеличения его эпитопной валентности, а также его размера.

Связывание Pseudomonas штамма PAO1 (O5, экспрессирующего FlaB) отдельными кроличьими анти-FlaB антителами, индуцированными различными вариантами СБ ризавидина, содержащими эпитопы FlaB, изучали методом ПЦ, и результаты приведены в Таблице 11. Связывание, в процентах, превышающее пороговое значение, и высокая степень связывания преиммунной сыворотки (P0) в сравнении с сывороткой после третьей иммунизации (P3) показаны для 3 отдельных кроличьих сывороток к антигенам слитых белков. Эти данные по связыванию демонстрируют, что слитые белки FlaB-D2 и FlaB-PcrV с ризавидином могут индуцировать сильное связывание и узнавание антителом целых Pseudomonas штамма PAO1, экспрессирующих FlaB жгутиков, это свидетельствует о том, что эти 2 белка продуцируются с правильной укладкой и способны индуцировать выработку анти-FlaB антител со специфичностью для эпитопов естественных жгутиков B на целых бактериях Pseudomonas. Сыворотка против слитого белка RhaviFlaB-D2-MrkA не узнает в значительной степени (или, в лучшем случае, узнает слабо) жгутики на целых Pseudomonas штамма PAO1, это указывает на то, что FlaB-часть конструкта ризавидина либо не имеет правильную укладку, либо не является в достаточно степени иммуногенной в контексте слитого белка с MrkA, при оценке иммунизации одним белком с адъювантом Фрейнда.

Диаграммы разброса данных ПЦ для некоторых из отдельных кроличьих сывороток (№792, №798 и №800), приведенных в Таблице 11, также показанные на Фигуре 21B (верхняя панель), демонстрируют определенное методом ПЦ сильное связывание для отдельной кроличьей сыворотки № 792 (образец после P3) с ризавидин-FlaB-D2; (центральная панель) промежуточное связывание для кроличьей сыворотки № 798 (образец после P3) с ризавидин-FlaB-PcrV; и (низ) слабое связывание для отдельной кроличьей сыворотки № 800 (образец после P3) с ризавидин-FlaB-D2-MrkA. На Фигуре 21A объединенная кроличья сыворотка от кроликов, иммунизированных слитым белком ризавидин-FlaB-Домен2 (лишенным TL5-связывающей области) (P3) демонстрирует высокую процентную долю меченой популяции Pseudomonas штамма PAO1 (диаграмма разброса данных, правая панель) в сравнении с преиммунной сывороткой (P0).

Таблица 11: Определенные методом ПЦ результаты связывания кроличьих анти-FlaB антител к Pseudomonas штамма PAO1 (O5, экспрессирующего FlaB)

Rhiz-Слитые белки	Кролик №	Процентная доля выше порогового значения	Процентная доля высокой степени связывания
P0	P3	P0	P3
FlaB-D2	791	2,3	2,1	0	0,1
FlaB-D2	792	2,3	44,2	0,1	14,8
793	1	31,8	0	11,4
FlaB-PcrV	797	3,3	28,5	0,1	7,7
FlaB-PcrV	798	3,6	13	0	2,2
799	2	11,7	0,1	2,2
FlaB-D2-MrkA	800	0,3	3,7	0	0,1
FlaB-D2-MrkA	801	0,3	2,2	0	0,1
802	1,9	3	0	0

Эти полученные методами ELISA и ПЦ данные по связыванию свидетельствуют в пользу того, что слитые белки ризавидина, содержащие FlaB, такие как ризавидин-FlaB-Домен2 и ризавидин-FlaB-PcrV, могут быть получены с правильной укладкой и индуцировать выработку функциональных антител, способных узнавать естественные жгутики B на целых микроорганизмах Pseudomonas.

Подвижность и анализы ингибирования подвижности

P. aeruginosa штамма PAO1 (O5: экспрессирующего FlaB) выращивали до середины логарифмической фазы в бульоне HySoy. Бактерии осаждали центрифугированием и суспендировали в PBS до показателя OD₆₀₀ 0,3, затем разбавляли в 100 раз в PBS. Мягкий агар заливали в 24-луночные планшеты в присутствии или в отсутствие иммунной сыворотки к флагеллину в разных разведениях. Разведения иммунной сыворотки повторяли в лунках трехкратно. Обожженную в пламени иглу погружали в бактериальную суспензию, затем использовали для инокуляции центра агаровой пробки. Планшеты инкубировали при 30°C в течение 14 ч, или дольше, или до тех пор, когда бактерии распространялись от участка инокуляции по поверхности агара. Изображения планшетов получали при помощи цифровой камеры для регистрации диаметра бактериальной колонии. Результаты теста ингибирования подвижности являются положительными, когда размер колонии на агаре с сывороткой к флагеллину значительно уменьшается в сравнении с преиммунной сывороткой.

Результаты ELISA и соответствующие ингибирующие подвижность титры сыворотки от кроликов, вакцинированных конструктами ризавидин-FlaB: Rhavi-FlaB-D2; Rhavi-FlaB-PcrV и Rhavi-FlaB-D2-MrkA, приведены в Таблице 12. В данной таблице ELISA титры к FlaA1 и FlaB показаны для иммунных сывороток после третьей иммунизации (P3), и также показаны ингибирующие подвижность титры для соответствующих иммунных сывороток P3 при использовании P. aeruginosa штамма PAO1 (O5: экспрессирующего FlaB). Имеет место сильная корреляция между уровнями анти-FlaB антитела (ELISA титры) и соответствующими ингибирующими подвижность титрами, то есть, обе иммунные сыворотки против Rhavi-FlaB-D2 и Rhavi-FlaB-PcrV с высокими титрами специфического анти-FlaB антитела приводили к высоким уровням ингибирования подвижности PAO1, в отличие от сыворотки к конструкту слитого белка Rhavi-FlaB-D2-MrkA, предположительно, вследствие низких уровней анти-FlaB антитела, вероятно, либо вследствие либо неправильной укладки компонента белка FlaB в конструкте, либо отсутствия иммунного ответа в контексте слитого белка с MrkA при оценке иммунизации одним белком с адъювантом Фрейнда.

Таблица 12: ELISA титры и титры ингибирования подвижности для различных конструктов, содержащих ризавидин-FlaB

Конструкт слитого белка ризавидина	Кролик №	Сыворотки после третьей вакцинации
FlaA1 ELISA	FlaB ELISA	Титр ингибирования подвижности
FlaB-D2	AFV791	744	279209	1250
FlaB-D2	AFV791	627	154104	1250
AFV793	763	423514	250
FlaB-PcrV	AFV797	31497	318117	1250
FlaB-PcrV	AFV798	40911	230702	1250
AFV799	41566	499941	1250
FlaB-D2 MrkA	AFV800	1916	35651	10
FlaB-D2 MrkA	AFV801	944	53477	50
AFV802	291	34790	10

Анализы цитотоксичности (для конструктов с белком PcrV Pseudomonas )

Анализы проводили следующим образом. Вкратце, кроличью иммунную сыворотку, полученную против белка PcrV бактериальной секреторной системы, добавляли к клеткам A549, высеянным в плоскодонные 96-луночные планшеты (Corning Costar). Все разведения иммунной сыворотки и бактериальных культур выполняли в среде RPMI без антибиотика. P. aeruginosa штамм PAK, способный экспрессировать ExoU, в логарифмической фазе роста добавляли при показателе MOI приблизительно 10 и инкубировали в течение 2 ч при 37°/5% CO₂, за это время клетки A549 подвергались интоксикации и становились нежизнеспособными. Количество жизнеспособных клеток в каждой лунке оценивали на основании поглощения клетками прижизненного красителя нейтрального красного (Pseudomonas также метаболизирует аламаровый синий, и он не может быть использован). Процентную долю жизнеспособных клеток в каждой лунке оценивали путем измерения поглощения нейтрального красного и сравнения этих значений со значениями для клеток, который не были заражены бактериями. Результаты данного анализа являются положительными, когда иммунная сыворотка против PcrV приводит к увеличению количества жизнеспособных клеток (то есть клеток, способных поглощать нейтральный красный) в сравнении с преиммунной сывороткой в эквивалентном разведении.

Модель предотвращения клеточной цитотоксичности, вызываемой бактериями Pseudomonas (Warrener et al., 2014), использовали для тестирования эффективности анти-Rhavi-FlaB-PcrV СБ кроличьего антитела, и результаты представлены на Фигуре 24A. Защиту анти-PcrV антителом клеток A549 (карцинома легкого) от интоксикации Pseudomonas штамма PAK (O6:FlaA1) оценивали следующим образом. Монослои A549 инфицировали Pseudomonas штамма PAK (O6:FlaA1) в течение 4 ч в присутствии 10% сыворотки от кроликов (объединенные 3 сыворотки, после третьей иммунизации, P3), вакцинированных слитым белком Rhavi-FlaB-PcrV. Анти-Rhavi-FlaB-PcrV сыворотка защищала клетки от интоксикации Pseudomonas штамма PAK, в сравнении с преиммунной сывороткой, о чем свидетельствует меньшее количество округлившихся и отделившихся клеток. В следующем эксперименте (Фигура 24B) монослой клеток A549 инфицировали Pseudomonas штамма PAK в течение 4 ч в присутствии сыворотки против Rhavi-FlaB-PcrV (объединенные 3 сыворотки, P3) в разных разведениях. Клетки промывали PBS и инкубировали в течение 1 ч с нейтральным красным. Клетки лизировали, и регистрировали поглощение красителя в каждой лунке. Анти-Rhavi-FlaB-PcrV (P3) сыворотка защищала клетки от интоксикации PAK в сравнении с преиммунной сывороткой в разведении 1 к 40.

Без связи с какой-либо теорией, поликлональный характер ответа на Rhavi-FlaB-PcrV, а также его конфигурация в слитом белке, может являться причиной увеличения аффинности антитела к компоненту PcrV слитого белка. Несколько штаммов Pseudomonas тестировали в этом анализе цитотоксичности с использованием клеток A549 и анти-FlaB-PcrV кроличьей сыворотки (после третьей иммунизации; P3) (Фигура 25): в случае высокотоксичной PA IATS O1 (замкнутые ромбы) сывороточная защита от цитотоксичности отсутствовала; в случае цитотоксического штамма PA M2 O5 (замкнутые кружки) сывороточная защита также отсутствовала; в случае не цитотоксической PA IATS O6 (замкнутые треугольники) токсичность отсутствовала; в случае цитотоксической PA 17002 (O10) (замкнутые треугольники) четко наблюдалась сывороточная защита; эти отличия в сывороточной защите в зависимости от штамма могут отражать экспрессию и уровень целевого белка PcrV на штаммах Pseudomonas.

Анализ адгезии к клеткам

Адгезию Klebsiella к клеткам A549 анализировали, как описано (Clements et al., 2008), с некоторыми модификациями. Кроличью иммунную сыворотку, полученную против фимбриального белка MrkA, разбавляли в буфере RPMI (без добавок) и добавляли к клеткам A549, высеянным в 96-луночные планшеты. Равный объем K. pneumoniae O5 штамма 6997 (10⁴ КОЕ/мл) смешивали с иммунной сывороткой в разных разведениях. Инфицированные клетки инкубировали в течение 1 ч при 37°C и 5% CO₂, после чего лунки промывали 6 раз стерильным PBS для удаления несвязанных бактерий. Клетки лизировали 0,1% Triton X-100 в PBS, и аликвоту раствора наносили на HSA. Планшеты инкубировали в течение ночи, и количество КОЕ подсчитывали. Результаты анализа являются положительными, когда количество прикрепившихся Klebsiella уменьшается при использовании анти-MrkA иммунной сыворотки в сравнении с преиммунной сывороткой в таком же разведении.

Блокирование адгезии Klebsiella KP O5 6997 (место происхождения Южная Африка) к клеткам A549 анти-Rhavi-FlaBD2-MrkA кроличьей сывороткой показано на Фигуре 23. Специфическая для Rhavi-FlaBD2-MrkA сыворотка с высоким титром (после третьей иммунизации, P3) значительно ингибировала связывание KP штамма 6997 с клетками A549 при разведении вплоть до 1/1000, в отличие от преиммунной сыворотки (P0). Это указывало на то, что компонент белка MrkA в СБ Rhavi-FlaBD2-MrkA имел правильную укладку и был способен вызывать продуцирование функциональных блокирующих антител, специфических для нативного MrkA на поверхности бактерий KP. Второй эксперимент проводили с использованием отдельных анти-MrkA кроличьих иммунных сывороток, полученных в результате иммунизации двумя слитыми белками MrkA-ризавидин: Rhavi-FlaB-D2-MrkA и Rhavi-PcrV-MrkA, результаты эксперимента приведены в Таблице 13. Все кроличьи сыворотки против СБ MrkA (за исключением одной № 804) были способны уменьшать адгезию Klebsiella O5 штамма 6997 к клеткам A549, это указывало на то, что эти 2 СБ ризавидина обладали потенциалом вызывать продуцирование функциональных MrkA-специфических антител.

Таблица 13: Ингибирование анти-MrkA сывороткой связывания Klebsiella O5 штамма 6997 с клетками A549

Кроличья сыворотка	Разведение, при котором P3 уменьшала адгезию
№ 800 - Rhavi FlaBD2 MrkA	1 к 150
№ 801 - Rhavi FlaBD2 MrkA	1 к 2400
№ 802 - Rhavi FlaBD2 MrkA	1 к 75
№ 803 - Rhavi PcrV MrkA	1 к 300
№ 804 - Rhavi PcrV MrkA	0 уменьшение
№ 805 - Rhavi PcrV MrkA	1 к 75

Анализ продуцирования антител к MrkA

Анти-MrkA антитело вызывает агглютинацию Klebsiella, экспрессирующей MrkA/фимбрию 3 типа, приводя к образованию кластеров бактерий, которые выпадают из раствора. Оценивали преиммунную или иммунную сыворотки от кроликов, которые были инокулированы белками носителями Rhavi-MrkA-his, Rhavi-FlaB-D2-MrkA-his или Rhavi-PcrV-MrkA-his. Klebsiella штамма 4425 (O5: K57) инкубировали с сыворотками в разных разведениях в PBS при 25°C в течение 1 ч в 96-луночных круглодонных планшетах для титрования. Планшеты осторожно встряхивали для суспендирования не агглютинированных бактерий. Супернатант из каждой лунки осторожно отбирали и переносили в новый планшет для титрования и измеряли светорассеяние при 600 нм для оценки мутности раствора. Результат является положительным, когда поглощение уменьшается в сравнении с контрольной лункой без антитела, это указывает на уменьшение количества бактерий в супернатанте вследствие вызываемой антителом агглютинации. Результат анализа регистрировали как наибольшее разведение антитела (наименьшая концентрация), при котором происходила агглютинация K. pneumoniae из-за иммунной сыворотки в большей степени, чем из-за преиммунной сыворотки, при измерении разницы в поглощении при 600 нм.

Результаты оценки агглютинации Klebsiella pneumoniae O5K57, штамма 4425, и O1 K22, штамма 170381, за счет кроличьей иммунной сыворотки к разным конструктам слитого белка MrkA-ризавидина: Rhavi-FlaB-D2-MrkA и Rhavi-PcrV-MrkA приведены в Таблице 14. Титры для 3 отдельных кроличьих иммунных сывороток, специфических для каждого конструкта, после второй (P2) и третьей (P3) иммунизаций представляют собой максимальное разведение сыворотки с поддающейся обнаружению агглютинацией. В этом эксперименте агглютинированным комкам позволяют оседать, и количество оставшихся (не агглютинированных) бактерий измеряют на основании оптической плотности (OD) при 600 нм. MrkA-специфические антитела, индуцированные 2 конструктами, Rhavi-FlaB-D2-MrkA и Rhavi-PcrV-MrkA, узнавали MrkA, экспрессированный на обоих штаммах Klebsiella, это указывало на то, что компонент MrkA в этих 2 слитых белках имеет правильную укладку и вызывает ответ в виде продуцирования функциональных антител.

Таблица 14: Агглютинация бактерий Klebsiella, вызываемая антителами, специфическими для MrkA СБ ризавидина

Белковый конструкт	Кролик №	Наибольшее разведение сыворотки с обнаруживаемой агглютинацией
Белковый конструкт	Кролик №	KP 4425 O5 K57	KP 170381 O1 K22
P2	P3	P2	P3
Rhavi-FlaB-D2-MrkA-His	AFV800	10³	10⁵	10²	10³
Rhavi-FlaB-D2-MrkA-His	AFV801	10⁴	10⁵	10³	10⁵
AFV802	10⁴	10⁴	10²	10⁴
Rhavi-PcrV-MrkA-His	AFV803	10³	10⁴	10²	10⁴
Rhavi-PcrV-MrkA-His	AFV804	10⁴	10⁵	10²	10⁵
AFV805	10⁴	10⁴	10²	10⁴

Пример 8: Мышиные модели термического ожога и бактериемии, вызываемой P. aeruginosa

Модели термического ожога и бактериемии создавали, как описано, с модификациями (Neely et al., 2002). Для термического ожога 11-недельным аутбредным мышам CD-1 выбривали спину, и использовали анестезию кетамином и ксилазином перед наложением шаблона из термоустойчивого полимера с отверстием размером 1 на 1,5 дюйма. Эта платформа была разработана для создания термического ожога 12-15% поверхности тела. Этанол (0,5 мл, 100%) равномерно распределяли по поверхности спины, ограниченной окном, поджигали и оставляли гореть в течение ровно 10 секунд, после чего пламя гасили. Сразу после ожога мыши получали 0,5 мл стерильного нормального солевого раствора для гидратации. P. aeruginosa затем инъецировали п/к под ожоговую рану. Рану оставляли без покрытия. Животных внимательно наблюдали в течение 14 дней после инфицирования в отношении смертности и нагрузки органов (то есть отдаленное распространение инфекции).

Для оценки эффективности кроличьих антител против FlaB Pseudomonas использовали мышиную модель сепсиса от ожоговой раны (Cryz et al., 1984). В данной модели мышам CD1 наносили ожог, как описано выше, и 28 КОЕ P. aeruginosa штамма M2 (O5:FlaB) (инфекция ожоговой раны LD₅₀ <1×10²) вводили инъекцией в ожоговую рану. Мышам CD-1 вводили в/б инъекцией PBS, преиммунную или анти-FlaB сыворотку перед инфицированием ожоговой раны. Как показано на графиках Каплана-Мейера выживаемости на Фигуре 26, мыши были защищены за счет анти-FlaB в течение 10 дней или более после заражения раны FlaB-экспрессирующей Pseudomonas штамма M-2, в то время как все мыши из других групп погибли вследствие заражения раны.

В модели бактериемии 7-недельным мышам BALB/c вводили контрольные IgG или индуцируемое вакциной антитело в/б инъекцией за 24 ч до в/в заражения K. pneumoniae или P. aeruginosa. В зависимости от микроорганизма у животных собирали кровь с определенными интервалами в течение 1-4 ч для контролирования клиренса из крови, с последующей эвтаназией мышей и сбором печени и селезенки через 1-24 ч после инфицирования.

Пример 9: Анализы защиты мышей

Мышиная модель клиренса и нагрузки органов

Способность KP OPS-специфического антитела предотвращать инфекцию Klebsiella тестировали в мышиной модели клиренса и нагрузки органов. Мышам CD1 (группы из 3) вводили в/б инъекцией кроличью сыворотку против KPO1 BP-2a OPS-PRO-CN MAPS, а затем вводили (в/в) Klebsiella KP B5055 O1 (9×10⁴ КОЕ). Количество жизнеспособных KP в селезенке измеряли через 14 ч после заражения. Наблюдали значительное уменьшение количества жизнеспособных KP в селезенке мышей, получавших иммунную сыворотку (P2), в сравнении с селезенкой мышей, получавших преиммунную сыворотку (P0) (Фигура 27). Эти данные указывают на то, что O1 OPS-специфическое антитело, индуцированное OPS BP-2a MAPS вакциной, обладало способностью вызывать клиренс микроорганизмов из селезенки мышей, таким образом, оно является защитным против инфекции, вызываемой Klebsiella.

KP (O1: K2), выращенные в салицилате натрия

Klebsiella pneumoniae штамма B5055 (O1: K2) выращивали в течение ночи в бульоне HySoy, содержащем 2,5 мМ салицилат натрия (Sigma), для уменьшения экспрессии CPS (Domenico, 1989). 12 мл бульона HySoy с 2,5 мМ салицилатом натрия инокулировали 5% ночной культуры, которую затем выращивали до середины логарифмической фазы роста (37 C со встряхиванием). Бактерии осаждали центрифугированием, затем ресуспендировали в стерильном PBS до концентрации приблизительно 1×10⁸ КОЕ/мл. Концентрированные бактерии разбавляли в PBS до 2×10⁵ КОЕ/мл. Через 1 ч после в/б введения 0,1 мл кроличьей сыворотки самкам мышей CD-1 в возрасте 8-12 недель вводили в/б инъекцией 2×10⁴ КОЕ B5055 в 0,1 мл. Мышей контролировали в отношении смертности в течение 7 дней.

В эксперименте 1 мышам CD1 вводили 0,1 мл кроличьей иммунной сыворотки против KP O1 OPS BP-1; BP-2a PRO-CN MAPS или УН KP O1: K2 (разведение 1/10) в/б за 1 ч до в/б введения 2×10⁴ бактерий KP O1 B5055. Результаты эксперимента приведены в Таблице 15.

Таблица 15: Пассивная защита мышей в случае микроорганизмов KP O1: K2, выращенных в салицилате натрия

Сыворотка	Выживаемость мышей	ELISA титр
Эксперимент 1	Эксперимент 2
PBS	0 из 5	0 из 5	0
P0 BP-1	1 из 4	0 из 5	57
P2 BP-1	0 из 5	2 из 5	537
P0 BP-2a	0 из 5	2 из 5	54
P2 BP-2a	5 из 5	4 из 5	11973
УН, контроль*	5 из 5	3 из 5	27343
*Кроличья иммунная сыворотка против УН микроорганизма KP O1 в качестве положительного контроля была введена в разведении 1/10

В эксперименте 1 иммунная сыворотка против УН бактерий KP O1 в качестве положительного контроля и иммунная сыворотка против KP O1 OPS BP-2 PRO-CN MAPS обеспечивали полную защиту против заражения KP O1: K2 (B5055), в то время как контроль PBS и иммунная сыворотка против KP O1 OPS BP-1 PRO-CN MAPS не защищали мышей.

В эксперименте 2 мышам CD1 (5/группу) вводили в/б инъекцией 0,1 мл объединенной кроличьей иммунной или преиммунной сыворотки, с последующим в/б бактериальным заражением 2×10⁴ бактериями KP O1 B5055. Мыши получали PBS и сыворотку против УН KP O1 (разведение 1/10) в качестве отрицательного и положительного контроля, соответственно. Все сыворотки против KP O1 OPS PRO-CN MAPS были способны оказывать защитный эффект в данной модели, хотя мыши, которые получали BP-2a (4 из 5) значительно лучше выживали при заражении. Сыворотка против KP O1 OPS BP-1 PRO-CN MAPS оказывала некоторый защитный эффект, с выживанием 2 из 5 мышей. Ни одна из мышей, получавших PBS, не выжила при заражении. Эти результаты выживаемости хорошо согласуются и хорошо коррелируют с уровнями анти-KP O1 OPS-специфических IgG при определении титров методом ELISA (то есть, более высокую степень защиты наблюдали при более высоких уровнях антитела).

Пассивная защита от микроорганизма Pseudomonas в мышиной модели

Способность PA OPS-специфического антитела предотвращать инфекцию Pseudomonas тестировали в мышиной модели выживания при пассивной защите, с использованием мышей CD1, зараженных в/б введением PA штамма 17002 (O10), наряду с D-галактозамином для сенсибилизации животных к летальным эффектам эндотоксина (Galanos et al., 1979) и для придания им большей чувствительности к инфекции. Мыши получали кроличьи антитела против 2-валентного PA O6/O10 BP-1 PRO-CN MAPS (кролик AFV624 или AFV629, в/б введение) за 1 ч до заражения (1×10⁶ КОЕ) и D-галактозамин. Результаты приведены в Таблице 16. В этом исследовании защиты иммунная сыворотка против PA O6/O10 2-в BP-1 PRO-CN MAPS (AFV624; P2) защищала на 40% больше мышей от PA O10 штамма 17002, в сравнении с преиммунной сывороткой (AFV624 P0). Аналогично, иммунная сыворотка против PA O6/O10 2-в BP-1 PRO-CN MAPS (AFV629; P2) защищала на 40% больше мышей от PA O10 штамма 17002, в сравнении с преиммунной сывороткой (AFV629 P0). Кроличья иммунная сыворотка с высокими титрами, полученная против убитых нагреванием бактерий PA O10, в качестве положительного контроля оказывала значительный защитный эффект в сравнении с контролем PBS. Преиммунная сыворотка от некоторых кроликов, возможно, обеспечивала некоторую защиту в сравнении с PBS (AFV624 P0). Судя по всему, наблюдалась некоторая корреляция между уровнями защиты (выживание) и уровнями индуцированного вакциной PA O10 OPS-специфического IgG антитела при измерении методом ELISA (Таблица 16).

Таблица 16: Пассивная защита у мышей, которым вводили PA O10 штамма 17002 и D-галактозамин, в группе с антителами против 2-валентного PA O6/O10 BP-1 PRO-CN MAPS.

Группа	Выживаемость	ELISA ТИТР, PA O10 OPS (ELISA ед./мл)
PBS контроль	0/5
Против убитых нагреванием O10	4/5	7745537
Кролик AFV624, P0	2/5	12,5
Кролик AFV624, P2	4/5	15246
Кролик AFV629, P0	0/5	12,5
Кролик AFV629, P2	2/5	3955

На Фигуре 28 представлен график Каплана-Мейера выживаемости при пассивной защите мышей введенной кроличьей сывороткой против KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS перед инфицированием их Klebsiella штамма B5055 (O1: K2), выращенными в салицилате для уменьшения экспрессии капсулы. Мышам CD1 (5/группу) вводили в/б 0,1 мл объединенной кроличьей иммунной (P2) или преиммунной (P0) сыворотки, с последующим в/б бактериальным заражением 2×10⁴ КОЕ Klebsiella штамма B5055 (O1: K2). Показаны графики Каплана-Мейера выживаемости для мышей, получавших P0 или P2 сыворотку против KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS. Сыворотка P2 защищала животных в модели, с выживанием мышей, получавших сыворотку против KPO1 BP-1 OPS-PRO-CN MAPS, в большем количестве и в течение более длительного времени, чем мышей, получавших сыворотку P0.

Пример 10: Иллюстративные мультивалентные иммуногенные композиции

Иллюстративная 4-валентная KP вакцина

Отдельно готовили 4 разных иммуногенных комплекса, а затем формулировали совместно, получая иллюстративную 4-валентную KP вакцину.

Каждый комплекс включал полимер BP-1, полученный путем конъюгации OPS из одного бактериального серотипа KP с окисленным полисахаридом K19, с последующим биотинилированием полисахарида K19. Затем их объединяли в комплексе со слитым белком-носителем ризавидина. Компоненты каждого из этих комплексов приведены в Таблице 17.

Таблица 17: Компоненты комплексов, включенных в иллюстративную 4-валентную KP вакцину.

Комплекс	BP-1 CPS	Патоген	Серотип	Белок-носитель
1	KP K19	Klebsiella	O1	Rhavi-FlaBD2-MrkA
2	KP K19	Klebsiella	O2	Rhavi-FlaBD2-MrkA
3	KP K19	Klebsiella	O3	Rhavi-FlaBD2-MrkA
4	KP K19	Klebsiella	O5	Rhavi-FlaBD2-MrkA

Эти четыре комплекса формулировали совместно с адъювантом, как описано ниже в Таблице 21.

Иллюстративная 8-валентная PA вакцина

Отдельно готовили 8 разных иммуногенных комплексов, а затем формулировали совместно, получая иллюстративную 8-валентную PA вакцину.

Каждый комплекс включал полимер BP-1, полученный путем конъюгации OPS из одного бактериального серотипа PA с окисленным полисахаридом K19, с последующим биотинилированием полисахарида K19. Затем их объединяли в комплексе со слитым белком-носителем ризавидина. Компоненты каждого из этих комплексов приведены в Таблице 18.

Таблица 18: Компоненты комплексов, включенных в иллюстративную 8-валентную PA вакцину.

Комплекс	BP-1 CPS	OPS	Слитый белок-носитель ризавидина
1	KP K19	PAO1	Rhavi-FlaBD2-MrkA
2	KP K19	PAO2	Rhavi-FlaBD2-MrkA
3	KP K19	PAO3	Rhavi-FlaBD2-MrkA
4	KP K19	PAO4	Rhavi-FlaBD2-MrkA
5	KP K19	PAO5	Rhavi-FlaBD2-MrkA
6	KP K19	PAO6	Rhavi-FlaBD2-MrkA
7	KP K19	PAO10	Rhavi-FlaBD2-MrkA
8	KP K19	PAO11	Rhavi-FlaBD2-MrkA

Эти восемь комплексов формулировали совместно с адъювантом, как описано ниже в Таблице 21.

Иллюстративная 12-валентная KP/PA вакцина 1

Отдельно готовили 12 разных иммуногенных комплексов, а затем формулировали совместно, получая иллюстративную 12-валентную KP/PA вакцину 1.

Каждый комплекс включал полимер BP-1, полученный путем конъюгации OPS с окисленным полисахаридом K19, с последующим биотинилированием полисахарида K19. Затем их объединяли в комплексе со слитым белком-носителем ризавидина. Компоненты каждого из этих комплексов приведены в Таблице 19.

Таблица 19: Компоненты комплексов, включенных в иллюстративную 12-валентную KP/PA вакцину 1.

Комплекс	BP-1 CPS	OPS	Слитый белок-носитель ризавидина
1	KP K19	KPO1	Rhavi-FlaBD2-MrkA
2	KP K19	KPO2	Rhavi-FlaBD2-PcrV
3	KP K19	KPO3	Rhavi-FlaBD2-MrkA
4	KP K19	KPO5	Rhavi-FlaBD2-PcrV
5	KP K19	PAO1	Rhavi-FlaBD2-PcrV
6	KP K19	PAO2	Rhavi-FlaBD2-PcrV
7	KP K19	PAO3	Rhavi-FlaBD2-PcrV
8	KP K19	PAO4	Rhavi-FlaBD2-PcrV
9	KP K19	PAO5	Rhavi-FlaBD2-MrkA
10	KP K19	PAO6	Rhavi-FlaBD2-MrkA
11	KP K19	PAO10	Rhavi-FlaBD2-MrkA
12	KP K19	PAO11	Rhavi-FlaBD2-MrkA

Эти двенадцать комплексов формулировали совместно с адъювантом, как описано ниже в Таблице 21.

Иллюстративная 12-валентная KP/PA вакцина 2

Отдельно готовили 12 разных иммуногенных комплексов, а затем формулировали совместно, получая иллюстративную 12-валентную KP/PA вакцину 2.

Таблица 20: Компоненты комплексов, включенных в иллюстративную 12-валентную KP/PA вакцину 2.

Комплекс	BP-1 CPS	OPS	Слитый белок-носитель ризавидина
1	KP K19	KPO1	Rhavi-FlaBD2-MrkA
2	KP K19	KPO2	Rhavi-FlaBD2-MrkA
3	KP K19	KPO3	Rhavi-FlaBD2-MrkA
4	KP K19	KPO5	Rhavi-FlaBD2-MrkA
5	KP K19	PAO1	Rhavi-FlaBD2-MrkA
6	KP K19	PAO2	Rhavi-FlaBD2-MrkA
7	KP K19	PAO3	Rhavi-FlaBD2-MrkA
8	KP K19	PAO4	Rhavi-FlaBD2-MrkA
9	KP K19	PAO5	Rhavi-FlaBD2-MrkA
10	KP K19	PAO6	Rhavi-FlaBD2-MrkA
11	KP K19	PAO10	Rhavi-FlaBD2-MrkA
12	KP K19	PAO11	Rhavi-FlaBD2-MrkA

Эти двенадцать комплексов формулировали совместно с адъювантом, как описано ниже в Таблице 21.

Пример 11: Исследования иммунизации кроликов 12-валентной вакциной против P. aeruginosa/K. pneumoniae

Иммунизация животных

Перед иммунизацией кроликов иллюстративную 4-валентную KP вакцину, иллюстративную 8-валентную PA вакцину, иллюстративную 12-валентную KP/PA вакцину 1 и иллюстративную 12-валентную KP/PA вакцину 2 формулировали с адъювантом приблизительно за 48 ч до инъекции. Комплексы адсорбировали на адъюванте в конечной концентрации 10 мкг/мл для дозы PS 5 мкг, и 2 мкг/мл для дозы PS 1 мкг, каждого серотипа BP-1, либо отдельно, либо в виде мультивалентной смеси, с 40 мМ гистидином, pH 5,5, 150 мМ NaCl и 1,25 мг/мл гелем фосфата алюминия, с перемешиванием путем переворачивания в течение ночи при 4°C. Эти составленные смеси использовали непосредственно для иммунизации в объеме 0,5 мл на дозу. Сводная информация по составу иллюстративной 4-валентной KP вакцины, иллюстративной 8-валентной PA вакцины, иллюстративной 12-валентной KP/PA вакцины 1 и иллюстративной 12-валентной KP/PA вакцины 2 приведена в Таблице 21.

Таблица 21: Сводная информация по вакцинным препаратам, используемым в исследовании NCB012 на кроликах.

Группа	Вакцина	Патоген	Белок-носитель	Серотип	Доза PS (всего)	Отношение Белок:PS (суммарный белок)	Адъювант	Кролики
1	12-валентная KP/PA вакцина 2 5 мкг PS на BP	Pseudomonas	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11	5 мкг (60 мкг)	3:1 (180 мкг)	625 мкг AlPO₄	10
Klebsiella	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O1, O2, O3, O5
2	12-валентная KP/PA вакцина 2 1 мкг PS на BP	Pseudomonas	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11	1 мкг (12 мкг)	3:1 (36 мкг)	625 мкг AlPO₄	10
Klebsiella	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O1, O2, O3, O5
3	8-валентная, PA	Pseudomonas	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11	5 мкг (40 мкг)	3:1 (120 мкг)	625 мкг AlPO₄	10
4	4-валентная, KP	Klebsiella	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O1, O2, O3, O5	5 мкг (20 мкг)	3:1 (60 мкг)	625 мкг AlPO₄	10
5	12-валентная KP/PA вакцина 1 5 мкг PS на BP	Pseudomonas	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O5, O6, O10, O11	5 мкг (60 мкг)	3:1 (180 мкг)	625 мкг AlPO₄	10
		Klebsiella	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O1, O3
		Pseudomonas	Rhavi-FlaBD2-PcrV-his	O1, O2, O3, O4
Klebsiella	Rhavi-FlaBD2-PcrV-his	O2, O5
6	12-валентная KP/PA вакцина 1 1 мкг PS на BP	Pseudomonas	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O5, O6, O10, O11	1 мкг (12 мкг)	3:1 (36 мкг)	625 мкг AlPO₄	10
		Klebsiella	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O1, O3
		Pseudomonas	Rhavi-FlaBD2-PcrV-his	O1, O2, O3, O4
Klebsiella	Rhavi-FlaBD2-PcrV-his	O2, O5

12-валентную KP/PA вакцину 1 вводили экспериментальным группам 5 и 6 (с FlaBD2-MrkA и FlaBD2-PcrV в качестве белков-носителей), и 12-валентную KP/PA вакцину 2 вводили экспериментальным группам 1 и 2 (с FlaBD2-MrkA в качестве белка-носителя). Для сравнения в данное исследование были включены две дополнительные экспериментальные группы, которые получали 8-валентную PA вакцину или 4-валентную KP вакцину. Экспериментальная группа 3 получала 8-валентную PA вакцину, и экспериментальная группа 4 получала 4-валентную KP вакцину. Группы 1, 3, 4 и 5 получали 5 мкг каждого полисахарида (PS) в вакцине, и экспериментальные группы 2 и 6 получали более низкую дозу 1 мкг каждого PS в вакцине. Все вакцины содержали одинаковое количество фосфата алюминия в качестве адъюванта (625 мкг).

Проводили две в/м иммунизации (0,5 мл) с 4-недельным интервалом 4-месячным кроликам линии New Zealand White (Cocalico Biologicals, n=10 на группу). Образцы крови собирали через 4 недели после первой иммунизации и через 2 недели после второй иммунизации.

Иммунные ответы на OPS

Иммунные ответы на KP OPS в 12-валентной KP/PA вакцине 1 в сравнении с 4-валентной KP вакциной

На Фигуре 29 представлены результаты конечных ELISA титров IgG против KP OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 (доза 5 мкг, экспериментальная группа 5), в сравнении с 4-валентной KP вакциной (доза 5 мкг, экспериментальная группа 4).

Был продемонстрирован сильный IgG-ответ на все серотипы KP OPS вакцины (а также на KP19 CPS), без существенных различий в титрах для KP OPS каждого типа в 4-валентной KP вакцине, и в титрах IgG для каждого из соответствующих KP OPS в 12-валентной KP/PA вакцине 1. Наблюдалась тенденция к слегка более сильному ответу на KP OPS, индуцированному 12-валентной KP/PA вакциной 1. Эти результаты также указывают на то, что отсутствует какая-либо отрицательная интерференция в иммунных ответах на каждый из KP OPS в 4-валентной KP вакцине при ее объединении с дополнительными 8 PA OPS, которые включены в 12-валентную KP/PA вакцину 1 (все изготовлены в виде BP-1 MAPS).

Иммунные ответы на PA OPS в 12-валентной KP/PA вакцине 1 в сравнении с 8-валентной PA вакциной

На Фигуре 30 представлены результаты конечных ELISA титров IgG против PA OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 (доза 5 мкг, экспериментальная группа 5), в сравнении с 8-валентной PA вакциной (доза 5 мкг, экспериментальная группа 3).

Как наблюдалось в случае ответа на KP OPS, были продемонстрированы сильные IgG-ответы на все серотипы PA OPS вакцины, без существенных различий в титрах для PA OPS каждого типа в 8-валентной PA MAPS вакцине, и в титрах IgG для каждого из соответствующих PA OPS в 12-валентной KP/PA вакцине 1. Эти результаты также указывают на то, что отсутствует какая-либо отрицательная интерференция в иммунных ответах на каждый из PA OPS 8-валентной вакцины при ее объединении с дополнительными 4 KP OPS в 12-валентной KP/PA вакцине 1 (все изготовлены в виде BP-1 MAPS). Сильные IgG-ответы также были продемонстрированы на каждый из PA OPS после одной иммунизации (P1) без существенного возрастания после второй иммунизации (P2).

Иммунные ответы на 12-валентную KP/PA вакцину 1 при двух разных уровнях дозы

На Фигуре 31 представлены результаты ELISA конечных титров IgG против PA OPS в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 в дозе 5 мкг PS от каждого типа BP в дозе вакцины (экспериментальная группа 5) в сравнении с 12-валентной KP/PA вакциной 1 в дозе 1 мкг PS от каждого типа BP в вакцине (экспериментальная группа 6).

Никаких существенных отличий в титрах IgG к PA и KP OPS не наблюдали в случае 12-валентной KP/PA вакцины 1 при сравнении экспериментальных групп, получавших дозу 5 мкг и дозу 1 мкг, после одной (P1) или после двух иммунизаций (P2), за исключением KP O3, когда после второй иммунизации наблюдали улучшенный IgG-ответ.

Отдельные результаты ELISA титров OPS-специфических IgG для 12-валентной KP/PA вакцины 1 через 28 дней после первой иммунизации (P1) и через 14 дней после второй иммунизации (P2) представлены на Фигуре 32 и Фигуре 33. Сильные IgG-ответы на все 12 серотипов OPS вакцины, а также на KP K19 CPS, продемонстрированы для 12-валентной KP/PA вакцины 1 в дозе 5 мкг (Фигура 32) и в дозе 1 мкг (Фигура 33). Однако, хотя ответы были сильными, интенсивность IgG-ответа на OPS KPO2 и KPO3 не была такой сильной, как в случае ответа на KPO1 и KPO5, особенно после первой иммунизации. Наиболее сильный ответ наблюдали для KO K19.

Сравнение индивидуальной x-кратной индукции анти-OPS IgG при использовании 12-валентной KP/PA вакцины 1 проводили для экспериментальной группы с дозой 5 мкг. Результаты представлены на Фигуре 34. За исключением двух отклоняющихся результатов, у всех животных наблюдали по меньшей мере 4-кратную индукцию ELISA титров относительно исходного уровня (P2/P0) для каждого из серотипов OPS. В среднем, 20-кратная индукция была превышена для всех серотипов OPS в случае 12-валентной KP/PA вакцины 1. Наибольшую индукцию наблюдали для KO 19.

На Фигура 35 приведены результаты сравнения индивидуальной x-кратности индукции анти-OPS IgG, при определении титров методом ELISA, относительно исходного уровня (P2/P0) для 12-валентной KP/PA вакцины 1 в дозе 5 мкг и дозе 1 мкг. Интересно, что у всех животных из экспериментальной группы с дозой 1 мкг наблюдали по меньшей мере 4-кратное увеличение относительно исходного уровня, как уже описано для экспериментальной группы с дозой 5 мкг. Средняя x-кратность увеличения титров IgG для всех серотипов OPS, включенных в 12-валентную KP/PA вакцину 1, превышала 20-кратное увеличение относительно исходного уровня для всех серотипов OPS при дозе 5 мкг, а также дозе 1 мкг, введенных животным. Наибольшую кратность индукции наблюдали для KO K19 при обоих уровнях дозы, и наименьшие показатели x-кратности индукции наблюдали для KP O2 и KP O3.

Иммунные ответы на 12-валентную KP/PA вакцину 2 при двух разных уровнях дозы

На Фигуре 36 представлены результаты сравнения ответов на KP/PA OPS в объединенной сыворотке через 28 дней после первой вакцинации (P1) и через 14 дней после второй вакцинации (P2) от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 2. Примечательно, что в экспериментальной группе с дозой 5 мкг вакцина индуцировала сильный IgG-ответ на все серотипы OPS после первой иммунизации, без существенного увеличения титров после второй иммунизации, за исключением KP O2 и KP O3 OPS. Для этих серотипов OPS вторая иммунизация приводила к значительному увеличению титров. IgG-ответы на OPS были эквивалентными в экспериментах группах с дозой 5 мкг и дозой 1 мкг, за исключением KP O3 OPS, когда наблюдали меньший иммунный ответ при более низкой дозе.

Индивидуальные полученные методом ELISA титры OPS-специфических IgG для 12-валентной KP/PA вакцины 2 через 28 дней после первой иммунизации (P1) и через 14 дней после второй иммунизации (P2) представлены на Фигуре 37 и Фигуре 38. Сильные IgG-ответы на все 12 серотипов OPS вакцины, а также на KP K19 CPS, продемонстрированы для 12-валентной KP/PA вакцины 2 в дозе 5 мкг (Фигура 37) и в дозе 1 мкг (Фигура 38). Титры для каждого из серотипов OPS дополнительно возрастали через 14 дней после второй вакцинации. Однако величина этого увеличения была незначительной, за исключением KP O3. Как наблюдали в случае 12-валентной KP/PA вакцины 1, различие в иммунном ответе между экспериментальными группами с дозой 5 мкг и дозой 1 мкг было минимальным. Самые высокие титры наблюдали для серотипа OPS KO K19, и самые низкие титры наблюдали для KP O2 и KP O3.

Резюме результатов определения иммунного ответа на OPS для 12-валентной KP/PA вакцины 1 и 12-валентной KP/PA вакцины 2

Анти-OPS иммунные ответы на все PA OPS 12-валентной KP/PA вакцины 1 в объединенной кроличьей сыворотке были эквивалентны тем, которые наблюдали в случае 8-валентной PA MAPS вакцины.

Анти-OPS иммунные ответы на все KP OPS 12-валентной KP/PA вакцины 1 в объединенной кроличьей сыворотке были аналогичными, или слегка лучшими, чем ответы в случае 4-валентной KP MAPS вакцины.

Приблизительно 200-кратное увеличение относительно исходного уровня наблюдали для антител против PA OPS, и приблизительно 50-кратное увеличение относительно исходного уровня наблюдали для антител против KP OPS.

Антитела в экспериментальных группах с 5 мкг PS на дозу BP и 1 мкг PS на дозу BP в объединенных сыворотках были аналогичными в случае 12-валентной KP/PA вакцины 1 и 12-валентной KP/PA вакцины 2, за исключением KP O3.

Анализ индивидуальных сывороток в экспериментальных группах с 5 мкг PS на дозу BP и 1 мкг PS на дозу BP в случае 12-валентной KP/PA вакцины 1 показал сильный ответ на все KP и PA OPS после одной иммунизации, с очень небольшим увеличением после второй иммунизации, за исключением ответа на KP O2 и KP O3 OPS, где вторая иммунизация приводила к значительному увеличению титров IgG антител.

Анализ индивидуальных сывороток в экспериментальных группах с 5 мкг PS на дозу BP и 1 мкг PS на дозу BP в случае 12-валентной KP/PA вакцины 2 также показал сильный ответ на все KP и PA OPS после одной иммунизации, с очень небольшим увеличением после второй иммунизации, за исключением ответа на KP O3 OPS, где вторая иммунизация приводила к значительному увеличению титров IgG.

Эффективность белка-носителя

Ответ в виде выработки антител на белки-носители

Были оценены ответы в виде выработки антител на белок-носитель, индуцированные 12-валентной KP/PA вакциной 1 с FlaBD2-MrkA и FlaBD2-PcrV в качестве белков-носителей и 12-валентной KP/PA вакциной 2 только с FlaBD2-MrkA в качестве белка-носителя. Ответы на белки-носители у отдельных кроликов выражали в виде ELISA единиц IgG для преиммунных (P0) уровней и уровней, достигнутых после одной (P1) и двух иммунизаций (P2). Анализ методом ELISA IgG у отдельных кроликов на белки-носители определяли с использованием соответствующих индивидуальных рекомбинантных белков в качестве покрывающих антигенов (то есть, FlaBD2, MrkA и PcrV). В каждом анализе ответы на компоненты белков-носителей сравнивали для вакцин 1 и 2 с ответами на 8-валентную PA FlaBD2-MrkA вакцину и 4-валентную KP FlaBD2-MrkA вакцину. Информация о дозах вакцин и экспериментальных группах приведена в Таблице 21.

(a) Результаты ELISA для различных белков-носителей

Результаты ELISA для титров IgG к FlaB-D2 представлены на Фигуре 39. Сильное увеличение титров IgG наблюдали после первой иммунизации, с последующим вторым увеличением титров после второй иммунизации, во всех сравниваемых группах. Уровни антител после каждой вакцинации были сходными у всех групп, двух групп с разными дозами (1 мкг или 5 мкг суммарных PS от комплекса каждого типа, присутствующего в вакцинной композиции, например, всего 12 мкг или 60 мкг PS в композициях 12-валентной KP/PA вакцины 1 и вакцины 2) для 12-валентной KP/PA вакцины 1 и 12-валентной KP/PA вакцины 2, а также групп 8-валентной PA вакцины и 4-валентной KP вакцины (каждая с 5 мкг каждого PS в вакцине, например, всего 40 мкг или 20 мкг PS в вакцине, соответственно).

Результаты ELISA для титров IgG к MrkA представлены на Фигуре 40. Как и в случае FlaBD2, сильное увеличение титров IgG наблюдали после первой иммунизации у всех групп, с аналогичным увеличением в каждой группе, двух групп с разными дозами (1 мкг или 5 мкг суммарных PS от комплекса каждого типа, присутствующего в вакцине) для 12-валентной KP/PA вакцины 1 и 12-валентной KP/PA вакцины 2, а также групп 8-валентной PA вакцины и 4-валентной KP вакцины (каждая с 5 мкг PS от комплекса каждого типа в вакцине).

На Фигуре 41 представлены результаты ответа в виде выработки антител против PcrV после иммунизации 12-валентной KP/PA вакциной 1 в дозе 1 мкг и дозе 5 мкг каждого PS в вакцине. IgG-ответ был сильным после первой иммунизации, с дополнительным возрастанием титров после второй вакцинации. Однако ответы были сходными в группах двух доз.

Ответы на белок-носитель, индуцированные 12-валентной KP/PA вакциной 1 с FlaBD2-MrkA и FlaBD2-PcrV в качестве белков-носителей, 12-валентной KP/PA вакциной 2 с FlaBD2-MrkA в качестве белка-носителя, 8-валентной PA вакциной (FlaBD2-MrkA) и 4-валентной KP вакциной (FlaBD2-MrkA), выраженные в виде x-кратности изменения титров, определенных методом ELISA, относительно преиммунных (P0) уровней, после одной (P1) и двух иммунизаций (P2) представлены на Фигуре 42.

Были продемонстрированы сильные ответы на каждый из белков-носителей FlaBD2, MrkA и PcrV в 12-валентной KP/PA вакцине 1, с более чем 30-кратным изменением после первой иммунизации и 500-кратным изменением после второй иммунизации. Никакие существенные отличия в иммуногенности трех белков не были обнаружены между группами с дозой 5 мкг и дозой 1 мкг.

Наблюдали сильный IgG-ответ на каждый из двух белковых компонентов уже после одной иммунизации, с увеличением, превышающим 30-кратное, для двух компонентов слитого белка FlaBD2 и MrkA в 12-валентной KP/PA вакцине 2. Дополнительное значительное увеличение наблюдали после второй иммунизации, которое превышало 1000-кратное увеличение. Никакие существенные отличия не наблюдали в x-кратности изменений для FlaBD2 и MrkA между группами с дозой 5 мкг и дозой 1 мкг.

Не наблюдали никакие существенные отличия в иммуногенности двух компонентов FlaBD2 и MrkA между группами, которые получали 8-валентную PA вакцину или 4-валентную KP вакцину. Однако эти ответы были слегка ниже в группе 4-валентной вакцины в сравнении с ответами в группе 12-валентной KP/PA вакцины 2 и группе 8-валентной PA вакцины.

(b) Сравнение x-кратности изменения IgG-ответов на различные белки-носители в трех исследованиях

Сравнение x-кратности изменения IgG-ответов на FlaB проводили для результатов, полученных в трех исследованиях иммуногенности на кроликах: NCB007, NCB008 и NCB012. В NCB007 дозу 5 мкг 6-валентной PA FlaBD2-MrkA (содержащей PA O1, O2, O3, O6, O10 и O11 OPS) сравнивали с эквивалентной дозой 6-валентной PA FlaB-PcrV, в NCB008 дозу 5 мкг сравнивали между 4-валентной (O1, O2, O3, O5) KP FlaBD2-MrkA и 4-валентной KP FlaB-PcrV, и в NCB012 дозу 5 мкг сравнивали между 12-валентной KP/PA вакциной 2 с FlaBD2-MrkA и 12-валентной KP/PA вакциной 1 с FlaBD2-MrkA и FlaBD2-PcrV. Все вакцины имели каркас типа BP-1. Результаты в виде x-кратности изменений представлены на Фигуре 43, Фигуре 44 и Фигуре 45.

На Фигуре 43 показана x-кратность изменения IgG-ответов на FlaB, с максимальным увеличением ответа на 12-валентную KP/PA вакцину 1 и 12-валентную KP/PA вакцину 2. Хороший ответ наблюдали уже после первой иммунизации, с дополнительным увеличением после второй иммунизации. Изучение ответов на 4-валентный KP FlaBD2-MrkA и 4-валентный FlaB-PcrV комплексы в NCB008 показало хороший ответ после первой иммунизации, с небольшим дополнительным увеличением после второй иммунизации, на FlaBD-2-MrkA, и практически полное отсутствие ответа после любой иммунизации на FlaB-PcrV. Слабый ответ на FlaB также наблюдали в случае 6-валентного комплекса PA FlaBD2-MrkA в NCB007 после первой иммунизации, однако значительное увеличение имело место после второй вакцинации. Ответ на FlaB-PcrV в NCB007 был сильным после первой иммунизации, без дополнительного увеличения после второй иммунизации.

На Фигуре 44 показаны ответы на MrkA, с максимальным изменением ответа относительно исходного уровня в случае 12-валентной KP/PA вакцины 2 и 12-валентной KP/PA вакцины 1 в NCB012, в сравнении с ответами на 4-валентную KP FlaBD2-MrkA в NCB008 и 6-валентную PA FlaBD2-MrkA в NCB007. Почти никакого ответа не наблюдали для MrkA в NCB008 после первой и второй вакцинации, в то время как сильный ответ на MrkA наблюдали при использовании 6-валентной PA FlaBD2-MrkA после первой иммунизации и дополнительное увеличение ответа после второй иммунизации.

На Фигуре 45 показана x-кратность изменения IgG-ответа на PcrV, с максимальным увеличением в случае 12-валентной KP/PA вакцины 1 в исследовании NCB012 после первой и второй иммунизации. Почти никакого ответа на PcrV не наблюдали в случае 4-валентной KP FlaB-PcrV в исследовании NCB008. Сильный ответ на PcrV наблюдали после первой и второй иммунизации в исследовании NCB007.

- Сильный ответ в виде IgG антител на все три белка-носителя был продемонстрирован в случае 12-валентной KP/PA вакцины 1 и 12-валентной KP/PA вакцины 2.

- Ответы на белки-носители были аналогичными в группах с дозами 1 мкг и 5 мкг s.

- x-кратность изменения, полученная для каждого из трех белков-носителей, составляла приблизительно от 500 до 1000-кратного изменения в случае 12-валентной KP/PA вакцины 1.

- Имело место постоянное усиление ответа между первой и второй дозой у не подвергавшихся ранее воздействию животных. Без связи с какой-либо теорией, у взрослых, которые ранее подвергались воздействию, приблизительно максимальные ответы ожидаются после одной дозы и в пределах 7-10 дней.

- Имеющаяся ранее проблема с низкими ответами на MrkA и PcrV у животных, иммунизированных 4-валентной KP вакциной, отсутствовала в случае животных, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 или 12-валентной KP/PA вакциной 2.

Отсутствие биологической активности агониста TLR5 у белков-носителей, содержащих только FlaB2

На Фигуре 12B показана биологическая активность в отношении TLR5 у слитых белков и комплексов MAPS, содержащих белки FlaA и FlaB, с использованием клеток HEK293, экспрессирующих управляемый NF-kB люциферазный репортер. Активация TLR5 флагеллином вызывает усиление экспрессии репортера.

Установлено, что белки-носители KP/PA MAPS, содержащие только домен 2 FlaB (FlaBD2), лишены биологической активности агониста TLR5, как видно из результатов люциферазного анализа для FlaBD2-MrkA и FlaBD2-PcrV, представленных на Фигуре 46. FlaBD2-MrkA и FlaBD2-PcrV являются двумя белками-носителями в 12-валентной KP/PA вакцине 1.

Контрольный FlaB и слитый белок Rhavi-FlaB-his демонстрировали сильную биологическую активность агониста TLR5, в то время как FlaBD2, FlaBD2-MrkA и FlaBD2-PcrV, все содержащие лишь домен 2 FlaB (FlaBD2), не проявляли активность в этом анализе.

Широта спектра связывания в анализе FACS и агглютинация для не-OPS вакцинных штаммов

Штаммы KP и PA, не относящиеся к вакцинным серотипам OPS, тестировали методом проточной цитометрии и в анализах агглютинации для изучения широты покрытия антителами к 12-валентной KP/PA вакцине 1.

В Таблице 22 приведены результаты связывания в анализе FACS и бактериальной агглютинации не-OPS штаммов KP, полученные с объединенной сывороткой (AFV1502-1511) от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 в дозе 5 мкг каждого BP-1. Двенадцать из 14 протестированных штаммов демонстрировали явные отличия в узнавании P0 и P2 сыворотками в анализе агглютинации и в увеличении связывания бактерий, измеряемого методом проточной цитометрии при разведении сыворотки 1:100.

Таблица 22: Ответ на 12-валентную KP/PA вакцину 1 - связывание и агглютинация не-OPS вакцинных штаммов KP

Штамм	Страна происхождения	O-тип	Бактериальная агглютинация	Бактериальное связывание, проточная цитометрия	Наличие гена MrkA (ПЦР)
70721	США	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Нет	Нет	Нет
GN05275	США	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Да	Да	Да
NUH5575	Япония	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Да	Да	Да
170241	США	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Да	Да	Да
60111	США	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Да	Да	Да
5205	Южная Африка	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Да	Да	Да
7075	Южная Африка	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Да	Да	Да
7069	Южная Африка	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Да	Да	Да
11818/3	Мали	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Нет	Нет	Нет
9536/15	Мали	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Да	Да	Да
12287/3	Мали	НЕ (O1,O2,O3,O5)	Да	Да	Да
KP1015	Дания	O4	Да	Да	Да
NUH5218	Япония	O4	Да	Да	Да
EC1793	Сингапур	O4	Да	Да	Да

В Таблице 23 приведены результаты анализа методом FACS связывания, а также бактериальной агглютинации не-OPS штаммов PA, полученные с объединенной сывороткой (AFV1502-1511) от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 в дозе 5 мкг каждого BP-1. В случае флагеллина B имела место агглютинация 6 из 7 штаммов, и для 7 из 7 наблюдали связывание антитела методом проточной цитометрии. В случае флагеллина A1 для 3 из 4 штаммов наблюдали связывание антитела методом проточной цитометрии. В случае флагеллина A2 отсутствовали признаки узнавания антителом для 4 штаммов.

Таблица 23: Ответ на 12-валентную KP/PA вакцину 1 - связывание и агглютинация не-OPS вакцинных штаммов PA

Штамм	Страна происхождения	O-серотип (Medimabs)	Тип флагеллина	Бактериальная агглютинация	Бактериальное связывание, проточная цитометрия
12-01831	США	O8	A2	Нет	Нет
379/2014	Греция	O8	B	Да	Да
12-03320	США	O9	A1	Нет	Возможно
425/2015	Греция	O9	A2	Нет	Нет
PA0814	Дания	O9	A1	Нет	Да
NUH6346	Япония	O9	A2	Нет	Нет
CJLSG533	Япония	O9	B	Да	Да
197/2012	Греция	O12	B	Да	Да
12-04889	США	O14	B	Нет	Да
12-01852	США	O15	B	Да	Да
12-00232	США	O16	B	Да	Да
10024	Южная Африка	O16	A1	Нет	Нет
10-04727	США	O17	B	Да	Да
11-04251	США	O17	A1	Нет	Да
PA0002	Сингапур	Тип не определяем	A2	Нет	Нет

Четырнадцать штаммов KP и 15 штаммов PA, не относящихся к вакцинным серотипам OPS, были протестированы для определения широты покрытия антителами, полученными у кроликов к 12-валентной KP/PA вакцине 1. Краткое изложение:

- Выработанные антитела связывают и обеспечивают агглютинацию 12 из 14 не-OPS штаммов KP

- Серотипы, не содержащие ген MrkA, не связывают антитела

- Связывание этих штаммов, вероятно, происходит за счет направленных на MrkA антител

- Выработанные антитела связывают 10 из 15 не относящихся к вакцинным серотипам OPS штаммов PA:

- Связывание имеет место для штаммов с FlaB и некоторых штаммов с FlaA1

- Связывание, скорее всего, происходит за счет направленных на FlaB антител и вследствие перекрестной реактивности с FlaA1

- Антитела, направленные на белки-носители (FlaBD2 и MrkA), имеют широту покрытия, распространяющуюся на не-вакцинные OPS серотипы.

Пассивная защита у животных, обеспечиваемая антителами к белкам-носителям

Потенциальную способность белков-носителей обеспечивать пассивную защиту у мышей оценивали в модели инфекции ожоговой раны, вызываемой Klebsiella KP B5055 (O1: K2), с использованием анти-O1 сыворотки и анти-MrkA сыворотки, как указано в Таблице 24.

Результаты свидетельствуют о том, что существует тенденция к защитной роли MrkA (FlaBD2-MrkA) в предотвращении гибели животных, инфицированных инкапсулированным штаммом KP. В день 6 после заражения 60% (3/5) животных были все еще живы. Антитела к OPS O1 не обеспечивали защиту от инфекции в этом эксперименте.

Таблица 24: Защита от инфекции ожоговой раны, вызываемой KP B5055 (O1: K2), с использованием анти-O1 и анти-MrkA сывороток

Группа	Инфекция*	Воздействие	Выживаемость (D6)
1	B5055 (12 КОЕ/мышь)	PBS	33% (1/3)
2		Анти-KP O1 P0 сыворотка	50% (2/4)
3		Анти-KP O1 P2 сыворотка	20% (1/5)
4		Анти-MrkA P0 сыворотка	25% (1/4)
5		Анти-MrkA P2 сыворотка	60% (3/5)
6		Анти-KP O1+MrkA P0 сыворотка	25% (1/4)
7	Анти-KP O1+MrkA P2 сыворотка	40% (2/5)

*Мышам дважды пассивно переносили 200 мкл сыворотки, инфицировали п/к 12 КОЕ B5055 после нанесения ожоговой раны.

KPO1 антитело: Пул из 3 сывороток с наивысшим титром из NCB008 с FlaB-PcrV 4-валентным KP MAPS

MrkA антитело: Пул из 10 сывороток из NCB010 с FlaBD2-MrkA 1-в PA MAPS.

Краткое изложение результатов изучения эффективности двух белков-носителей в вакцинном препарате

- Показано, что белки-носители FlaBD2-MrkA и FlaBD2-PcrV в 12-валентной KP/PA вакцине 1 и 12-валентной KP/PA вакцине 2 являются сильными носителями для KP/PA OPS.

- Сильный ответ на белок наблюдали для FlaBD2-MrkA и FlaBD2-PcrV в 12-валентной KP/PA вакцине 1, а также для FlaBD2-MrkA в 12-валентной KP/PA вакцине 2.

- Широта покрытия для антител, направленных на белки-носители в 12-валентной KP/PA вакцине 1, распространялась на не-вакцинные OPS серотипы.

- В соответствии с экспериментальным дизайном FlaB, содержащего лишь домен 2 FlaB (FlaBD2), полное устранение активности агониста TLR5 было продемонстрировано для слитых белков-носителей FlaBD2.

- Первые результаты заражения в мышиной модели ожоговой раны, инфицированной Klebsiella, продемонстрировали тенденцию к защитной роли антител против MrkA.

Пример 12: Функциональные анализы 12-валентной P. aeruginosa/K. pneumoniae вакцины

Анализы опсонофагоцитарного уничтожения (ОФУ)

Анализы ОФУ с человеческими нейтрофилами

Анализ опсонофагоцитарного уничтожения (ОФУ) с человеческими нейтрофилами использовали для оценки функционального ответа объединенной кроличьей сыворотки (P2), полученной против 12-валентной KP/PA вакцины 1 в дозе 5 мкг (NCB012, Таблица 21), с использованием бескапсульной KP серотипа O2 (KP O2 K-) штамма 7380. Результаты анализа ОФУ представлены на Фигуре 47.

Иммунная сыворотка обеспечивала 100% уничтожение бактерий KP O2 при разведении 1/10 после 24 часов инкубации, при этом сыворотка в разведении 1/100 не обладала активностью уничтожения бактерий. Обеспечивающая уничтожение активность сыворотки могла быть связана либо с KP O2 OPS, либо с MrkA, или с сочетанием двух вакцинных компонентов.

Анализ ОФУ с клеточной линией J774 макрофагов

В этом анализе ОФУ для оценки функциональной активности использовали клеточную линию J774 макрофагов в присутствии или в отсутствие антибиотика гентамицина. Некоторые антибиотики не могут проникать в эукариотические клетки. Таким образом, эти антибиотики не могут наносить вред бактериям, которые уже интернализованы. Использование таких антибиотиков позволяет различать бактерии, которые смогли проникнуть в эукариотические клетки, и те, которые не смогли. Применение такого антибиотика в культуре эукариотических клеток, инфицированных бактериями, привело бы к уничтожению бактерий, которые остаются вне клеток, но не затронуло бы бактерии, которые проникли в клетки. Антибиотиком, выбранным для этого анализа, был аминогликозид гентамицин.

Объединенную кроличью сыворотку от кроликов в экспериментальной группе 5, получавших дозу 5 мкг 12-валентной KP/PA вакцины 1 в NCB012 и имевших самые высокие титры против OPS (1502, 1506, 1508, 1511), использовали в анализе ОФУ с клеточной линией J774 макрофагов для оценки эффекта сыворотки на фагоцитарное поглощение Klebsiella штаммов KP O1, KP O2, KP O3 и KP O5.

Макрофаги клеточной линии J774 высевали в 96-луночные планшеты за 24 часа до эксперимента. Штаммы Klebsiella разных O-типов выращивали до середины логарифмической фазы роста в бульоне, и использовали объединенную сыворотку в анализе на уничтожение. Приблизительно 1×10⁵ КОЕ бактерий инкубировали с объединенной преиммунной (P0) или иммунной (P2) сывороткой в течение 30 мин. Опсонизированные бактерии инкубировали с клетками J774 в течение 15 минут при комнатной температуре, времени, достаточного для осуществления опосредованного антителом фагоцитоза. Несвязанные бактерии удаляли с клеток и добавляли свежий буфер ±50 мкг/мл гентамицина еще на 20 минут. Клетки промывали два раза PBS, затем лизировали путем добавления чистой воды. По десять мл из каждой лунки в двух повторах высевали на чашки, и колониеобразующие единицы (КОЕ) подсчитывали на следующий день.

Результаты данного исследования представлены на Фигурах 48A и 48B. Результаты фагоцитарного поглощения клетками J774 бактерий Klebsiella, опсонизированных иммунной или преиммунной сывороткой в разведении 1/20, 1/100 и 1/500, показали увеличенное поглощение KP O1, KP O2, KP O3 и KP O5 в присутствии иммунной сыворотки и в присутствии гентамицина (Фигура 48A). Максимальное поглощение наблюдали при разведении 1/100 для KP O1, KP O2 и KP O3. В случае KP O5 поглощение было сходным при разведениях 1/20 и 1/100.

В отсутствие гентамицина значительное поглощение клетками J774 KP O1, KP O3 и KP O5 также наблюдали при использовании P2 сыворотки, в сравнении с преиммунной сывороткой, при использовании которой поглощение бактерий происходило в меньшей степени. Результаты для KP O2 не представлены, поскольку количество КОЕ было слишком высоким для подсчета (Фигура 48B). В случае KP O1 и KP O3 поглощение уменьшалось при более высоком разведении, и в случае KP O5 максимальное поглощение наблюдали при разведении 1/100, слегка меньшее поглощение при разведении 1/20 и минимальное поглощение при разведении 1/500.

Объединенную сыворотку от кроликов, получавших дозу 5 мкг 12-валентной KP/PA вакцины 1 в NCB012 и имевших самые высокие титры против OPS (1502, 1506, 1508, 1511), также использовали в анализе ОФУ с клеточной линией J774 макрофагов для оценки эффекта сыворотки на фагоцитарное поглощение как Pseudomonas PA (O5:FlaB и O6:FlaA1), так и Klebsiella штамма KP O5 (штамм 6997). Анализ выполняли, как описано выше для тестирования в анализе ОФУ с J774 Klebsiella штаммов KP O1, KP O2, KP O3 и KP O5.

Результаты данного анализа представлены на Фигурах 49, 50 и 51. Иммунная сыворотка (P0) опосредовала поглощение каждого из этих бактериальных штаммов путем фагоцитоза, как показано на Фигуре 49. Поглощение бактерий макрофаг-подобными клетками J774 также продемонстрировано методом микроскопии с использованием GFP-меченых PA (PA O1, PA O5 FlaB), как проиллюстрировано на Фигуре 50. PA, подвергнутые воздействию иммунной сыворотки, активно поглощались клетками. Несколько P2-обработанных изолятов PA в каждой клетке J774 показаны в увеличенном виде на Фигуре 50. На Фигуре 51 показано, что большую процентную долю клеток (левая панель) и большее число бактерий на клетку (правая панель) наблюдали в случае клеток, обработанных иммунной сывороткой, в сравнении с клетками, обработанными преиммунной сывороткой.

Анализ ОФУ с HL-60

В этом анализе бактерии KP O2 штамма 7380 были сначала опсонизированы сывороткой, а затем к смеси добавляли клетки HL-60. После инкубации смеси в течение 45 минут жизнеспособные бактерии подсчитывали. Титр ОФУ определяли как титр, при котором менее 50% бактерий выживали в сравнении с отрицательным контролем (только бактерии+клетки HL-60).

На Фигуре 52 и в Таблице 25 представлены результаты анализа ОФУ клетками HL60 с использованием KP O2 штамма 7380 и объединенной сыворотки от кроликов, иммунизированных дозой 5 мкг 12-валентной KP/PA вакцины 1. Кроличья сыворотка против убитых нагреванием (УН) KP O2 до и после иммунизации служила положительным контролем. Анализ выполняли с использованием сывороток в разведениях от 1/200 до 1/204800.

Сыворотки от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1, продемонстрировали значительную активность ОФУ в отношении KP O2 штамма 7380, в то время как соответствующие преиммунные сыворотки проявляли значительно более слабый эффект уничтожения бактерий. Обеспечивающая уничтожение активность сыворотки могла быть связана с антителами либо к KP O2 OPS, либо к MrkA, или к обоим компонентам. Информация о титрах ОФУ для сыворотки до и после иммунизации, а также для положительных контролей, приведена в Таблице 25. Имело место значительное отличие (>15-кратное увеличение) в обеспечивающей уничтожение активности между сыворотками до (1/800) и после иммунизации (1/12800).

Таблица 25: Титр ОФУ для KP O2 штамма 7380 в анализе с HL-60

Сыворотка	Временная точка	Титр
NCB012 (объединенная)	P0	1/800
P2	1/12800
Убитые нагреванием бактерии (объединенная)	До иммунизации	<1/200
После иммунизации	>1/204800

Аналогичный анализ выполняли с использованием KP O5 штамма 6997. Бактерии смешивали либо с преиммунной (P0), либо с иммунной (P2), объединенными сыворотками из исследования NCB012 и добавляли к клеткам HL-60 в присутствии комплемента (Таблица 26). Наблюдали на 50 процентов меньшую выживаемость в случае иммунной сыворотки до титра 1:1280, в то время как объединенная преиммунная сыворотка приводила к умеренному уменьшению выживаемости при разведении сыворотки 1:40.

Таблица 26: Выживаемость, в процентах, KP O5 штамма 6997 в клетках HL-60 при использовании объединенной сыворотки

	Разведение
1:40	1:160	1:320	1:1280
NCB012 P0	83	>100	>100	>100
NCB012 P2	23	50	48	50

Выводы для разных анализов ОФУ

Использовали три разных анализа ОФУ для оценки эффективности антител, индуцированных у кроликов после двух введений 12-валентной KP/PA вакцины 1. Значительная активность ОФУ могула быть продемонстрирована в отношении KP серотипов O1, O2, O3 и O5 в анализах с использованием либо человеческих PMN, клеток J774 макрофагов, либо дифференцированных клеток HL60. Активность ОФУ могла быть связана или с OPS-специфическими антителами и/или с антителами к белку-носителю MrkA. Поглощение KP и PA фагоцитирующими клетками, стимулированное 12-валентной иммунной сывороткой, вероятно, было связано с анти-OPS антителом.

Защита от клеточной токсичности

В соответствии с протоколом, описанным в примере 7, (Анализы цитотоксичности для конструктов с белком PcrV Pseudomonas), Pseudomonas штамма PAK (O6 FlaA1) выращивали в течение ночи и использовали для инфицирования монослоев клеток A549 легочного эпителия человека в присутствии сыворотки в разных концентрациях (10%, 5%, 2,5% или нуль) от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1, содержащей анти-PcrV антитело, выработанное в результате иммунного ответа на белок-носитель MAPS, или в присутствии преиммунной сыворотки от тех же кроликов в том же диапазоне концентраций сыворотки. Вызываемая Pseudomonas цитотоксичность для A549 характеризуется округлением клеток, поскольку клетки становятся апоптозными и отделяются от поверхности планшета для культивирования ткани. На опосредованную анти-PcrV антителом защиту от цитотоксичности указывает уменьшение числа округлившихся (апоптозных) клеток в поле микроскопа, в сравнении с клетками, обработанными преиммунной сывороткой в аналогичной концентрации. Максимальное различие в количестве округлившихся (апоптозных) клеток между образцами, обработанными иммунной и преиммунной сыворотками, наблюдали при концентрации сыворотки 2,5% (Фигура 53, левый график). Микрофотографии репрезентативных PAK-инфицированных клеток A549, обработанных 2,5% сывороткой, демонстрируют эти различия как уменьшение количества округлых клеток с высоким лучепреломлением в образце, обработанном иммунной сывороткой (Фигура 53, правая панель). Аналогичные изображения были использованы для оценки числа пораженных клеток при каждой концентрации сыворотки (Фигура 53, левый график).

Уменьшение подвижности P. aeruginosa за счет антител к FlaB

Как показано на Фигуре 54, в клетках, обработанных объединенной сывороткой от кроликов, иммунизированных дозой 5 мкг каждого PS (например, всего 60 мкг PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине) в 12-валентной KP/PA вакцине 1, наблюдали сниженную подвижность штамма PA O5 FlaB за счет антитела к FlaB, в сравнении с обработкой преиммунной сывороткой.

Агрегация P. aeruginosa за счет антител к FlaB

P. aeruginosa штамма PAO1 (O5 FlaB) выращивали в течение ночи и суспендировали в PBS до концентрации 10⁷ КОЕ/мл, затем инкубировали с 1% сывороткой от кроликов, вакцинированных 4-валентной KP вакциной, или с преиммунной сывороткой от тех же кроликов, в течение 1 часа при комнатной температуре. Анти-FlaB антитело в сыворотке, полученной в результате иммунного ответа на белок-носитель Rhavi-FlaBD2-MrkA-His, было способно вызывать агглютинацию FlaB-экспрессирующих Pseudomonas, о чем свидетельствуют кластеры бактерий, которые видны на микрофотографиях в виде черных палочек (Фигура 55, правая панель) с пометкой «агрегация», в то время как такие агрегаты отсутствовали у бактерий, обработанных преиммунной сывороткой (Фигура 55, левая панель). FlaBD2 был единственным антигеном Pseudomonas в этом вакцинном препарате, и наличие перекрестно связанных бактерий указывает на то, что белок-носитель вызывает продуцирование функционального антитела, способного узнавать нативный эпитоп в бактериальном флагеллине. Сыворотка от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA MAPS вакциной 1, была способна вызывать агглютинацию FlaB-экспрессирующих Pseudomonas с O-типом, отсутствующим в вакцине (данные не представлены), что уверенно свидетельствует о том, что содержащий FlaBD2 белок-носитель вызывал продуцирование функционального анти-FlaB антитела при использовании 12-валентного препарата, хотя нельзя исключать вклад в наблюдаемую агглютинацию, который вносит перекрестная реактивность между O-типами Pseudomonas.

Анализ ингибирования адгезии

В этом анализе объединенную сыворотку из исследования NCB012 использовали для оценки ингибирования адгезии антителами, полученными к разным иллюстративным вакцинам. Экспрессирующие фимбрии 3 типа бактериальные клетки KP O5 штамма 6997 смешивали с преиммунной и иммунной сывороткой (10%) и инкубировали с эпителиальными клетками линии A549. Не прикрепившиеся бактерии смывали с клеток, с последующим лизисом клеток и определением количества прикрепившихся бактерий. Ингибирование адгезии приводило к меньшему количеству КОЕ на планшете. На Фигуре 56 показано, что объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1, объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 8-валентной PA вакциной (MrkA является единственным антигеном KP в 8-валентной PA вакцине), объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных 4-валентной KP вакциной, блокировали адгезию KP O5 штамма 6997 к клеткам A549. Без связи с какой-либо теорией, поскольку объединенная сыворотка от кроликов, иммунизированных только 8-валентной PA OPS вакциной, также ингибировала адгезию, это свидетельствовало о том, что анти-MrkA антитело, индуцированное белком-носителем, обладает защитным эффектом.

Пример 13: Анализ защиты мышей

Исследования пассивной иммунизации проводили на мышах с использованием иммунной сыворотки, полученной от кроликов, иммунизированных KP/PA вакцинами. В Таблице 21 приведена информация о вакцинных препаратах, которые использовали для иммунизации кроликов. Преиммунную и иммунную сыворотку кроликов (в виде объединенной сыворотки) использовали для пассивной иммунизации мышей, как описано для других моделей. Информация о разных используемых для заражения штаммах также приведена для каждого исследования.

Исследование пассивной защиты мышей от летальной инфекции, вызываемой PA, с использованием сыворотки от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1

Исследование пассивной защиты мышей проводили с использованием объединенной сыворотки от кроликов, иммунизированных дозой 5 мкг каждого PS (например, всего 60 мкг PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине) в 12-валентной KP/PA вакцине 1 (Таблица 21, группа 5) в исследовании NCB012. Мышам предварительно вводили либо преиммунную, либо иммунную, сыворотку (объединенную кроличью сыворотку) и в/б заражали PA разных штаммов.

При летальных дозах заражения PA иммунная сыворотка защищала мышей от инфекции, вызываемой PA O5 и PA O6. Наблюдалась тенденция к защитному эффекту при заражении PA O10 и O11, однако заметное отличие в выживаемости мышей, получавших преиммунную сыворотку и зараженных 1×10⁸ КОЕ и лишь в 3 раза меньшей дозой, показывает, насколько крутой может быть кривая доза-ответ для многих грамотрицательных бактерий. Это часто создает проблемы при проведении таких анализов. Информация о показателях выживаемости приведена в Таблице 27.

Таблица 27: Показатели выживаемости мышей в исследовании летального заражения PA

Бактерии	Доза	Выживаемость
Преиммунная	Иммунная
Pseudomonas O5 FlaB штамма M2	1,3x 10⁷ КОЕ	1/5	4/5
Pseudomonas O5 FlaB штамма M2	1,1x 10⁸ КОЕ	0/5	4/5
Pseudomonas O6 FlaA2 штамма SBI-N	1x 10⁸ КОЕ	0/5	5/5
Pseudomonas O10 FlaB штамма 17002	1x 10⁷ КОЕ	2/5	5/5
Pseudomonas O11 FlaB штамма 1071	1x 10⁸ КОЕ	0/5	3/5
Pseudomonas O11 FlaB штамма 1071	3x 10⁷ КОЕ	4/5	5/5

Исследование пассивной защиты мышей от Klebsiella KP O3 с использованием сыворотки от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1

Сыворотку от четырех кроликов с самыми высокими титрами анти-KP-O3 (кролики 1502, 1506, 1508 и 1511; Таблица 28), иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 в дозе 5 мкг каждого PS (например, всего 60 мкг PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине) (группа 5) в исследовании NCB012, объединяли и вводили в/б инъекцией (преиммунную или иммунную сыворотку) за 20 часов и 2 часа до в/в заражения KP O3 штамма 700603 в дозе 50000 КОЕ в 0,1 мл.

Таблица 28: Титры преиммунных и иммунных кроличьих сывороток, включенных в объединенные образцы

Номер кролика/ образец сыворотки	Титр преиммунной сыворотки против O3	Титр иммунной сыворотки против O3
1502	5	1017
1506	10	2306
1508	19	4024
1511	5	704

Через четыре часа после заражения мышей подвергали эвтаназии, кровь, печень и селезенку собирали, и определяли количество колоний. Результаты приведены в Таблице 29. У мышей, получавших объединенную иммунную сыворотку, наблюдали клиренс из крови и меньшее количество бактерий в печени и селезенке в сравнении с мышами, получавшими преиммунную сыворотку от тех же кроликов. Эти результаты были аналогичны результатам бактериального клиренса при использовании сыворотки с эквивалентным титром от кроликов, иммунизированных 4-валентным KP MAPS в исследовании NCB008.

Таблица 29: Среднее геометрическое количество КОЕ для клиренса из крови и жизнеспособных бактерий в органах после заражения Klebsiella KP O3

Образец сыворотки	Кровь	Печень	Селезенка
NCB008 Преиммунная	5235	12590	7353290
NCB008 Иммунная	без бактерий	3302	89159
NCB012 Преиммунная	10020	27180	2635845
NCB012 Иммунная	без бактерий	2952	195421

Исследование пассивной защиты мышей от Klebsiella KP O1 штамма B5055 с использованием сыворотки от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1

В этом исследовании трем мышам на группу вводили инъекцией объединенную сыворотку от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 в дозе 5 мкг каждого PS (например, всего 60 мкг PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине) (Таблица 21, группа 5) в исследовании NCB012 (преиммунная и иммунная сыворотка), с последующим внутривенным (в/в) заражением KP O1 штамма B5055 в дозе 5×10⁶. Результаты анализа клиренса из крови через 1 и 4 часа после заражения приведены в Таблице 30 в виде среднего геометрического значения КОЕ/мл крови, и представлены на Фигуре 57 для отдельных мышей.

Через четыре часа после заражения в крови у мышей в группе с иммунной сывороткой наблюдали значительное уменьшение количества КОЕ/мл, в то время как количество КОЕ/мл у мышей, получавших преиммунную сыворотку, оставалось повышенным.

Таблица 30: Результаты анализа клиренса из крови в виде среднего геометрического значения КОЕ/мл у мышей после заражения KP O1 штамма B5055

Образец сыворотки	Доза	Кровь
1 час	4 часа
Преиммунная	5x 10⁶ КОЕ	1362840	4449118
Иммунная	5x 10⁶ КОЕ	1593725	91308

Результаты определения нагрузки органов в селезенке и печени у этих мышей приведены в Таблице 31 в виде среднего геометрического значения КОЕ/г ткани для трех мышей. На Фигуре 58 представлены результаты определения нагрузки органов в селезенке и печени трех мышей через 20 часов после заражения.

У двух из трех мышей, получавших иммунную сыворотку, наблюдали уменьшение среднего геометрического значения КОЕ в печени, в сравнении с мышами, получавшими преиммунную сыворотку. Результаты для селезенки показывают аналогичную картину у мышей, предварительно получавших иммунную сыворотку, свидетельствующую о значительном уменьшении показателя через 20 часов после заражения в сравнении с мышами, получавшими преиммунную сыворотку, которые имели значительно более высокое количество бактерий.

Таблица 31: Нагрузка органов у мышей в виде среднего геометрического значения КОЕ/г ткани после заражения KP O1 штамма B5055

	Доза	Селезенка	Печень
Преиммунная	5x 10⁶ КОЕ	672204849	21447778
Иммунная	5x 10⁶ КОЕ	12867923	3308911

Исследование пассивной защиты мышей от Klebsiella KP O5 штамма 6997 с использованием сыворотки от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1

В этом исследовании трем мышам на группу вводили инъекцией объединенную сыворотку от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1 в дозе 5 мкг каждого PS (например, всего 60 мкг PS в вакцине; 5 мкг PS от каждого типа BP в вакцине) в исследовании NCB012 (Таблица 21, группа 5, преиммунная и иммунная сыворотка), с последующим в/в заражением KP O5 штамма 6997 в дозе 5×10⁶. Результаты анализа клиренса из крови через 1 и 4 часа после заражения приведены в Таблице 32 в виде среднего значения КОЕ/мл крови, и представлены на Фигуре 59 для отдельных мышей.

Через четыре часа после заражения кровь у 2 из 3 мышей в группе с иммунной сывороткой была очищена от бактерий, со значительным уменьшением нагрузки КОЕ у третьей мыши, в то время как количество КОЕ у мышей, получавших преиммунную сыворотку, оставалось повышенным (у 2 из 3 мышей) через четыре часа после заражения.

Таблица 32: Результаты анализа клиренса из крови в виде среднего геометрического значения КОЕ/мл у мышей после заражения KP O5 штамма 6997

	Доза	Кровь
1 час	4 часа
Преиммунная	5x 10⁶ КОЕ	1910	458
Иммунная	5x 10⁶ КОЕ	2340	42

Результаты определения нагрузки органов в селезенке у этих мышей приведены в Таблице 33 в виде среднего геометрического значения КОЕ/г ткани для трех мышей, и на Фигуре 60 представлены результаты определения нагрузки органов в селезенке трех мышей через 20 часов после заражения.

Было обнаружено, что в селезенке у мышей, получавших иммунную сыворотку, было гораздо меньше бактерий через 20 часов после заражения, чем у мышей, получавших преиммунную сыворотку.

Таблица 33: Нагрузка органов у мышей в виде среднего геометрического значения КОЕ/г ткани после заражения KP O5 штамма 6997

	Доза	Селезенка
Преиммунная	5x 10⁶ КОЕ	93750
Иммунная	5x 10⁶ КОЕ	20432

Исследование пассивной защиты мышей от Klebsiella KP O2 (штамма KPN 12) с использованием сыворотки от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1

В этом исследовании мышам CD-1 (3/группу) вводили 0,2 мл объединенной преиммунной, или иммунной, сыворотки (объединенная сыворотка от 10 кроликов, исследование NCB012) за 24 часа и 2 часа до в/в введения 2×10⁵ КОЕ KP O2 штамма KPN-12. Селезенки собирали через 72 часа после инфицирования и определяли бактериальную нагрузку на грамм ткани. У мышей, получавших иммунную сыворотку, наблюдали меньшее количество жизнеспособных бактерий в сравнении с мышами, получавшими преиммунную сыворотку (7978 против 114687, среднее количество КОЕ; Фигура 61). Объединенная иммунная сыворотка стимулировала клиренс KP O2 (штамма KPN-12) из системы кровообращения.

Проводили несколько экспериментов с преиммунной и иммунной сыворотками из исследования NCB012 для разработки и оптимизации протокола пассивной защиты в модели летального заражения Klebsiella KP O2. Аналогичные эксперименты можно проводить для разработки и оптимизации протокола пассивной защиты для других организмов, других вакцин или иммуногенных композиций, и/или других патогенов/штаммов. Были изучены такие переменные, как доза бактерий для заражения, доставка инокулята (например, опсонизация бактерий перед инъекцией), а также количество, время введения и концентрация сыворотки для пассивной защиты (например, сыворотка, полученная с дозой полисахарида либо 5 мкг, либо 1 мкг). Иллюстративные тестируемые параметры и результаты представлены на Фигуре 62.

Th17-ответ и колонизация у мышей CD-1 - при заражении

Этот эксперимент был разработан для определения способности KP O1 MAPS вакцины с FlaBD2 и MrkA в трех дозах, введенной мышам, при этом каждую дозу вводили через четырнадцать дней после предыдущей дозы, уменьшать бактериальную колонизацию после бактериального заражения через две недели после последней иммунизации. Двум группам мышей CD-1 предстояло проводить бактериальное заражение; в одной группе животные были иммунизированы KPO1/FlaBD2-MrkA MAPS вакциной, а в другой группе животные были иммунизированы одним буфером (PBS).

Пяти мышам на группу вводили 3-5×10³ КОЕ KP B5055 (O1:K2) интратрахеально (и/т). Через 48 часов после бактериального заражения легкие животных собирали и взвешивали, гомогенаты высевали для подсчета бактерий, а затем центрифугировали. Супернатанты оценивали на уровни IL-17a. Параллельно, клетки селезенки совместно культивировали с PBS, FlaBD2 и MrkA, как описано выше, и через три дня супернатанты оценивали на уровни IL-17a.

На Фигуре 63 показана индукция IL-17a в стимулированных клетках селезенки после бактериального заражения. Значительную индукцию наблюдали для стимулированных FlaBD2 клеток селезенки (p=0,02).

Эффект иммунизации на колонизацию ЖК тракта P. aeruginosa

Был разработан следующий экспериментальный протокол для изучения эффекта иммунизации одновалентной PA O6 MAPS вакциной на колонизацию желудочно-кишечного (ЖК) тракта P. aeruginosa.

Восемь крыс Sprague-Dawley иммунизировали два раза по 0,5 мл п/к с двухнедельными интервалами одновалентной MAPS вакциной, MA6-93-PAO6 (Klebsiella pneumoniae K19: Pseudomonas aeruginosa O6/Rhavi-FlaBD2-MrkA-his BP-1). Семь крыс иммунизировали только буфером. Через четырнадцать дней после второй иммунизации крысам вводили цефтриаксон (50 мг/кг в/м) и продолжали вводить один раз в сутки дозы антибиотика в течение девяти дней. Крысам вводили антибиотики для преодоления сопротивляемости колонизации в ЖК тракте оппортунистических бактерий, таких как PA и для имитации клинической ситуации. После четырех дней приема только антибиотика крысам вводили P. aeruginosa (PA, IATS O6) в дозе 10⁸ КОЕ через желудочный зонд всего в течение пяти дней. После пяти суточных доз PA и девяти суточных доз цефтриаксона крыс подвергали эвтаназии, слепую кишку удаляли, взвешивали, а затем культивировали. Кровь собирали для оценки уровней антител до введения антибиотиков, вводили бактерии, и получали образцы экскрементов для культивирования PA за день до, и через два дня после, введения первой дозы PA. Подробное описание можно найти в верхней части Фигуры 64.

Результаты исследования на крысах колонизации с использованием двух доз PA O6 FlaBD2-MrkA MAPS вакцины представлены в нижней части Фигуры 64. Крысы, получавшие PA O6 вакцину, имели повышенный определенный методом ELISA титр IgG в сравнении с крысами, получавшими PBS (слева в нижней части фигуры). У вакцинированных крыс также обнаруживали, в среднем, менее 10³ КОЕ/г бактерий в сравнении с контрольными крысами, которые имели, в среднем, >10⁴ КОЕ/г (справа в нижней части фигуры). Результаты исследования свидетельствуют об уменьшении колонизации PA O6 слепой кишки после двух иммунизаций одновалентной PA O6 MAPS вакциной.

Пример 14: Анти-OPS антитело к карбапенем-устойчивым штаммам KP (CRKP), экспрессирующим эпитоп Gal-III

В отличие от других классов бактериальных карбапенемaз (например, окса-48 или металло-бета-лактамаз), распространение KPC (карбапенемaза K. pneumoniae), судя по всему, является по меньшей мере частично клональным явлением. Показано, что определенная линия, называемая типом последовательности (ST) 258, ответственна за большинство инфекций KPC-продуцирующих Klebsiella, которые являются эндемичными в нескольких географических регионах. В настоящее время в северо-восточных штатах США >30% всех внутрибольничных инфекций K. pneumoniae вызваны CRKP, и приблизительно 70% из них принадлежат к KPC-продуцирующему клону ST258. Аналогично, этот клон (включая однолокусные варианты ST) вызывают эпидемии в других частях света, включая Израиль, Польшу, Италию, Грецию, Южную Америку и Китай. Недавно исследование молекулярной эволюции ST258 выявило две клады, которые связаны с экспрессией различных капсульных полисахаридов (Chen 2014a, Chen 2014b, DeLeo 2014). Klebsiella pneumoniae ST258 представляет собой глобально распространенный, обладающий чрезвычайно сильной лекарственной устойчивостью внутрибольничный клон, с ограниченной возможностью лечения.

Антигены KP O1 и KP O2 состоят из гомополимеров галактозы, то есть, галактанов. Антиген KP O2, называемый d-галактан-I (gal-I), состоит из дисахаридных повторяющихся единиц галактозы. В случае KP O1 gal-I закрыт повторяющимися единицами антигенно отличающегося дисахарида галактозы, называемого d-галактан-II (gal-II), который определяет специфику серотипа. Редкий серотип KP O2ac имеет аналогичную структуру, то есть повторы субъединиц gal-I закрыты полимером из других, в данном случае, не-галактановых, повторяющихся единиц. Соответственно, все штаммы KP O1, KP O2 и KP O2ac имеют общий антиген gal-I, однако, если в KP O2 это единственная O-антигенная детерминанта, в случае KP O1 и KP O2ac gal-I экранирован внешними повторяющимися единицами. Кроме того, дисахаридные повторяющиеся единицы gal-I могут иметь добавленные в стехиометрических и не стехиометрических количествах O-ацетильные или галактозильные группы, за счет которых создаются подтипы в серогруппе KP O2 (Фигура 65). Явное большинство изолятов ST258 экспрессируют модифицированный липополисахаридный O-антиген d-галактан-I с содержащим галактозильные группы Gal-I, далее в настоящем изобретении называемый d-галактан-III (Szijártó V. et al., 2016).

KP O1 OPS состоит из короткого «праймерного» участка D-Gal-I или D-Gal-III, за которым следует длинный участок D-Gal-II. KP O2 OPS состоит только из D-Gal-I или D-Gal-III (Фигура 65). Эпитоп Gal-II характерен только для серотипа KP O1.

B5055 OPS, который является источником антигена KP O1 в MAPS вакцине, имеет короткий участок DGal-III, за которым следует длинный полимер D-Gal-II. KP 7380 (источник вакцинного антигена KP O2) имеет только D-Gal-I.

Было исследовано, способна ли KP/PA MAPS вакцина вызывать выработку антител к эпитопу Gal-III и, таким образом, обладать потенциалом для предотвращения инфекций, вызываемых клональными штаммами KPCR ST 258. Объединенную сыворотку (P2) от кроликов, иммунизированных 4-валентной KP PRO-CN MAPS вакциной в дозе 5 мкг, использовали в анализе проточной цитометрии для демонстрации способности связывания с бактериями, экспрессирующими эпитопы KP D-Gal-III и KP D-Gal-I. В данном случае единственным адекватным ответом было бы узнавание D-Gal-I O2 и D-Gal-III O2 OPS, D-Gal-II O1 OPS. Результаты показали увеличение связывания, в сравнении с соответствующей преиммунной сывороткой (P0), в отношении как KP O1, так и KP O2, с D-Gal III и D-Gal I OPS (Фигура 66). Таким образом, вероятно, что антитела были выработаны против всех трех типов KP D-Gal.

Результаты анализа проточной цитометрии, приведенные в Таблице 34 и на Фигуре 67, показывают, что антитела в объединенной сыворотке от кроликов, иммунизированных 12-валентной KP/PA вакциной 1, связывали два из трех штаммов ST258 из бактериемических изолятов. Иммунная сыворотка, полученная к 12-валентной KP/PA вакцине 1, связывала три из четырех штаммов серотипов, не включенных в вакцину, в том числе, штаммы с аллелями MrkA с небольшими вариациями последовательности (Фигура 67). Без связи с какой-либо теорией, эти данные свидетельствуют о том, что большинство штаммов KP, а не только те, которые имеют серотипы компонентов OPS, включенных в 12-валентную KP/PA вакцину 1, будут узнаваться антителами, индуцированными вакциной, за счет компонента слитого белка MrkA.

Таблица 34: Результаты определения методом проточной цитометрии связывания сыворотки, индуцированной 12-валентной вакциной 1, со штаммами Klebsiella серотипов, не включенных в вакцину, и имеющих мутантные аллели MrkA

Штамм	Страна	Серотип	ST	K-тип	Аллели MrkA	Связывание методом проточной цитометрии
1405472	США	O1	258	Wzi154	Неизвестный	Да
1105463	США	O2	258	Wzi154	Неизвестный	Нет
1103113	США	O2	258	Wzi154	Консервативный	Да
NUH5575	Япония	Не O1, O2, O3 или O5	Неизвестный	Wzi41	T23N	Да
7075	Южная Африка	Не O1, O2, O3 или O5	Неизвестный	Wzi212	A9V, T12S	Да
170241	США	Не O1, O2, O3 или O5	Неизвестный	K24	Консервативный	Да
118181/3	ДРК	Не O1, O2, O3 или O5	Неизвестный	Wzi52	Без MrkA	Нет

Результаты определения способности связывания 4-валентной KP MAPS вакцины с KP, экспрессирующими эпитопы D-Gal-I и D-Gal-III, указывают на то, что 12-валентная KP/PA вакцина обладает потенциалом приводить к выработке антител к эпитопу Gal-III и к предотвращению инфекции, вызываемой KPCR ST 258 клональными штаммами.

Пример 15: Получение BP-1.2

Полезные свойства BP-1 заключаются в наличии остатков биотина, расположенных исключительно на аспекте CPS в BP, что может оказаться предпочтительным с точки зрения характеризации продукта и минимального нарушения эпитопов OPS. Был разработан вариант способа получения такого каркаса, который основан на связывании остатков биотина с CPS в ортогональном участке, с использованием карбоксилатов остатков уроновой кислоты полисахарида вместо альдегида. Эта реакция, которая включает использование карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS), является в высокой степени управляемой и обеспечивает постоянный уровень биотинилирования в CPS и конечном BP. BP, полученный таким способом, назван BP-1.2. Схема иллюстративного процесса получения BP-1.2 представлена на Фигуре 2B.

Некоторые из преимуществ данного способа включают обеспечение воспроизводимого биотинилирования с лучшим контролем над уровнем дериватизации биотином и лучшей воспроизводимостью продукта, поскольку все BP происходят из одной и той же партии биотинилированных CPS, результатом чего является стабильное биотинилированное промежуточное соединение, которое можно хранить большими партиями, и возможность достижения более высокого соотношения OPS/CPS в BP, поскольку больше альдегидных групп доступны на CPS, что приводит к меньшей конкуренции за одни и те же сайты связывания.

Пример 16: Исследования иммунизации иммуногенными комплексами BP-1 и BP-1.2

4-валентные вакцины готовили в виде либо BP-1 MAPS, либо BP-1.2 MAPS, и формулировали в соответствии с Таблицей 35. Эти композиции вводили кроликам с использованием протоколов, описанных выше, например, в Примерах 6 и 11.

Таблица 35: Совокупные данные о вакцинных препаратах, используемых в сравнительном исследовании для BP-1 и BP-1.2.

Группа	Вакцина	Патоген	Белок-носитель	Серотип	Доза PS (всего)	Отношение Белок:PS (суммарн.белок)	Адъювант	Кролики
1	4-валентная KP/PA вакцина BP-1 5 мкг на дозу PS	Pseudomonas	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O6, O11	5 мкг (20 мкг)	3:1 (60 мкг)	625 мкг AlPO₄	10
Klebsiella	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O3, O5
2	4-валентная KP/PA вакцина BP-1.2 5 мкг на дозу PS	Pseudomonas	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O6, O11	5 мкг (20 мкг)	3:1 (60 мкг)	625 мкг AlPO₄	10
Klebsiella	Rhavi-FlaBD2-MrkA-his	O3, O5

Сильный ответ в виде выработки IgG антител к KP и PA OPS наблюдали в обеих группах BP-1 и BP-1.2. Индивидуальные титры IgG на OPS и CPS K19 для группы 1 и группы 2 представлены на Фигуре 68. Анти-OPS иммунные ответы как на PA O6, так и на PA O11, OPS были эквивалентны для конструктов BP-1 и BP-1.2 MAPS. Аналогично, эквивалентные ответы наблюдали на KP O3 и KP O5 OPS, хотя и значительно более высокие титры в случае KP O3 с конструктом BP-1.2 MAPS (приблизительно в 5-6 раз более высокие средние геометрические значения титра). Титры IgG к K19 CPS были эквивалентны для обоих конструктов BP-1 и BP-1.2 MAPS. Сильный ответ в виде выработки IgG антител к белкам носителям как FlaB-D2, так и MrkA, также наблюдали в обеих группах BP-1 и BP-1.2. Ответы в виде выработки антител (объединенная сыворотка) на оба белка-носителя были сопоставимы в обеих группах BP-1 и BP-1.2 (Фигура 69). Сводные результаты приведены в Таблице 36.

Таблица 36: Сравнение иммуногенности BP-1 MAPS (Группа 1) и BP-1.2 MAPS (Группа 2): IgG-ответ на OPS

Индивидуальные титры IgG на OPS и CPS K19 для группы 1 и группы 2 представлены на Фигуре 68. Анти-OPS иммунные ответы как на PA O6, так и на PA O11, OPS были эквивалентны для конструктов BP-1 и BP-1.2 MAPS. Аналогично, эквивалентные ответы наблюдали на KP O3 и KP O5 OPS, хотя и значительно более высокие титры в случае KP O3 с конструктом BP-1.2 MAPS (приблизительно в 5-6 раз более высокие средние геометрические значения титра). Титры IgG к K19 CPS были эквивалентны для обоих конструктов BP-1 и BP-1.2 MAPS.

В исследовании NCB013 было проведено сравнение 2-валентных KP/PA вакцин с BP-1 (каркас 1) и BP-1.2 (каркас 1.2) у кроликов (смотри также Таблицу 35 для информации о вакцинных препаратах). На Фигуре 70 и Фигуре 71 показаны индивидуальные ответы в виде выработки антител на два белка-носителя FlaBD2 и MrkA в случае BP-1 и BP-1.2 (KP/PA, 4-валентная), соответственно. Значительное увеличение титров антител наблюдали после первой иммунизации в случае обоих белков-носителей и обоих каркасов. Титры антител дополнительно возрастали после второй иммунизации. Наблюдали сильный ответ в виде выработки антител в группах для обоих белков FlaBD2 и MrkA, и обоих каркасов BP-1 и BP-1.2, и выработка антител к обоим белкам была сопоставимой в группах BP-1 и BP-1.2.

Последовательности

SEQ ID	Описание	Последовательность
SEQ ID NO: 1	K. pneumoniae, фимбриальный белок I типа	mkiktlamivvsalslsstaaladtttvnggtvhfkgevvnaacavdagsidqtvqlgqvrsaklatagstssavgfniqlddcdttvatkasvafagtaidssnttvlalqnsaagsatnvgvqildntgtplaldgatfsaattlndgpniipfqaryyatgaatagianadatfkvqye
SEQ ID NO: 2	K. pneumoniae, консервативный фимбриальный белок III типа MrkA	MKKVLLSAAMATAFFGMTAAHAADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQ
SEQ ID NO: 3	K. pneumoniae, стабилизированный фимбриальный белок III типа MrkA	ADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVS
SEQ ID NO: 4	Последовательность в PsL-связывающем мАт Cam-003	QVRLQQSGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSTSPYFWSWLRQPPGKGLEWIGYIHSNGGTNYNPSLKSRLTISGDTSKNQFSLNLSFVTAADTALYYCARTDYDVYGPAFDIWGQGTMVTV
SEQ ID NO: 5	Последовательность в PsL-связывающем мАт Cam-003	SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSRDSSGNHVVFGGGTKLTVL
SEQ ID NO: 6	P. aeruginosa, FliC флагеллин подтипа A1	MALTVNTNIASLNTQRNLNNSSASLNTSLQRLSTGSRINSAKDDAAGLQIANRLTSQVNGLNVATKNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRMRDLSLQSANGSNSDSERTALNGEVKQLQKELDRISNTTTFGGRKLLDGSFGVASFQVGSAANEIISVGIDEMSAESLNGTYFKADGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFSDGDTISYVSKAGKDGSGAITSAVSGVVIADTGSTGVGTAAGVTPSATAFAKTNDTVAKIDISTAKGAQSAVLVIDEAIKQIDAQRADLGAVQNRFDNTINNLKNIGENVSAARGRIEDTDFAAETANLTKNQVLQQAGTAILAQANQLPQSVLSLLR
SEQ ID NO: 7	P. aeruginosa, FliC флагеллин подтипа B	MALTVNTNIASLNTQRNLNASSNDLNTSLQRLTTGYRINSAKDDAAGLQISNRLSNQISGLNVATRNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRIRDLALQSANGSNSDADRAALQKEVAAQQAELTRISDTTTFGGRKLLDGSFGTTSFQVGSNAYETIDISLQNASASAIGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSVASVDISTADGAQNAIAVVDNALAAIDAQRADLGAVQNRFKNTIDNLTNISENATNARSRIKDTDFAAETAALSKNQVLQQAGTAILAQANQLPQAVLSLLR
SEQ ID NO: 8	P. aeruginosa, фактор вирулентности PcrV секреторной системы III типа (TTSS)	MEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAI
SEQ ID NO: 9	P. aeruginosa, флагеллин FlaA2	MALTVNTNIASLNTQRNLNNSSASLNTSLQRLSTGSRINSAKDDAAGLQIANRLTSQVNGLNVATKNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRMRDLSLQSANGSNSDSERTALNGEVKQLQKELDRISNTTTFGGRKLLDGSFGVASFQVGSAANEIISVGIDEMSAESLNGTYFTATGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFTDGAQISYVSKASADGTTSAVSGVAITDTGSTGAGTAAGTTTFTEANDTVAKIDISTAKGAQSAVLVIDEAIKQIDAQRADLGAVQNRFDNTINNLKNIGENVSAARGRIEDTDFAAETANLTKNQVLQQAGTAILAQANQLPQSVLSLLR
SEQ ID NO: 10	P. aeruginosa, домен D2 флагеллина FlaB, лишенный TLR5-связывающего мотива	GSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSS
SEQ ID NO: 11	P. aeruginosa, домен D2 флагеллина FlaA1, лишенный TLR5-связывающего мотива	NGTYFKADGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFSDGDTISYVSKAGKDGSGAITSAVSGVVIADTGSTGVGTAAGVTPSATAFAKTNDT
SEQ ID NO: 12	P. aeruginosa, домен D2 флагеллина FlaA2, лишенный TLR5-связывающего мотива	NGTYFTATGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFTDGAQISYVSKASADGTTSAVSGVAITDTGSTGAGTAAGTTTFTEANDT
SEQ ID NO: 13	ризавидин	MIITSLYATFGTIADGRRTSGGKTMIRTNAVAALVFAVATSALAFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD
SEQ ID NO: 14	ризавидин без сигнальных последовательностей	FDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKD
SEQ ID NO: 15	GGGGSSS линкер	GGGGSSS
SEQ ID NO: 16	Rhavi-PcrV-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH
SEQ ID NO: 17	Rhavi-MrkA-комплементация донорской цепи-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVSGSGHHHHHH
SEQ ID NO: 18	Rhavi-FlaA1-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMALTVNTNIASLNTQRNLNNSSASLNTSLQRLSTGSRINSAKDDAAGLQIANRLTSQVNGLNVATKNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRMRDLSLQSANGSNSDSERTALNGEVKQLQKELDRISNTTTFGGRKLLDGSFGVASFQVGSAANEIISVGIDEMSAESLNGTYFKADGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFSDGDTISYVSKAGKDGSGAITSAVSGVVIADTGSTGVGTAAGVTPSATAFAKTNDTVAKIDISTAKGAQSAVLVIDEAIKQIDAQRADLGAVQNRFDNTINNLKNIGENVSAARGRIEDTDFAAETANLTKNQVLQQAGTAILAQANQLPQSVLSLLRGSGHHHHHH
SEQ ID NO: 19	Rhavi-FlaA2-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMALTVNTNIASLNTQRNLNNSSASLNTSLQRLSTGSRINSAKDDAAGLQIANRLTSQVNGLNVATKNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRMRDLSLQSANGSNSDSERTALNGEVKQLQKELDRISNTTTFGGRKLLDGSFGVASFQVGSAANEIISVGIDEMSAESLNGTYFTATGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFTDGAQISYVSKASADGTTSAVSGVAITDTGSTGAGTAAGTTTFTEANDTVAKIDISTAKGAQSAVLVIDEAIKQIDAQRADLGAVQNRFDNTINNLKNIGENVSAARGRIEDTDFAAETANLTKNQVLQQAGTAILAQANQLPQSVLSLLRGSGHHHHHH
SEQ ID NO: 20	Rhavi-FlaB-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMALTVNTNIASLNTQRNLNASSNDLNTSLQRLTTGYRINSAKDDAAGLQISNRLSNQISGLNVATRNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRIRDLALQSANGSNSDADRAALQKEVAAQQAELTRISDTTTFGGRKLLDGSFGTTSFQVGSNAYETIDISLQNASASAIGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSVASVDISTADGAQNAIAVVDNALAAIDAQRADLGAVQNRFKNTIDNLTNISENATNARSRIKDTDFAAETAALSKNQVLQQAGTAILAQANQLPQAVLSLLRGSGHHHHHH
SEQ ID NO: 21	Rhavi-FlaB-Домен2-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSGSGHHHHHH
SEQ ID NO: 22	Rhavi-FlaA2-Домен2-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMNGTYFTATGGGAVTAATASGTVDIAIGITGGSAVNVKVDMKGNETAEQAAAKIAAAVNDANVGIGAFTDGAQISYVSKASADGTTSAVSGVAITDTGSTGAGTAAGTTTFTEANDTGSGHHHHHH
SEQ ID NO: 23	Rhavi-FlaB-PcrV-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMALTVNTNIASLNTQRNLNASSNDLNTSLQRLTTGYRINSAKDDAAGLQISNRLSNQISGLNVATRNANDGISLAQTAEGALQQSTNILQRIRDLALQSANGSNSDADRAALQKEVAAQQAELTRISDTTTFGGRKLLDGSFGTTSFQVGSNAYETIDISLQNASASAIGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSVASVDISTADGAQNAIAVVDNALAAIDAQRADLGAVQNRFKNTIDNLTNISENATNARSRIKDTDFAAETAALSKNQVLQQAGTAILAQANQLPQAVLSLLRAAAAMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH
SEQ ID NO: 24	Rhavi-FlaB-Домен2-MrkA-комплементация донорской цепи-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSAAAAMADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVSGSGHHHHHH
SEQ ID NO: 25	Rhavi-MrkA-комплементация донорской цепи -PcrV-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMADTTVGGGQVNFFGKVTDVSCTVSVNGQGSDANVYLSPVTLTEVKAAAADTYLKPKSFTIDVSNCQAADGTKQDDVSKLGVNWTGGNLLAGATSKQQGYLANTEASGAQNIQLVLSTDNATALTNKIIPGDSTQPKAKGDASAVADGARFTYYVGYATSAPTTVTTGVVNSYATYEITYQGGGGGGADTTVGGGQVNFFGKVTDVSAAAAMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH
SEQ ID NO: 26	Rhavi-FlaB-Домен2-PcrV-his	MFDASNFKDFSSIASASSSWQNQSGSTMIIQVDSFGNVSGQYVNRAQGTGCQNSPYPLTGRVNGTFIAFSVGWNNSTENCNSATGWTGYAQVNGNNTEIVTSWNLAYEGGSGPAIEQGQDTFQYVPTTENKSLLKDGGGGSSSMGSYQVGSNGAGTVASVAGTATASGIASGTVNLVGGGQVKNIAIAAGDSAKAIAEKMDGAIPNLSARARTVFTADVSGVTGGSLNFDVTVGSNTVSLAGVTSTQDLADQLNSNSSKLGITASINDKGVLTITSATGENVKFGAQTGTATAGQVAVKVQGSDGKFEAAAKNVVAAGTAATTTIVTGYVQLNSPTAYSVSGTGTQASQVFGNASAAQKSSAAAAMEVRNLNAARELFLDELLAASAAPASAEQEELLALLRSERIVLAHAGQPLSEAQVLKALAWLLAANPSAPPGQGLEVLREVLQARRQPGAQWDLREFLVSAYFSLHGRLDEDVIGVYKDVLQTQDGKRKALLDELKALTAELKVYSVIQSQINAALSAKQGIRIDAGGIDLVDPTLYGYAVGDPRWKDSPEYALLSNLDTFSGKLSIKDFLSGSPKQSGELKGLSDEYPFEKDNNPVGNFATTVSDRSRPLNDKVNEKTTLLNDTSSRYNSAVEALNRFIQKYDSVLRDILSAIGSGHHHHHH

Литература

Agodi A, Voulgari E, Barchitta M, Politi L, Koumaki V, et al. Containment of an outbreak of KPC-3-producing Klebsiella pneumoniae in Italy. J Clin Microbiol. 2011 Nov;49(11):3986-9.

Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 1990 Oct 5;215(3):403-10.

Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3389-402.

Andreasen C., Powell DA., Carbonetti N. Pertussis Toxin Stimulates IL-17 Production in Response to Bordetella pertussis Infection in Mice. PloS One 2009 4:Issue 9 e7079.

Anttila M, Eskola J, Ahman H, Käyhty H. Avidity of IgG for Streptococcus pneumoniae type 6B and 23F polysaccharides in infants primed with pneumococcal conjugates and boosted with polysaccharide or conjugate vaccines. J Infect Dis. 1998 Jun;177(6):1614-21.

Baer M, Sawa T, Flynn P, Luehrsen K, Martinez D, et al. An engineered human antibody fab fragment specific for Pseudomonas aeruginosa PcrV antigen has potent antibacterial activity. Infect Immun. 2009 Mar;77(3):1083-90.

Baraniak, A., Grabowska, A., Izdebski, R., Fiett, J., Herda, M., Bojarska, K., Zabicka, D., Kania-Pudlo, M., Mlynarczyk, G., Zak-Pulawska, Z., Hryniewicz, W., Gniadkowski, M., 2011. Molecular characteristics of KPC-producing Enterobacteriaceae at the early stage of their dissemination in Poland, 2008-2009. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 5493-5499.

Barnea Y, Carmeli Y, Gur E, Kuzmenko B, Gat A, et al. Efficacy of antibodies against the N-terminal of Pseudomonas aeruginosa flagellin for treating infections in a murine burn wound model. Plast Reconstr Surg. 2006 Jun;117(7):2284-91.

Barnea Y, Carmeli Y, Neville LF, Kahel-Reifer H, Eren R, et al. Therapy with anti-flagellin A monoclonal antibody limits Pseudomonas aeruginosa invasiveness in a mouse burn wound sepsis model. Burns. 2009 May;35(3):390-6.

Baumgartner JD. Monoclonal anti-endotoxin antibodies for the treatment of gram-negative bacteremia and septic shock. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1990 Oct;9(10):711-6.

Baxevanis AD and Ouellette BF, Eds., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins. New York, NY: Wiley-Interscience, 1998.

Bergogne-Bérézin E. [Nosocomial infections: new agents, incidence, prevention]. Presse Med. 1995 Jan 14;24(2):89-97. Review. French.

Brisse S. et al., wzi Gene Sequencing, a Rapid Method for Determination of Capsular Type for Klebsiella Strains. J Clin Microbiol. 2013 51(12):4073-4078.

Bryan CS, Reynolds KL, Brenner ER. Analysis of 1,186 episodes of gram-negative bacteremia in non-university hospitals: the effects of antimicrobial therapy. Rev Infect Dis. 1983 Jul-Aug;5(4):629-38.

Burmølle M, Bahl MI, Jensen LB, Sørensen SJ, Hansen LH. Type 3 fimbriae, encoded by the conjugative plasmid pOLA52, enhance biofilm formation and transfer frequencies in Enterobacteriaceae strains. Microbiology. 2008 Jan;154(Pt 1):187-95.

Campodónico VL, Llosa NJ, Grout M, Döring G, Maira-Litrán T, et al. Evaluation of flagella and flagellin of Pseudomonas aeruginosa as vaccines. Infect Immun. 2010 Feb;78(2):746-55.

Campodónico VL, Llosa NJ, Bentancor LV, Maira-Litran T, Pier GB. Efficacy of a conjugate vaccine containing polymannuronic acid and flagellin against experimental Pseudomonas aeruginosa lung infection in mice. Infect Immun. 2011 Aug;79(8):3455-64.

Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Antibiotic Resistance Threats in the United States, 2013. http://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf. 2013.

Chaloupka I, Schuler A, Marschall M, Meier-Ewert H. Comparative analysis of six European influenza vaccines. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 1996 Feb;15(2):121-7.

Chang HH, Cohen T, Grad YH, Hanage WP, O'Brien TF, et al. Origin and proliferation of multiple-drug resistance in bacterial pathogens. Microbiol Mol Biol Rev. 2015 Mar;79(1):101-16.

Chen K, McAleer JP, Lin Y, Paterson DL, Zheng M, et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 2011 Dec 23;35(6):997-1009.

Chen, L., Chavda, K.D., Findlay, J., Peirano, G., Hopkins, K., Pitout, J.D., Bonomo, R.A., Woodford, N., DeLeo, F.R., Kreiswirth, B.N., 2014a. Multiplex PCR for identification of two capsular types in epidemic KPC-producing Klebsiella pneumoniae sequence Type 258 strains. Antimicrob. Agents Chemother. 58, 4196-4199.

Chen, L., Mathema, B., Pitout, J.D., DeLeo, F.R., Kreiswirth, B.N., 2014b. Epidemic Klebsiella pneumoniae ST258 is a hybrid strain. mBio 5, e01355-14.

Clegg S, Gerlach G F. Enterobacterial fimbriae. J Bacteriol. 1987;169:934-938.

Clements A, Gaboriaud F, Duval JF, Farn JL, Jenney AW, et al. The major surface-associated saccharides of Klebsiella pneumoniae contribute to host cell association. PLoS One. 2008;3(11):e3817.

Collignon P. Resistant Escherichia coli--we are what we eat. Clin Infect Dis. 2009 Jul 15;49(2):202-4.

Concepcion NF, Frasch CE. Pneumococcal type 22f polysaccharide absorption improves the specificity of a pneumococcal-polysaccharide enzyme-linked immunosorbent assay. Clin Diagn Lab Immunol. 2001 Mar;8(2):266-72.

Cross AS, Zollinger W, Mandrell R, Gemski P, Sadoff J. Evaluation of immunotherapeutic approaches for the potential treatment of infections caused by K1-positive Escherichia coli. J Infect Dis. 1983 Jan;147(1):68-76.

Cross AS, Gemski P, Sadoff JC, Orskov F, Orskov I. The importance of the K1 capsule in invasive infections caused by Escherichia coli. J Infect Dis. 1984 Feb;149(2):184-93.

Cross AS, Kim KS, Wright DC, Sadoff JC, Gemski P. Role of lipopolysaccharide and capsule in the serum resistance of bacteremic strains of Escherichia coli. J Infect Dis. 1986 Sep; 154(3):497-503.

Cross A, Artenstein A, Que J, Fredeking T, Furer E, et al. Safety and immunogenicity of a polyvalent Escherichia coli vaccine in human volunteers. J Infect Dis. 1994 Oct;170(4):834-40.

Crowe BA, Enzersberger O, Schober-Bendixen S, Mitterer A, Mundt W, et al. The first clinical trial of immuno's experimental Pseudomonas aeruginosa flagellar vaccines. Antibiot Chemother (1971). 1991;44:143-56.

Cryz SJ Jr, Fürer E, Germanier R. Protection against fatal Pseudomonas aeruginosa burn wound sepsis by immunization with lipopolysaccharide and high-molecular-weight polysaccharide. Infect Immun. 1984 Mar;43(3):795-9.

Cryz S J, Jr, Fürer E, Germanier R. Safety and immunogenicity of Klebsiella pneumoniae K1 capsular polysaccharide vaccine in humans. J Infect Dis. 1985;151:665-671.

Cryz SJ Jr, Mortimer P, Cross AS, Fürer E, Germanier R. Safety and immunogenicity of a polyvalent Klebsiella capsular polysaccharide vaccine in humans. Vaccine. 1986 Mar; 4(1):15-20.

Cryz SJ Jr, Mortimer PM, Mansfield V, Germanier R. Seroepidemiology of Klebsiella bacteremic isolates and implications for vaccine development. J Clin Microbiol. 1986 Apr; 23(4):687-90.

Cryz SJ Jr, Wedgwood J, Lang AB, Ruedeberg A, Que JU, et al. Immunization of noncolonized cystic fibrosis patients against Pseudomonas aeruginosa. J Infect Dis. 1994 May; 169(5):1159-62.

DeLeo, F.R., Chen, L., Porcella, S.F., Martens, C.A., Kobayashi, S.D., Porter, A.R., Chavda, K.D., Jacobs, M.R., Mathema, B., Olsen, R.J., Bonomo, R.A., Musser, J.M., Kreiswirth, B.N., 2014. Molecular dissection of the evolution of carbapenem-resistant multilocus sequence type 258 Klebsiella pneumoniae. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 111, 4988-4993.

Deng JC, Moore TA, Newstead MW, Zeng X, Krieg AM, et al. CpG oligodeoxynucleotides stimulate protective innate immunity against pulmonary Klebsiella infection. J Immunol. 2004 Oct 15;173(8):5148-55.

DiGiandomenico A, Sellman BR. Antibacterial monoclonal antibodies: the next generation?. Curr Opin Microbiol. 2015 Oct; 27:78-85.

DiGiandomenico A, Rao J, Goldberg JB. Oral vaccination of BALB/c mice with Salmonella enterica serovar Typhimurium expressing Pseudomonas aeruginosa O antigen promotes increased survival in an acute fatal pneumonia model. Infect Immun. 2004 Dec;72(12):7012-21.

DiGiandomenico A, Rao J, Harcher K, Zaidi TS, Gardner J, et al. Intranasal immunization with heterologously expressed polysaccharide protects against multiple Pseudomonas aeruginosa infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Mar 13;104(11):4624-9.

DiGiandomenico A, Warrener P, Hamilton M, Guillard S, Ravn P, et al. Identification of broadly protective human antibodies to Pseudomonas aeruginosa exopolysaccharide Psl by phenotypic screening. J Exp Med. 2012 Jul 2;209(7):1273-87.

DiGiandomenico A, Keller AE, Gao C, Rainey GJ, Warrener P, et al. A multifunctional bispecific antibody protects against Pseudomonas aeruginosa. Sci Transl Med. 2014 Nov 12;6(262):262ra155.

Domenico P, Schwartz S, Cunha BA. Reduction of capsular polysaccharide production in Klebsiella pneumoniae by sodium salicylate. Infect Immun. 1989 Dec;57(12):3778-82.

Döring G, Dorner F. A multicenter vaccine trial using the Pseudomonas aeruginosa flagella vaccine IMMUNO in patients with cystic fibrosis. Behring Inst Mitt. 1997 Feb;

Döring G, Pier GB. Vaccines and immunotherapy against Pseudomonas aeruginosa. Vaccine. 2008 Feb 20;26(8):1011-24.

Döring G, Pfeiffer C, Weber U, Mohr-Pennert A, Dorner F. Parenteral application of a Pseudomonas aeruginosa flagella vaccine elicits specific anti-flagella antibodies in the airways of healthy individuals. Am J Respir Crit Care Med. 1995 Apr;151(4):983-5.

Döring G, Meisner C, Stern M. A double-blind randomized placebo-controlled phase III study of a Pseudomonas aeruginosa flagella vaccine in cystic fibrosis patients. Proc Natl Acad Sci U S A. 2007 Jun 26;104(26):11020-5.

Du H, Chen L, Tang YW, Kreiswirth BN. Emergence of the mcr-1 colistin resistance gene in carbapenem-resistant Enterobacteriaceae. Lancet Infect Dis. 2016 Mar;16(3):287-8.

Edelman R, Taylor DN, Wasserman SS, McClain JB, Cross AS, et al. Phase 1 trial of a 24-valent Klebsiella capsular polysaccharide vaccine and an eight-valent Pseudomonas O-polysaccharide conjugate vaccine administered simultaneously. Vaccine. 1994 Nov;12(14):1288-94.

Faezi S, Sattari M, Mahdavi M, Roudkenar MH. Passive immunisation against Pseudomonas aeruginosa recombinant flagellin in an experimental model of burn wound sepsis. Burns. 2011 Aug; 37(5):865-72.

Faezi S, Safarloo M, Amirmozafari N, Nikokar I, Siadat SD, et al. Protective efficacy of Pseudomonas aeruginosa type-A flagellin in the murine burn wound model of infection. APMIS. 2014 Feb;122(2):115-27.

Feldman MF, Wacker M, Hernandez M, Hitchen PG, Marolda CL, et al. Engineering N-linked protein glycosylation with diverse O antigen lipopolysaccharide structures in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 2005 Feb 22;102(8):3016-21.

Fine PE. Herd immunity: history, theory, practice. Epidemiol Rev. 1993;15(2):265-302.

Foglia G, Shah S, Luxemburger C, Pietrobon PJ. Clostridium difficile: development of a novel candidate vaccine. Vaccine. 2012 Jun 19;30(29):4307-9.

Fowler VG Jr, Proctor RA. Where does a Staphylococcus aureus vaccine stand?. Clin Microbiol Infect. 2014 May; 20 Suppl 5:66-75.

B, Luyt CE, Dugard A, Wolff M, Diehl JL, et al. Safety and pharmacokinetics of an anti-PcrV PEGylated monoclonal antibody fragment in mechanically ventilated patients colonized with Pseudomonas aeruginosa: a randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Crit Care Med. 2012 Aug; 40(8):2320-6.

Frank DW, Vallis A, Wiener-Kronish JP, Roy-Burman A, Spack EG, et al. Generation and characterization of a protective monoclonal antibody to Pseudomonas aeruginosa PcrV. J Infect Dis. 2002 Jul 1;186(1):64-73.

Galanos C, Freudenberg MA, Reutter W. Galactosamine-induced sensitization to the lethal effects of endotoxin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979 Nov;76(11):5939-43.

Gerding DN, Meyer T, Lee C, Cohen SH, Murthy UK, et al. Administration of spores of nontoxigenic Clostridium difficile strain M3 for prevention of recurrent C difficile infection: a randomized clinical trial. JAMA. 2015 May 5;313(17):1719-27.

Gerlach GF, Clegg S, Allen BL. Identification and characterization of the genes encoding the type 3 and type 1 fimbrial adhesins of Klebsiella pneumoniae. J Bacteriol. 1989 Mar;171(3):1262-70.

Giakkoupi, P., Papagiannitsis, C.C., Miriagou, V., Pappa, O., Polemis, M., Tryfinopoulou, K., Tzouvelekis, L.S., Vatopoulos, A.C., 2011. An update of the evolving epidemic of blaKPC-2-carrying Klebsiella pneumoniae in Greece (2009-10). J. Antimicrob. Chemother. 66, 1510-1513.

Giani, T., Pini, B., Arena, F., Conte, V., Bracco, S., Migliavacca, R., Pantosti, A., Pagani, L., Luzzaro, F., Rossolini, G.M., 2013. Epidemic diffusion of KPC carbapenemase-producing Klebsiella pneumoniae in Italy: results of the first countrywide survey, 15 May to 30 June 2011. Eurosurveillance, 18.

Gransden WR, Eykyn SJ, Phillips I, Rowe B. Bacteremia due to Escherichia coli: a study of 861 episodes. Rev Infect Dis. 1990 Nov-Dec; 12(6):1008-18.

Greenberger MJ, Kunkel SL, Strieter RM, Lukacs NW, Bramson J, et al. IL-12 gene therapy protects mice in lethal Klebsiella pneumonia. J Immunol. 1996 Oct 1;157(7):3006-12.

Hansen DS, Mestre F, Alberti S, Hernández-Allés S, Alvarez D, et al. Klebsiella pneumoniae lipopolysaccharide O typing: revision of prototype strains and O-group distribution among clinical isolates from different sources and countries. J Clin Microbiol. 1999 Jan; 37(1):56-62.

Henriques-Normark B, Normark S. Bacterial vaccines and antibiotic resistance. Ups J Med Sci. 2014 May;119(2):205-8.

Holder IA, Naglich JG. Experimental studies of the pathogenesis of infections due to Pseudomonas aeruginosa: immunization using divalent flagella preparations. J Trauma. 1986 Feb;26(2):118-22.

Holder IA, Wheeler R, Montie TC. Flagellar preparations from Pseudomonas aeruginosa: animal protection studies. Infect Immun. 1982 Jan;35(1):276-80.

Holder IA, Neely AN, Frank DW. PcrV immunization enhances survival of burned Pseudomonas aeruginosa-infected mice. Infect Immun. 2001 Sep;69(9):5908-10.

Holliger P, Prospero T, Winter G. "Diabodies": small bivalent and bispecific antibody fragments. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8.

Horan T, Culver D, Jarvis W, Emori G, Banerjee S, Martone W, Thornsberry C. Pathogens Causing Nosocomial Infections. Antimicrobic Newsl. 1988 Sep;5(9):65-68.

Hornick DB, Allen BL, Horn MA, Clegg S. Adherence to respiratory epithelia by recombinant Escherichia coli expressing Klebsiella pneumoniae type 3 fimbrial gene products. Infect Immun. 1992 Apr;60(4):1577-88.

Hu R. et al., Outer Membrane Protein A (OmpA) Conferred Immunoprotection against Enterobacteriaceae Infection in Mice. Israel Journal of Veterinary Medicine. 2103. Vol. 68 (1):48-55.

Jansen KU, Girgenti DQ, Scully IL, Anderson AS. Vaccine review: "Staphyloccocus aureus vaccines: problems and prospects". Vaccine. 2013 Jun 7;31(25):2723-30.

Jones RJ, Roe EA, Lowbury EJ, Miler JJ, Spilsbury JF. A new Pseudomonas vaccine: preliminary trial on human volunteers. J Hyg (Lond). 1976 Jun;76(3):429-39.

Jones RJ, Roe EA, Gupta JL. Low mortality in burned patients in a Pseudomonas vaccine trial. Lancet. 1978 Aug 19;2(8086):401-3.

Jones RJ, Roe EA, Gupta JL. Controlled trials of a polyvalent pseudomonas vaccine in burns. Lancet. 1979 Nov 10;2(8150):977-82.

Jones RJ, Roe EA, Gupta JL. Controlled trial of Pseudomonas immunoglobulin and vaccine in burn patients. Lancet. 1980 Dec 13;2(8207):1263-5.

Kaijser B, Ahlstedt S. Protective capacity of antibodies against Escherichia coli and K antigens. Infect Immun. 1977 Aug; 17(2):286-9.

Kelly, RF et al., 1995. Structures of the O-antigens of Klebsiella serotypes 02 (2a,2e), 02 (2a,2e,2h), and 02 (2a,2f,2g), members of a family of related D-galactan O-antigens in Klebsiella spp. J. Endotoxin Res. 2:131-140.

Kim KH, Yu J, Nahm MH. Efficiency of a pneumococcal opsonophagocytic killing assay improved by multiplexing and by coloring colonies. Clin Diagn Lab Immunol. 2003 Jul; 10(4):616-21.

Knirel YA, Bystrova OV, Kocharova NA, Zähringer U, Pier GB. Conserved and variable structural features in the lipopolysaccharide of Pseudomonas aeruginosa. J Endotoxin Res. 2006;12(6):324-36.

Kojima K, Ishizaka A, Oshika E, Taguchi Y, Tomizawa K, et al. Quantitation of IgG subclass antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides by ELISA, using Pneumovax-specific antibodies as a reference. Tohoku J Exp Med. 1990 Jul;161(3):209-15.

Kol, O., Wieruszeski, J.M., Strecker, G., Fournet, B., Zalisz, R., Smets, P., 1992. Structure of the O-specific polysaccharide chain of Klebsiella pneumoniae O1K2 (NCTC 5055) lipopolysaccharide. A complementary elucidation. Carbohydr. Res. 236, 339-344.

Koskela M, Leinonen M. Comparison of ELISA and RIA for measurement of pneumococcal antibodies before and after vaccination with 14-valent pneumococcal capsular polysaccharide vaccine. J Clin Pathol. 1981 Jan;34(1):93-8.

Kreger BE, Craven DE, Carling PC, McCabe WR. Gram-negative bacteremia III Reassessment of etiology, epidemiology and ecology in 612 patients. Am J Med. 1980 Mar; 68(3):332-43.

Lal G, Balmer P, Stanford E, Martin S, Warrington R, et al. Development and validation of a nonaplex assay for the simultaneous quantitation of antibodies to nine Streptococcus pneumoniae serotypes. J Immunol Methods. 2005 Jan;296(1-2):135-47.

Landman, D., Babu, E., Shah, N., Kelly, P., Olawole, O., Backer, M., Bratu, S., Quale, J., 2012. Transmission of carbapenem-resistant pathogens in New York City hospitals: progress and frustration. J. Antimicrob. Chemother. 67, 1427-1431.

Lang AB, Schaad UB, Rüdeberg A, Wedgwood J, Que JU, et al. Effect of high-affinity anti-Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide antibodies induced by immunization on the rate of Pseudomonas aeruginosa infection in patients with cystic fibrosis. J Pediatr. 1995 Nov; 127(5):711-7.

Langford DT, Hiller J. Prospective, controlled study of a polyvalent pseudomonas vaccine in cystic fibrosis--three year results. Arch Dis Child. 1984 Dec;59(12):1131-4.

Langstraat J, Bohse M, Clegg S. Type 3 fimbrial shaft (MrkA) of Klebsiella pneumoniae, but not the fimbrial adhesin (MrkD), facilitates biofilm formation. Infect Immun. 2001 Sep; 69(9):5805-12.

Leach S, Clements JD, Kaim J, Lundgren A. The adjuvant double mutant Escherichia coli heat labile toxin enhances IL-17A production in human T cells specific for bacterial vaccine antigens. PLoS One. 2012;7(12):e51718. doi: 10.1371.

Levin BR, Cornejo OE. The population and evolutionary dynamics of homologous gene recombination in bacterial populations. PLoS Genet. 2009 Aug; 5(8):e1000601.

Levin BR, Stewart FM, Rice VA. The kinetics of conjugative plasmid transmission: fit of a simple mass action model. Plasmid. 1979 Apr;2(2):247-60.

Lipsitch M, Siber GR. How Can Vaccines Contribute to Solving the Antimicrobial Resistance Problem?. MBio. 2016 Jun 7;7(3)

Liu Y, Filler SG. Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryot Cell. 2011 Feb;10(2):168-73.

Liu YY, Wang Y, Walsh TR, Yi LX, Zhang R, et al. Emergence of plasmid-mediated colistin resistance mechanism MCR-1 in animals and human beings in China: a microbiological and molecular biological study. Lancet Infect Dis. 2016 Feb;16(2):161-8.

Ma L, Jackson KD, Landry RM, Parsek MR, Wozniak DJ. Analysis of Pseudomonas aeruginosa conditional psl variants reveals roles for the psl polysaccharide in adhesion and maintaining biofilm structure post attachment. J Bacteriol. 2006 Dec;188(23):8213-21.

Magill SS, Edwards JR, Bamberg W, Beldavs ZG, Dumyati G, et al. Multistate point-prevalence survey of health care-associated infections. N Engl J Med. 2014 Mar 27;370(13):1198-208.

Mandine E, Salles MF, Zalisz R, Guenounou M, Smets P. Murine monoclonal antibodies to Klebsiella pneumoniae protect against lethal endotoxemia and experimental infection with capsulated K pneumoniae. Infect Immun. 1990 Sep;58(9):2828-33.

Martin, EW, Ed. Remington’s Pharmaceutical Sciences. 15th ed. Easton, PA: Mack Publishing Company, 1975.

Martinez JE, Romero-Steiner S, Pilishvili T, Barnard S, Schinsky J, et al. A flow cytometric opsonophagocytic assay for measurement of functional antibodies elicited after vaccination with the 23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine. Clin Diagn Lab Immunol. 1999 Jul;6(4):581-6.

McCabe WR, Kaijser B, Olling S, Uwaydah M, Hanson LA. Escherichia coli in bacteremia: K and O antigens and serum sensitivity of strains from adults and neonates. J Infect Dis. 1978 Jul;138(1):33-41.

McGann P, Chahine S, Okafor D, Ong AC, Maybank R, et al. Detecting 16S rRNA Methyltransferases in Enterobacteriaceae by Use of Arbekacin. J Clin Microbiol. 2016 Jan; 54(1):208-11.

Meir A, Helppolainen SH, Podoly E, Nordlund HR, Hytönen VP, et al. Crystal structure of rhizavidin: insights into the enigmatic high-affinity interaction of an innate biotin-binding protein dimer. J Mol Biol. 2009 Feb 20;386(2):379-90.

Milla CE, Chmiel JF, Accurso FJ, VanDevanter DR, Konstan MW, et al. Anti-PcrV antibody in cystic fibrosis: a novel approach targeting Pseudomonas aeruginosa airway infection. Pediatr Pulmonol. 2014 Jul;49(7):650-8.

Misener S and Krawetz SA, Eds., Bioinformatics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Volume 132). Totowa, NJ: Humana Press, 1999.

Montie TC, Drake D, Sellin H, Slater O, Edmonds S. Motility, virulence, and protection with a flagella vaccine against Pseudomonas aeruginosa infection. Antibiot Chemother (1971). 1987;39:233-48.

Moore TA, Perry ML, Getsoian AG, Newstead MW, Standiford TJ. Divergent role of gamma interferon in a murine model of pulmonary versus systemic Klebsiella pneumoniae infection. Infect Immun. 2002 Nov;70(11):6310-8.

Moriel DG, Bertoldi I, Spagnuolo A, Marchi S, Rosini R, et al. Identification of protective and broadly conserved vaccine antigens from the genome of extraintestinal pathogenic Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 May 18;107(20):9072-7.

Munro CS, Stanley PJ, Cole PJ. Assessment of biological activity of immunoglobulin preparations by using opsonized micro-organisms to stimulate neutrophil chemiluminescence. Clin Exp Immunol. 1985 Jul;61(1):183-8.

Murphy CN, Clegg S. Klebsiella pneumoniae and type 3 fimbriae: nosocomial infection, regulation and biofilm formation. Future Microbiol. 2012 Aug;7(8):991-1002.

Navon-Venezia, S., Leavitt, A., Schwaber, M.J., Rasheed, J.K., Srinivasan, A., Patel, J.B., Carmeli, Y., 2009. First report on a hyperepidemic clone of KPC-3-producing Klebsiella pneumoniae in Israel genetically related to a strain causing outbreaks in the United States. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 818-820.

Neely AN, Bhattacharjee AK, Babcock GF, Holder IA, Cross AS. Differential effects of two different routes of immunization on protection against gram-negative sepsis by a detoxified Escherichia coli J5 lipopolysaccharide group B meningococcal outer membrane protein complex vaccine in a burned mouse model. J Burn Care Rehabil. 2002 Sep-Oct;23(5):333-40.

Nesta B, Spraggon G, Alteri C, Moriel DG, Rosini R, et al. FdeC, a novel broadly conserved Escherichia coli adhesin eliciting protection against urinary tract infections. MBio. 2012;3(2)

Norton EB et al., Characterization of a Mutant Escherichia coli Heat-Labile Toxin, LT(R192G/L211A), as a Safe and Effective Oral Adjuvant. Clin Vaccine Immunol. 2011 18:546-551.

Norton EB et al., The A Subunit of Escherichia coli Heat-Labile Enterotoxin Functions as a Mucosal Adjuvant and Promotes IgG2a, IgA, and Th17 Responses to Vaccine Antigens. Infection and Immunity 2012, 80:2426-2435.

Ojo-Amaize EA, Church JA, Barka NE, Agopian MS, Peter JB. A rapid and sensitive chemiluminescence assay for evaluation of functional opsonic activity of Haemophilus influenzae type b-specific antibodies. Clin Diagn Lab Immunol. 1995 May;2(3):286-90.

Old DC, Adegbola RA. Antigenic relationships among type-3 fimbriae of Enterobacteriaceae revealed by immunoelectronmicroscopy. J Med Microbiol. 1985 Aug; 20(1):113-21.

Pereira, P.S., de Araujo, C.F., Seki, L.M., Zahner, V., Carvalho-Assef, A.P., Asensi, M.D., 2013. Update of the molecular epidemiology of KPC-2-producing Klebsiella pneumoniae in Brazil: spread of clonal complex 11 (ST11 ST437 and ST340). J. Antimicrob. Chemother. 68, 312-316.

Pickering JW, Martins TB, Greer RW, Schroder MC, Astill ME, et al. A multiplexed fluorescent microsphere immunoassay for antibodies to pneumococcal capsular polysaccharides. Am J Clin Pathol. 2002 Apr; 117(4):589-96.

Podschun R, Ullmann U. Klebsiella spp as nosocomial pathogens: epidemiology, taxonomy, typing methods, and pathogenicity factors. Clin Microbiol Rev. 1998 Oct;11(4):589-603.

Poljak RJ. Production and structure of diabodies. Structure. 1994 Dec 15;2(12):1121-3.

Poolman JT, Wacker M. Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli, a Common Human Pathogen: Challenges for Vaccine Development and Progress in the Field. J Infect Dis. 2016 Jan 1;213(1):6-13.

Powell MF and Newman MJ, Eds. Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach. New York, NY: Plenum Press, 1995.

Priebe GP, Walsh RL, Cederroth TA, Kamei A, Coutinho-Sledge YS, et al. IL-17 is a critical component of vaccine-induced protection against lung infection by lipopolysaccharide-heterologous strains of Pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 2008 Oct 1;181(7):4965-75.

Qi, Y., Wei, Z., Ji, S., Du, X., Shen, P., Yu, Y., 2011. ST11, the dominant clone of KPC-producing Klebsiella pneumoniae in China. J. Antimicrob. Chemother. 66, 307-312.

Ramachandran G, Boyd MA, MacSwords J, Higginson EE, Simon R, et al. Opsonophagocytic Assay To Evaluate Immunogenicity of Nontyphoidal Salmonella Vaccines. Clin Vaccine Immunol. 2016 Jun;23(6):520-3.

Rappuoli R. Reverse vaccinology. Curr Opin Microbiol. 2000 Oct;3(5):445-50.

Rayner BL, Willcox PA. Community-acquired bacteraemia; a prospective survey of 239 cases. Q J Med. 1988 Nov;69(259):907-19.

Robbins JB, McCracken GH Jr, Gotschlich EC, Orskov F, Orskov I, et al. Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis. N Engl J Med. 1974 May 30;290(22):1216-20.

Romero-Steiner S, Libutti D, Pais LB, Dykes J, Anderson P, et al. Standardization of an opsonophagocytic assay for the measurement of functional antibody activity against Streptococcus pneumoniae using differentiated HL-60 cells. Clin Diagn Lab Immunol. 1997 Jul;4(4):415-22.

Romero-Steiner S, Holder PF, Gomez de Leon P, Spear W, Hennessy TW, et al. Avidity determinations for Haemophilus influenzae Type b anti-polyribosylribitol phosphate antibodies. Clin Diagn Lab Immunol. 2005 Sep;12(9):1029-35.

Ross PJ, Sutton CE, Higgins S, Allen AC, Walsh K, et al. Relative contribution of Th1 and Th17 cells in adaptive immunity to Bordetella pertussis: towards the rational design of an improved acellular pertussis vaccine. PLoS Pathog. 2013;9(4):e1003264.

Saeland E, Vidarsson G, Jonsdottir I. Pneumococcal pneumonia and bacteremia model in mice for the analysis of protective antibodies. Microb Pathog. 2000 Aug;29(2):81-91.

Saha S, Takeshita F, Matsuda T, Jounai N, Kobiyama K, et al. Blocking of the TLR5 activation domain hampers protective potential of flagellin DNA vaccine. J Immunol. 2007 Jul 15;179(2):1147-54.

Sambrook J, Maniatis T and Fritsch EF. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

Sawa T, Yahr TL, Ohara M, Kurahashi K, Gropper MA, et al. Active and passive immunization with the Pseudomonas V antigen protects against type III intoxication and lung injury. Nat Med. 1999 Apr;5(4):392-8.

Schaad UB, Lang AB, Wedgwood J, Ruedeberg A, Que JU, et al. Safety and immunogenicity of Pseudomonas aeruginosa conjugate A vaccine in cystic fibrosis. Lancet. 1991 Nov 16;338(8777):1236-7.

Schaberg DR, Culver DH, Gaynes RP. Major trends in the microbial etiology of nosocomial infection. Am J Med. 1991 Sep 16;91(3B):72S-75S.

Schmidt AC, McAuliffe JM, Murphy BR, Collins PL. Recombinant bovine/human parainfluenza virus type 3 (B/HPIV3) expressing the respiratory syncytial virus (RSV) G and F proteins can be used to achieve simultaneous mucosal immunization against RSV and HPIV3. J Virol. 2001 May;75(10):4594-603.

Schmidt CS, White CJ, Ibrahim AS, Filler SG, Fu Y, et al. NDV-3, a recombinant alum-adjuvanted vaccine for Candida and Staphylococcus aureus, is safe and immunogenic in healthy adults. Vaccine. 2012 Dec 14;30(52):7594-600.

Schweizer HP. Allelic exchange in Pseudomonas aeruginosa using novel ColE1-type vectors and a family of cassettes containing a portable oriT and the counter-selectable Bacillus subtilis sacB marker. Mol Microbiol. 1992 May;6(9):1195-204.

Scully IL, Liberator PA, Jansen KU, Anderson AS. Covering all the Bases: Preclinical Development of an Effective Staphylococcus aureus Vaccine. Front Immunol. 2014 Mar 24;5:109.

Shime N, Sawa T, Fujimoto J, Faure K, Allmond LR, et al. Therapeutic administration of anti-PcrV F(ab')(2) in sepsis associated with Pseudomonas aeruginosa. J Immunol. 2001 Nov 15;167(10):5880-6.

Simon R, Samuel CE. Activation of NF-kappaB-dependent gene expression by Salmonella flagellins FliC and FljB. Biochem Biophys Res Commun. 2007 Mar 30;355(1):280-5.

Song WS, Yoon SI. Crystal structure of FliC flagellin from Pseudomonas aeruginosa and its implication in TLR5 binding and formation of the flagellar filament. Biochem Biophys Res Commun. 2014 Feb 7;444(2):109-15.

Stack AM, Malley R, Thompson CM, Kobzik L, Siber GR, et al. Minimum protective serum concentrations of pneumococcal anti-capsular antibodies in infant rats. J Infect Dis. 1998 Apr;177(4):986-90.

Szijártó V. et al., 2016. Both clades of the epidemic KPC-producing Klebsiella pneumoniae clone ST258 share a modified galactan O-antigen type. International Journal of Medical Microbiology 306:89-98.

Tarkkanen AM, Virkola R, Clegg S, Korhonen TK. Binding of the type 3 fimbriae of Klebsiella pneumoniae to human endothelial and urinary bladder cells. Infect Immun. 1997 Apr;65(4):1546-9.

Tarkkanen AM, Allen BL, Westerlund B, Holthöfer H, Kuusela P, et al. Type V collagen as the target for type-3 fimbriae, enterobacterial adherence organelles. Mol Microbiol. 1990 Aug;4(8):1353-61.

Thammavongsa V, Kim HK, Missiakas D, Schneewind O. Staphylococcal manipulation of host immune responses. Nat Rev Microbiol. 2015 Sep;13(9):529-43.

Therasse P, Arbuck SG, Eisenhauer EA, Wanders J, Kaplan RS, et al. New Guidelines to Evaluate the Response to Treatment in Solid Tumors. J Natl Cancer Inst. 2000 Feb 2;92(3):205-216.

Tomas JM, Camprubi S, Williams P. Surface exposure of the O-antigen in Klebsiella pneumoniae O1:K1 serotype strains. Microb Pathog. 1988 Aug;5(2):141-7.

Toprani VS. et al., Development of a candidate stabilizing formulation for bulk storage of a double mutant heat labile toxin (dmLT) protein based adjuvant. Vaccine. 2017. 35:5471-548.

Trautmann, M., et al., 1997. O-Antigen Seroepidemiology of Klebsiella Clinical Isolates and Implications for Immunoprophylaxis of Klebsiella Infections. Clinical and Diagnostic Laboratory Immnuology 4:550-555.

Westritschnig K, Hochreiter R, Wallner G, Firbas C, Schwameis M, Jilma B. 2014. A randomized, placebo-controlled phase I study assessing the safety and immunogenicity of a Pseudomonas aeruginosa hybrid outer membrane protein OprF/I vaccine (IC43) in healthy volunteers. Hum Vaccin Immunother 10:170-183.

Ullmann U. [Bacterial infection agents in hospitalized patients]. Zentralbl Bakteriol Mikrobiol Hyg B. 1986 Dec;183(2-3):103-13.

Vaudaux P and Waldvogel FA (1979). Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrob Agents Chemother. 16 (6): 743-749.

Vinogradov E, Frirdich E, MacLean LL, Perry MB, Petersen BO, et al. Structures of lipopolysaccharides from Klebsiella pneumoniae Eluicidation of the structure of the linkage region between core and polysaccharide O chain and identification of the residues at the non-reducing termini of the O chains. J Biol Chem. 2002 Jul 12;277(28):25070-81.

Wang Q, Chang CS, Pennini M, Pelletier M, Rajan S, et al. Target-Agnostic Identification of Functional Monoclonal Antibodies Against Klebsiella pneumoniae Multimeric MrkA Fimbrial Subunit. J Infect Dis. 2016 Jun 1;213(11):1800-8.

Walczak MJ, Puorger C, Glockshuber R, Wider G. Intramolecular donor strand complementation in the E. coli type 1 pilus subunit FimA explains the existence of FimA monomers as off-pathway products of pilus assembly that inhibit host cell apoptosis. J Mol Biol. 2014 Feb 6;426(3):542-9.

Warfel JM, Zimmerman LI, Merkel TJ. Acellular pertussis vaccines protect against disease but fail to prevent infection and transmission in a nonhuman primate model. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014 Jan 14;111(2):787-92.

Warrener P, Varkey R, Bonnell JC, DiGiandomenico A, Camara M, et al. A novel anti-PcrV antibody providing enhanced protection against Pseudomonas aeruginosa in multiple animal infection models. Antimicrob Agents Chemother. 2014 Aug;58(8):4384-91.

Welch WD, Martin WJ, Stevens P, Young LS. Relative opsonic and protective activities of antibodies against K1, O and lipid A antigens of Escherichia coli. Scand J Infect Dis. 1979;11(4):291-301.

Whitfield, C., Perry, M.B., MacLean, L.L., Yu, S.H., 1992. Structural analysis of the O-antigen side chain polysaccharides in the lipopolysaccharides of Klebsiella serotypes O2(2a) O2(2a, 2b), and O2(2a, 2c). J. Bacteriol. 174, 4913-4919.

Whitfield, C., Richards, J.C., Perry, M.B., Clarke, B.R., MacLean, L.L., 1991. Expression of two structurally distinct d-galactan O antigens in the lipopolysaccharide of Klebsiella pneumoniae serotype O1. J. Bacteriol. 173, 1420-1431.

Woodford N, Turton JF, Livermore DM. Multiresistant Gram-negative bacteria: the role of high-risk clones in the dissemination of antibiotic resistance. FEMS Microbiol Rev. 2011 Sep;35(5):736-55.

World Health Organization (WHO). Antimicrobial Resistance - Global Report on Surveillance. 2014.

Wu W, Huang J, Duan B, Traficante DC, Hong H, et al. Th17-stimulating protein vaccines confer protection against Pseudomonas aeruginosa pneumonia. Am J Respir Crit Care Med. 2012 Sep 1;186(5):420-7.

Würker M, Beuth J, Ko HL, Przondo-Mordarska A, Pulverer G. Type of fimbriation determines adherence of Klebsiella bacteria to human epithelial cells. Zentralbl Bakteriol. 1990 Nov;274(2):239-45

Zhang F, Lu YJ, Malley R. Multiple antigen-presenting system (MAPS) to induce comprehensive B- and T-cell immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Aug 13;110(33):13564-9.

Эквиваленты

Специалисты в данной области смогут обнаружить, или разработать с использованием не более чем рутинного экспериментирования, множество эквивалентов конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в настоящем изобретении. Объем настоящего изобретения не должен быть ограничен вышеприведенным описанием, но лишь следующей далее формулой изобретения.

1. Иммуногенная композиция, содержащая (i) каркасный полимер, включающий полимер и один или более антигенных полисахаридов, конъюгированных с полимером; и (ii) один или более полипептидных антигенов в нековалентном комплексе с полимером и/или антигенным полисахаридом;

в которой полимер представляет собой капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19; и

в которой каждый из одного или более антигенных полисахаридов представляет собой O-антигенный полисахарид (OPS) K. pneumoniae и/или P. aeruginosa; и

в которой каждый из одного или более полипептидных антигенов независимо выбран из: флагеллина P. aeruginosa, PcrV P. aeruginosa, MrkA K. pneumoniae, их антигенных фрагментов и их комбинации; и

причем иммуногенная композиция характеризуется тем, что после введения субъекту она вызывает иммунный ответ против Klebsiella и/или Pseudomonas.

2. Иммуногенная композиция по п. 1, в которой один или более полипептидных антигенов находятся в нековалентном комплексе с полимером и/или одним или более антигенными полисахаридами за счет по меньшей мере одной пары комплементарных аффинных молекул, включающей (i) первую аффинную молекулу и (ii) вторую аффинную молекулу, комплементарную первой молекуле, где первая аффинная молекула связана с полимером и/или одним или более антигенными полисахаридами, и вторая аффинная молекула связана с одним или более полипептидными антигенами.

3. Иммуногенная композиция по п. 2, в которой пара аффинных молекул выбрана из группы, состоящей из: биотина/биотинсвязывающего белка, антитела/антигена, фермента/субстрата, рецептора/лиганда, металла/металлсвязывающего белка, углевода/углеводсвязывающего белка, липида/липидсвязывающего белка и His-метки/His-метку-связывающей молекулы.

4. Иммуногенная композиция по п. 2 или 3, в которой первая аффинная молекула представляет собой биотин или его производное, и вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен.

5. Иммуногенная композиция по п. 4, в которой биотинсвязывающий белок представляет собой ризавидин или его биотинсвязывающий домен.

6. Иммуногенная композиция по любому из пп. 2-5, в которой первая аффинная молекула перекрестно сшита или ковалентно связана с полимером и/или одним или более антигенными полисахаридами.

7. Иммуногенная композиция по любому из пп. 2-6, в которой один или более полипептидных антигенов содержат один или несколько белков или вариантов P. aeruginosa, и где вторая аффинная молекула содержит биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен.

8. Иммуногенная композиция по любому из пп. 2-7, в которой один или более полипептидных антигенов содержат по меньшей мере два полипептидных антигена.

9. Иммуногенная композиция по любому из пп. 2-8, в которой один или более полипептидных антигенов связываются со второй аффинной молекулой с образованием слитого белка.

10. Иммуногенная композиция по п. 9, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

где один или более полипептидных антигенов содержат (i) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 подтипа В флагеллина P. aeruginosa (FlaBD2), лишенный TLR5-связывающего мотива) или его иммуногенный фрагмент, или (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 11 (домен D2 подтипа А1 флагеллина P. aeruginosa (FlaA1), лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, или (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 12 (домен D2 подтипа А2 флагеллина P. aeruginosa (FlaA2), лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент.

11. Иммуногенная композиция по п. 9, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

где один или более полипептидных антигенов содержат полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 подтипа В флагеллина P. aeruginosa (FlaBD2) без мотива связывания TLR5), или ее иммуногенный фрагмент.

12. Иммуногенная композиция по п. 9, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

где один или более полипептидных антигенов содержат полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

13. Иммуногенная композиция по п. 9, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

где один или более полипептидных антигенов содержат полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент.

14. Иммуногенная композиция по п. 9, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

15. Иммуногенная композиция по п. 9, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

16. Иммуногенная композиция по п. 9, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

17. Иммуногенная композиция по п. 9, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

18. Иммуногенная композиция по любому из пп. 11-17, отличающаяся тем, что при введении пациенту иммуногенная композиция вызывает продуцирование антител, которые распознают нативный MrkA на K. pneumoniae, экспрессирующей MrkA.

19. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-18, в которой один или более антигенных полисахаридов содержат OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae или их комбинацию.

20. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-19, в которой один или более антигенных полисахаридов содержат OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11, O12 P. aeruginosa или их комбинацию.

21. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-20, в которой по меньшей мере один из полипептидных антигенов содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 (MrkA K. pneumoniae), и/или аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 3, или ее иммуногенный фрагмент.

22. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-21, в которой по меньшей мере один из полипептидных антигенов представляет собой флагеллин подтипа A P. aeruginosa, флагеллин подтипа B P. aeruginosa или его иммуногенный фрагмент.

23. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-22, в которой по меньшей мере один из полипептидных антигенов содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

24. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-23, в которой по меньшей мере один из полипептидных антигенов содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B FliC P. aeruginosa (FlaB)), или ее иммуногенный фрагмент.

25. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-24, в которой по меньшей мере один из полипептидных антигенов содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 подтипа B флагеллина P. aeruginosa (FlaBD2), в котором отсутствует мотив связывания TLR5), или ее иммуногенный фрагмент.

26. Иммуногенная композиция, содержащая

(a) каркасный полимер, включающий

(i) полимер, содержащий капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19; и

(ii) один или более антигенных полисахаридов, содержащих O-антигенный полисахарид (OPS) Klebsiella и/или Pseudomonas, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19; и

(b) один или более полипептидных антигенов в нековалентном комплексе с полимером за счет по меньшей мере одной пары аффинных молекул, включающей

(i) первую аффинную молекулу, связанную с полимером; и

(ii) вторую аффинную молекулу, комплементарную первой молекуле и связанную с одним или более полипептидными антигенами, где каждый из одного или более полипептидных антигенов независимо выбран из: флагеллина P. aeruginosa, PcrV P. aeruginosa, MrkA K. pneumoniae, их антигенных фрагментов или их комбинации; и

27. Иммуногенная композиция по п. 26, в которой один или более антигенных полисахаридов содержат OPS типа O1, O2, O3, O5 K. pneumoniae или их комбинацию.

28. Иммуногенная композиция по п. 26 или 27, в которой один или более антигенных полисахаридов содержат OPS типа O1, O2, O3, O4, O5, O6, O10, O11 P. aeruginosa или их комбинацию.

29. Иммуногенная композиция по любому из пп. 26-28, в которой первая аффинная молекула представляет собой биотин или его производное, и вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен.

30. Иммуногенная композиция по п. 29, в которой биотинсвязывающий белок представляет собой ризавидин или его биотинсвязывающий домен.

31. Иммуногенная композиция по любому из пп. 26-30, в которой один или более полипептидных антигенов выбраны из домена D2 флагеллина подтипа B P. aeruginosa (FlaBD2), лишенного TLR5-связывающего мотива, PcrV P. aeruginosa, MrkA K. pneumoniae, их антигенных фрагментов или их комбинации.

32. Иммуногенная композиция по любому из пп. 26-31, в которой один или более полипептидных антигенов содержат один или более белков или вариантов P. aeruginosa, и где вторая аффинная молекула содержит биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен.

33. Иммуногенная композиция по любому из пп. 26-32, в которой по меньшей мере один из полипептидных антигенов содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 7 (флагеллин подтипа B (FlaB) P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

34. Иммуногенная композиция по любому из пп. 26-33, в которой по меньшей мере один из полипептидных антигенов содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 подтипа B флагеллина P. aeruginosa (FlaBD2), лишенный мотива связывания TLR5), или ее иммуногенный фрагмент.

35. Иммуногенная композиция по любому из пп. 26-34, в которой по меньшей мере один из полипептидных антигенов содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

36. Иммуногенная композиция по любому из пп. 26-35, в которой по меньшей мере один из полипептидных антигенов содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент.

37. Иммуногенная композиция по любому из пп. 26-36, в которой один или более полипептидных антигенов содержат по меньшей мере два полипептидных антигена.

38. Иммуногенная композиция по любому из пп. 26-37, в которой один или более полипептидных антигенов связываются со второй аффинной молекулой с образованием слитого белка.

39. Композиция п. 38, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

40. Иммуногенная композиция по п. 38, в которой слитый белок содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 24 (Rhavi-FlaB-Домен2-MrkA-His).

41. Иммуногенная композиция по п. 38, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

42. Иммуногенная композиция по п. 38, в которой слитый белок содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 26.

43. Иммуногенная композиция по п. 38, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

где один или более полипептидных антигенов содержат (i) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 подтипа В флагеллина P. aeruginosa (FlaBD2), лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, или (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 11 (домен D2 подтипа А1 флагеллина P. aeruginosa (FlaA1), лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, или (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 12 (домен D2 подтипа А2 флагеллина P. aeruginosa (FlaA2), лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент.

44. Иммуногенная композиция по п. 38, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

45. Иммуногенная композиция по п. 38, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

где один или более полипептидных антигенов содержат полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa) или ее иммуногенный фрагмент.

46. Иммуногенная композиция по п. 38, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

где один или более полипептидных антигенов содержат полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент.

47. Иммуногенная композиция по п. 38, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

48. Иммуногенная композиция по п. 38, в которой слитый белок содержит один или более полипептидных антигенов и вторую аффинную молекулу,

где вторая аффинная молекула представляет собой биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, и

49. Иммуногенная композиция по любому из пп. 39-48, отличающаяся тем, что при введении пациенту иммуногенная композиция вызывает продуцирование антител, которые распознают нативный MrkA на K. pneumoniae, экспрессирующей MrkA.

50. Вакцинная композиция, содержащая:

(a) первую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(b) вторую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(c) третью иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и

(d) четвертую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, KP O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером,

где вакцинная композиция отличается тем, что при введении пациенту она вызывает иммунный ответ против Klebsiella.

51. Вакцинная композиция, содержащая:

(a) первую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(b) вторую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(c) третью иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(d) четвертую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(e) пятую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(f) шестую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(g) седьмую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и

(h) восьмую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

где вакцинная композиция отличается тем, что при введении пациенту она вызывает иммунный ответ против Pseudomonas.

52. Вакцинная композиция, содержащая:

(e) пятую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O1 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(f) шестую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O2 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(g) седьмую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O3 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(h) восьмую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O4 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(i) девятую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O5 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(j) десятую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O6 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

(k) одиннадцатую иммуногенную иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O10 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером; и

(l) двенадцатую иммуногенную композицию по п. 1, содержащую каркасный полимер, включающий полимер, представляющий собой биотинилированный капсульный полисахарид Klebsiella spp. K19, PA O11 OPS, конъюгированный с капсульным полисахаридом Klebsiella spp. K19, и слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA в нековалентном комплексе с биотинилированным каркасным полимером;

где вакцинная композиция отличается тем, что при введении пациенту она вызывает иммунный ответ против Klebsiella и/или Pseudomonas.

53. Вакцинная композиция по любому из пп. 50-52, в которой слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA и/или слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV содержит (i) биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен и (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности c последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 подтипа В флагеллина P. aeruginosa (FlaBD2) без мотива связывания TLR5), или ее иммуногенный фрагмент.

54. Вакцинная композиция по любому из пп. 50-52, в которой слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV содержит (i) биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен и (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

55. Вакцинная композиция по любому из пп. 50-52, в которой белок Rhavi-FlaBD2-PcrV содержит (i) биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина FlaB, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 8 (PcrV P. aeruginosa), или ее иммуногенный фрагмент.

56. Вакцинная композиция по любому из пп. 50-52, в которой слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA содержит (i) биотинсвязывающий белок или его биотинсвязывающий домен, (ii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 10 (домен D2 флагеллина FlaB, лишенный TLR5-связывающего мотива), или ее иммуногенный фрагмент, и (iii) полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3 (MrkA K. pneumoniae), или ее иммуногенный фрагмент.

57. Вакцинная композиция по любому из пп. 50-52, отличающаяся тем, что при введении пациенту вакцинная композиция вызывает продуцирование антител, которые распознают нативный MrkA на K. pneumoniae, экспрессирующей MrkA.

58. Вакцинная композиция по любому из пп. 50-52, в которой слитый белок Rhavi-FlaBD2-MrkA содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 24.

59. Вакцинная композиция по любому из пп. 50-52, в которой слитый белок Rhavi-FlaBD2-PcrV содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 26.

60. Иммуногенная композиция или вакцинная композиция по любому из пп. 1-59, причем иммунный ответ представляет собой выработку антител или B-клеточный ответ.

61. Иммуногенная композиция или вакцинная композиция по любому из пп. 1-59, причем иммунный ответ представляет собой CD4+ T-клеточный ответ, включая Th1, Th2 или Th17 ответ, или CD8+ T-клеточный ответ, или CD4+/CD8+ T-клеточный ответ.

62. Иммуногенная композиция или вакцинная композиция по любому из пп. 1-59, причем иммунный ответ представляет собой:

антительный или B-клеточный ответ; и

T-клеточный ответ.

63. Фармацевтическая композиция, содержащая одну или более иммуногенных композиций или вакцинных композиций по пп. 1-62 и фармацевтически приемлемый носитель, где фармацевтическая композиция отличается тем, что при введении пациенту она вызывает иммунный ответ против Klebsiella и/или Pseudomonas.

64. Фармацевтическая композиция по п. 63, дополнительно содержащая фосфатом алюминия в качестве адъюванта.

65. Фармацевтическая композиция по п. 63 или 64, составленная для инъекции.

66. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 63-65, отличающаяся тем, что после введения пациенту фармацевтическая композиция вызывает Th1 и/или Th17 клеточный ответ.

67. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 63-66, отличающаяся тем, что после введения пациенту фармацевтическая композиция вызывает опсонический/бактерицидный ответ против одного или более из Klebsiella и Pseudomonas.

68. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 63-67, отличающаяся тем, что после введения пациенту фармацевтическая композиция приводит к уменьшению скорости передачи инфекции и/или колонизации слизистых поверхностей одним или более из Klebsiella и Pseudomonas.

69. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 63-68, отличающаяся тем, что после введения пациенту фармацевтическая композиция приводит к уменьшению скорости передачи инфекции и/или колонизации ЖК тракта одним или более из Klebsiella и Pseudomonas.

70. Способ иммунизации пациента против инфекции, вызываемой Klebsiella, включающий введение пациенту (i) эффективного количества иммуногенной композиции или вакцинной композиции по любому из пп. 1-62 или (ii) эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп. 63-69.

71. Способ иммунизации пациента против инфекции, вызываемой P. aeruginosa, включающий введение пациенту (i) эффективного количества иммуногенной композиции или вакцинной композиции по любому из пп. 1-62 или (ii) эффективного количества фармацевтической композиции по любому из пп. 63-69.

Настоящее изобретение относится к комплексному средству агониста толл-подобного рецептора 7 или 8 и холестерина, в котором холестерин связан с аминогруппой (NH2) активного центра агониста толл-подобного рецептора 7/8, где связь является расщепляемой, и к использованию комплексного средства. Агонист толл-подобного рецептора 7 или 8, содержащий холестерин, химически связанный с ним, не абсорбируется в кровеносных сосудах и, таким образом, позволяет уменьшить неблагоприятные побочные эффекты исходного толл-подобного рецептора 7 или 8.

Антибактериальная композиция на основе эндолизинов и лекарственные средства в форме геля или спрея с ее использованием // 2790481

Изобретение относится к медицине, а именно к фармацевтической промышленности, и касается лекарственных форм (ЛФ) в виде геля и спрея для лечения или профилактики раневых и госпитальных инфекций. Лекарственное средство для лечения или профилактики госпитальных и раневых инфекций содержит смесь рекомбинантных эндолизинов LysECD7, LysAm24 и LysAp22 в концентрации 0,03-0,15 мас.% и вспомогательные компоненты.

Оптимизация изготовления gl-2045 - мультимеризующегося страдомера // 2790232

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая композицию для применения в лечении или предотвращении воспалительного, аутоиммунного или инфекционного заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом (варианты), способ получения композиции (варианты) и способ очистки композиции (варианты).

Улучшенные пептидные лекарственные средства для лечения nash и других расстройств // 2790209

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новому конъюгату варианта внеклеточного домена рецептора GLP-1 с поверхностно-активным соединением, и может быть использовано в медицине. Изобретение раскрывает пептидный продукт, содержащий конъюгированный по остатку Lys17 с функционализированным сахаридом полипептид, в аминокислотной последовательности которого остатки Glu16* и Lys20* циклизованы через их боковые цепи с образованием лактама.

Способ таргетной доставки терапевтических препаратов к опухолевым клеткам // 2789807

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для лечения мягкотканных опухолей, клетки которых экспрессируют HER2, путем доставки терапевтических средств к клеткам опухолевого узла. Способ таргетной доставки терапевтических препаратов к опухолевым клеткам путем внутритуморального введения композиции из гидрогеля и рекомбинантных моноклональных антител к HER2, в котором указанную композицию вводят посредством внутритуморального введения имплантата в виде скаффолда, представляющего собой трубку, изготовленную из титанового сплава ВТ6, длиной 5-10 мм, с толщиной стенок 1±0,02 мм, с внутренним диаметром 2-4 мм, с шлифованной наружной поверхностью и краями, имеющую продольное отверстие на боковой стороне шириной 1±0,05 мм, внутренняя полость которого заполнена композицией из гидрогеля и рекомбинантных моноклональных антител к HER2 в соотношении 1:1.

Состав пневмококковой конъюгатной вакцины // 2789546

Изобретение относится к составу пневмококковой конъюгатной вакцины для индукции иммунного ответа против Streptococcus pneumoniae. Состав содержит 15-валентную пневмококковую конъюгатную композицию, состоящую по существу из полисахарида S.

Получение конъюгата антитело-лекарственное средство и его лиофилизация // 2789476

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к фармацевтической композиции, включающей (i) конъюгат антитело-лекарственное средство, (ii) гистидиновый буфер, (iii) сахарозу и (iv) полисорбат 80 или полисорбат 20, где конъюгат антитело-лекарственное средство представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство, в котором фрагмент лекарственное средство-линкер, представленный следующей формулой: ,где A представляет собой положение связывания с антителом, конъюгирован с антителом через тиоэфирную связь и где количество полисорбата 80 или полисорбата 20 составляет 0,2-0,4 мг на 20 мг конъюгата антитело-лекарственное средство, также относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему стадии: (1) получения водного раствора, включающего (i) конъюгат антитело-лекарственное средство, (ii) гистидиновый буфер, (iii) сахарозу и (iv) полисорбат 80 или полисорбат 20, и затем (2) лиофилизацию водного раствора, также относится к способу получения фармацевтической композиции, включающему стадии: (1) получение водного раствора, включающего (i) конъюгат антитело-лекарственное средство, (ii) гистидиновый буфер, (iii) сахарозу и (iv) полисорбат 80 или полисорбат 20, (2) корректировку pH водного раствора и затем (3) лиофилизацию водного раствора.

Способ получения гемостатического пористого композитного материала // 2789327

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к способу получения гемокоагулирующего аэрогеля из бактериальной целлюлозы и хитозана. Способ получения гемокоагулирующего аэрогеля из бактериальной целлюлозы и хитозана включает получение бактериальной целлюлозы культурой Medusomyces gisevii, очистку 1% раствором гидроксида натрия при 80°С в течение 2 часов с последующей многократной промывкой от реагента пятью объемами дистиллированной воды до достижения значения pH 5,5, гомогенизацию на гомогенизаторе ER-10 в течение 5 минут при 6000 об/мин до образования гелеобразной структуры и достижения динамической вязкости 10-15 Па*с, смешивание до получения однородной консистенции в соотношении 1:0,5 с гелем, полученным путем растворения хитозана со степенью деацетилирования 80% в 0,1 М уксусной кислоте до получения концентрации 1 моль/л в течение 12 часов, замораживание в алюминиевых лотках с последующим лиофильным высушиванием при определенных условиях.

Улучшенный белок слияния fviii и его применение // 2789085

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая конъюгат слитого белка фактора свертывания крови VIII с полиалкиленгликолем для предотвращения или лечения геморрагических заболеваний, фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения геморрагических заболеваний и способ предотвращения или лечения геморрагических заболеваний.

Пролекарство интерферона для лечения рака // 2788736

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. 1 объект представляет собой пролекарство интерферона для лечения рака, содержащее: (а) домен рецептора 2 интерферона альфа и бета (IFNAR2), который сохраняет IFN-связывающую активность; (b) домен интерферона 1 типа (IFN), который сохраняет активность интерферона 1 типа, когда он не связан указанным доменом IFNAR2; (c) Fc-домен иммуноглобулина (Ig), (d) первый линкер, слитый на одном конце с N-концом указанного IFN и слитый на другом конце с указанным IFNAR2, причем указанный первый линкер представляет собой G4S-PVGLIG-G4S; и (e) второй линкер, слитый на одном конце с C-концом указанного IFN и слитый на другом конце с N-концом указанного Fc-домена Ig.

Композиции escherichia coli и способы их применения // 2788526

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к новым сахаридам, и может быть применимо в медицинской практике. Изобретение раскрывает модифицированный О-полисахарид, способный стимулировать у млекопитающего иммунный ответ в отношении патогенных серотипов E.