Противоопухолевые средства на основе макро- и микроэлементсодержащих полигалактуронатов (варианты)
Владельцы патента RU 2792613:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Федеральный исследовательский центр "Казанский научный центр Российской академии наук" (RU)
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к водорастворимому средству на основе полигалактуроната, обладающему селективной цитотоксической активностью в отношении карциномы легкого А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и карциномы шейки матки M-HeLa, представляющему собой калий-кобальт-полигалактуронат (ПГКCo) или его композицию с натрий-кобальт-полигалактуронатом (ПГNaCo) в массовом соотношении 1-2:1-2, и также относится к водорастворимому средству на основе полигалактуроната, обладающему селективной цитотоксической активностью в отношении карциномы легкого А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и карциномы шейки матки M-HeLa, представляющему собой композицию, содержащую в массовом соотношении 3:1 натрий-кобальт-полигалактуронат (ПГNaCo) и металлокомплекс пектинового биополимера натрий-металл-полигалактуронат соответственно, где биогенный металл представляет собой цинк, марганец, хром или магний (ПГNaZn, ПГNaMn, ПГNaCr, ПГNaMg). 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл.
Заявляемая группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности, в частности, к металлокомплексам пектиновых биополимеров и композициям на их основе, которые обладают противоопухолевой активностью в отношении карциномы легкого A549, аденокарциномы молочной железы MCF-7, карциномы шейки матки М-HeLa и могут найти применение в медицине и фармакологии.
На сегодняшний день онкологические заболевания занимают второе место по смертности после сердечно-сосудистых заболеваний. Существует более 200 типов злокачественных опухолей человека и между опухолями даже одного органа имеются различия в гистологическом строении, в особенностях роста, во взаимодействии с организмом и т.д. Основной недостаток имеющихся в аптечной сети противоопухолевых лекарственных препаратов - это высокая токсичность, низкая биодоступность и отсутствие селективности к нормальным клеткам живых организмов.
Поэтому снижение токсичности известных противоопухолевых лекарственных средств при сохранении их эффективности остается актуальной задачей. Из литературы известно, что для повышения эффективности лечения опухолевых заболеваний необходимо создание новых, более избирательно действующих на опухолевые клетки препаратов, оптимизация методик применения противоопухолевых агентов, совершенствование химиотерапии как звена или этапа комплексного и комбинированного лечения больных со злокачественными опухолями, применение фармакологических средств с целью уменьшения побочного действия противоопухолевых препаратов и т.д. [Панкратов Андрей Александрович. Автореферат диссертации «Противоопухолевая эффективность и токсичность бинарных каталитических систем на основе металлокомплексов кобальта: Экспериментальное исследование» на соискание степени к.б.н. по специальности 14.00.14. - 31 с.].
Использование биополимеров, в том числе пектиновых полисахаридов - перспективный подход для решения поставленной задачи. Пектины привлекают все большее внимание исследователей в качестве потенциальных препаратов и биологически активных добавок в составе терапии злокачественных опухолей, особенно в торможении метастазирования и реабилитации после химиотерапии. Пектиновые полисахариды - растительные биополимеры полиуронидной природы, обладающие функциональными свойствами (комплексообразующей и гелеобразующей способностью), что обуславливает их перспективность в качестве радиопротекторов для выведения из организма радионуклидов, а также в пищевой промышленности (Е440). Пектины входят в состав клеточных стенок растений [Оводов Ю.С./ Современные представления о пектиновых веществах // Биоорганическая химия, 2009. Т. 35. №3. С.293-310 (обзор); Graham B. Seymour, J. Paul Knox / Pectins and their Manipulation // U.S.A. Canada CRC Press. 2002. 250 р.; Pectin: Chemical Properties, Uses and Health Benefits (Food Science and Technology) / Ed. Ph.L. Bush. New York: Nova science publishers, 2014. 268 р.], ими богаты употребляемые в пищу овощи и фрукты. Основными производимыми в мире промышленными видами коммерческого пектина являются яблочный и цитрусовый пектины.
Пектиновые полисахариды и продукты их модификации обладают широким спектром биологической активности: иммуномодулирующей, противовоспалительной, антибактериальной, антиоксидантной и противоопухолевой активностью [S.T. Minzanova, V.F. Mironov, D.M. Arkhipova, A.V. Khabibullina, L.G. Mironova, Y.M. Zakirova, V.A. Milyukov. Biological Activity and Pharmacological Application of Pectic Polysaccharides: A Review // Polymers. 2018, 10(12), 1407. DOI: 10.3390/polym10121407].
Известно, что извлеченные из растительного сырья нативные пектины, и в большей степени модифицированные различными способами пектины, уменьшают пролиферацию, миграцию и адгезию раковых клеток и индуцируют апоптоз на различных опухолевых линиях [Maxwell, E.G.; Colquhoun, I.J.; Chau, H.K.; Hotchkiss, A.T.; Waldron, K.W.; Morris, V.J.; Belshaw, N.J. Rhamnogalacturonan I containing homogalacturonan inhibits colon cancer cell proliferation by decreasing ICAM1 expression // Carbohydr. Polym. 2015. 132, 546-553]. Maxwell E.G. с соавторами оценивали эффективность пектинов из разных источников (картофель, сахарная свекла, лиственница и цитрусовые) для лечения рака толстой кишки. Рак ободочной и прямой кишки является третьим наиболее распространенным раком в мире, связанным с питанием. Исследования показали, что увеличение потребления фруктов и овощей способствует снижению риска развития данного заболевания. Авторами установлено, что варьированием дозы рамногалактуронана-I экстрактов картофельного пектина можно снизить пролиферацию раковых клеток толстой кишки.
В патентном документе [US5895784 (A), - 1999-04-20] раскрывается способ лечения рака у млекопитающих для ингибирования метастазирования первичных опухолей путем перорального введения терапевтического количества модифицированного пектина, а именно пектина с модифицированным рН, имеющего молекулярную массу ~ 1-15 кДа (преимущественно 10 кДа), или заявляемой композиции, которая содержит смесь сухого цитрусового пектина с модифицированным рН и фармацевтически приемлемый перевариваемый носитель. На модели Dunning (R3327) аденокарциномы предстательной железы, разработанной Dunning из спонтанно возникающей аденокарциномы, которая при инъекциях 1 × 106 клеток MLL в бедро крысы приводит к заболеванию. В течение примерно 25 дней распространения обширной инфекции, проиллюстрирована исследованная in vivo зависимость среднего количества метастаз (%) в легких от концентрации модифицированного цитрусового пектина (0.01%, 0.1%, 1.0%). Установлено, что концентрация модифицированного цитрусового пектина 1.0% обеспечивает максимальное снижение метастаз. Технический результат - снижение метастаз - обеспечивается пектином с модифицированным рН, который связывается с белками, связывающими углеводы на поверхности опухолевых клеток, например, деметоксилированной полигалактуроновой кислотой.
В [WO2009096789 (A1), 2009-08-06] предложена композиция, включающая галактоолигосахарид, фруктоолигосахарид и гидролизат пектина в соотношении (5-9):1:(2-10) соответственно, предназначенная для стимулирования активности естественных клеток-киллеров (NK-клеток, крупных гранулярных лимфоцитов) людей, у которых активность этих клеток снижена на 10-40% по сравнению со здоровыми людьми, в том числе у онкологических больных, для предотвращения прогрессирования заболевания. Авторами показано, что применение указанной композиции повышает активность NK-клеток, определяемой с помощью коммерчески доступного набора тестов NKTEST®, выпускаемого ORPEGEN Pharma, на 30-50%, по сравнению с активностью NK-клеток до поступления в организм заявляемой композиции. Преимущественно кислотные олигосахариды (получаемые из высокометоксилированного пектина) имеют степень метилирования 70%, меньше 50%, и еще меньше - 20%. Гидролизат пектина вводили в количестве от 10 мг до 100 г в день, либо от 100 мг до 50 г в день, либо от 500 мг до 20 г в день. Кроме того, предлагается применение композиции с дополнительным включением N-ацетилцистеина, также дополнительно композиция может включать белки, жиры, легко усвояемые углеводы, витамины и минералы - как минимум, 10% молочного белка и 10-50% жира от общей калорийности композиции.
Изобретение [CN113025674 (A), 2021-06-25] раскрывает способ получения продукта энзимолиза лимонного пектина (modified citrus pectin, МCP) с противоопухолевой активностью. Способ включает следующие стадии: трехкратный гидролиз пектиназой МСР в буфере (при pH буфера NaAc/HAc 4.2) при температуре 50°С, проведение энзимолиза МСР пектиназой при комнатной температуре в течение ночи, нагревание на кипящей водяной бане в течение 10 мин, центрифугирование при 4000 об/мин в течение 15 мин после охлаждения для удаления инактивированной пектиназы, диализ в диализном мешке с отделением фракции с молекулярной массой 1000 Да с получением смешанного продукта после энзимолиза МСР, а затем последовательное проведение разделения колоночной хроматографией и очистки продукта энзимолиза с использованием ДЭАЭ-целлюлозы и сефадекса для получения пяти очищенных продуктов ферментативного гидролиза пектина, имеющих различный моносахаридный состав. Изобретение раскрывает возможность применения продукта энзимолиза лимонного пектина против клеток рака молочной железы человека MCF-7 и против клеток немелкоклеточного рака легкого А549. Противоопухолевую активность каждого компонента ферментативного гидролиза МСР, оценивают по ингибированию пролиферации клеток рака молочной железы человека MCF-7 с высокой экспрессией галектина-3 и немелкоклеточного рака легкого А549. При условии введения дозы 63-2000 мкг/мл, после обработки клеток MCF-7 пятью компонентами пролиферативная активность клеток MCF-7 снижается соответственно до 53.4%, 55.4%, 61.0%, 36.7% и 45.9%; пролиферативная активность клеток А549 снижается соответственно до 89.3%, 64.8%, 53.4%, 57.4% и 82.8%.
Известен обзор авторов [Zhang, W., Xu, P., & Zhang, H. Pectin in cancer therapy: A review // Trends in Food Science & Technology, 2015. 44. 258-271. DOI: 10.1016/j.tifs.2015.04.001], в котором обобщены данные о потенциале коммерческих пектинов и пектинов из нетрадиционных растительных источников при терапии рака. Обоснована необходимость дополнительной проработки фундаментальных вопросов для продвижения пектина в терапии рака: подробное описание роли галектина-3 (Gal-3), модификация пектина как таковая, а также их фармакокинетика и фармакодинамика.
Известна работа [Lionel Leclere, Maude Fransolet, Francois Cote, Pierre Cambier, Thierry Arnould, Pierre Van Cutsem, Carine Michiels. Heat-Modified Citrus Pectin Induces Apoptosis-Like Cell Death and Autophagy in HepG2 and A549 Cancer Cells // PLOS ONE. 2015, 1-24 DOI: 10.1371/journal.pone.0115831], в которой авторы оценивали цитотоксичность термически фрагментированного цитрусового пектина и нативного цитрусового пектина по отношению к клеточным линиям гепатоцеллюларной карциномы (HepG2) и карциномы легкого (A549) через 24 часа и 48 часов инкубации. Клетки HepG2 и клетки A549 инкубировали в сравнении с контрольной средой, 50 мкМ этопозидом, 3 мг/мл термически фрагментированного цитрусового пектина или 3 мг/мл нативного цитрусового пектина. Фракция термически фрагментированного цитрусового пектина проявила противоопухолевую активность в отношении раковых клеток HepG2: она дает коэффициент клеточной смертности 95% при концентрации 5 мг/мл и имеет IC50 3 мг/мл. Противоопухолевая активность нативного цитрусового пектина очень незначительна.
Известна работа авторов [Delphi L., Sepehri H. Apple pectin: A natural source for cancer suppression in 4T1 breast cancer cells in vitro and express p53 in mouse bearing 4T1 cancer tumors, in vivo. Biomed. Pharmacother. 2016. 84. 637-644. DOI: 10.1016/j.biopha.2016.09.080], в которой описана способность яблочного пектина вызывать гибель раковых клеток и подавлять рост опухолей in vivo на модели рака груди мышей. Результаты исследований in vitro показали, что 0.1%-ная концентрация пектиновой кислоты может вызывать апоптоз, ингибировать рост опухолевых клеток (p<0,001) и уменьшать адгезию клеток. Кроме того, исследования in vivo на животной модели рака груди 4T1 показали, что пектиновая кислота может ингибировать рост опухолей за счет сверхэкспрессии p53 и увеличения количества апоптотических клеток.
Известна работа [Lin, L.; Wang, P.; Du, Z.; Wang, W.; Cong, Q.; Zheng, C.; Jin, C.; Ding, K.; Shao, C. Structural elucidation of a pectin from flowers of Lonicera japonica and its antipancreatic cancer activity // Int. J. Biol. Macromol. 2016. 88. 130-137. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2016.03.025], авторы которой показали, что пектиновый полисахарид из цветов Lonicera japonica перспективен для создания на его основе мощного лекарственного средства для лечения рака поджелудочной железы. Пектиновый полисахарид может ингибировать рост клеток рака поджелудочной железы PANC-1 в концентрации 1 мг/мл с коэффициентом ингибирования 52.1%.
Результаты авторов [Hadjira Hamai-Amara, Khalida Abdoun-Ouallouche, Assia Nacer-Khodja, Karima Abdelhafid, Abdelouafi Benmouloud & Assia Djefal-Kerrar. Optimization of the extraction of orange peel pectin and evaluation of its antiproliferative activity towards HEp2 cancer cells // Euro-Mediterranean Journal for Environmental Integration. 2020. 5, article number: 43] демонстрируют проапоптотический эффект химически модифицированного и облученного пектина, выделенного из апельсиновых корок на линию клеток рака гортани (HEp2). Самая сильная проапоптотическая активность по отношению к клеткам HEp2 наблюдалась через 72 часа контакта с химически модифицированным и облученным пектином из апельсиновых корок. С использованием этого модифицированного пектина была достигнута смертность раковых клеток 95% (IC95 5 мг /мл), при этом IC50 3.18 мг/мл.
Известен обзор M. Khotimchenko, в котором обсуждаются различные формы системы доставки лекарственных средств на основе пектина (гидрогели, таблетки, пленки, микросферы, наночастицы и т.д.) и представлена обширная литература по пектиновым биополимерам как средствам доставки лекарств в толстую кишку. Показано, что пектины могут подавлять рост опухоли за счет ингибирования роста клеток, уменьшения адгезии клеток [M. Khotimchenko. Pectin polymers for colon-targeted antitumor drug delivery // International Journal of Biological Macromolecules. 2020. 158. 1110-1124. DOI: 10.1016/j.ijbiomac.2020.05.002].
Авторами [Kamonrak Cheewatanakornkool, Sathit Niratisai, Somkamol Manchun, Crispin R. Dass, Pornsak Sriamornsak. Characterization and in vitro release studies of oral microbeads containing thiolated pectin - doxorubicin conjugates for colorectal cancer treatment // Asian journal of pharmaceutical sciences. 2017. 12 509-520; Cheewatanakornkool K, Niratisai S, Manchun S, Dass CR, Sriamornsak P. Thiolated pectin-doxorubicin conjugates: Synthesis, characterization and anticancer activity studies // Carbohydr. Polym. 2017. V. 174. P. 493-506. DOI: 10.1016/j.carbpol.2017.06.115] получены конъюгаты тиолированный пектин-доксорубицин (DOX), определены характеристики, физико-химические свойства и морфология тиолированных пектинов и конъюгатов тиолированный пектин - DOX. Противораковая активность in vitro конъюгатов тиолированного пектина и DOX была значительно выше, чем у свободного DOX, в клетках карциномы толстой кишки и остеосаркомы костей человека, но незначительно отличалась от активности нативного DOX в клетках рака простаты человека. Это обуславливает перспективность конъюгатов тиолированный пектин-DOX для доставки DOX, направленного на лечение колоректального рака.
Авторами [Indu Hira, Reena Kumari, Adesh Kumar Saini, Henok Gullilat, Vipin Saini, Anil Kumar Sharma, Reena V. Saini. Apoptotic Cell Death Induction Through Pectin, Guar Gum and Zinc Oxide Nanocomposite in A549 Lung Adenocarcinomas // Biointerface Research in Applied Chemistry. 2022. 12. 2. 1856-1869. DOI: 10.33263/BRIAC122.18561869] выявлен in vivo противораковый потенциал нанокомпозита Pec-gg-ZnO в отношении клеток карциномы легкого A549, карциномы шейки матки (HeLa) и аденокарциномы предстательной железы (PC-3). Значения IC50 составляли 83.67 (0.10 мкг/мл, 87.25 (0.03 мкг/мл и 85.95 (0.03 мкг/мл для клеток A549, HeLa и PC-3 соответственно. Способность убивать раковые клетки шейки матки (HeLa) у нанокомпозита была значительно выше, чем у пектина (IC50 781.70 (0.09 мкг/мл) и гуаровой камеди (IC50 374.20 (0.08 мкг/мл).
В работе [Противоопухолевая активность пектинов различной молекулярной массы / Е.А. Леонтьева, В.В. Вихарева, А.А. Калитник, М.Ю. Хотимченко // Тихоокеанский медицинский журнал, 2020. №4 (82). 68-72. DOI: 10.34215/1609-1175-2020-4-68-72] приведен анализ зависимости противоопухолевых свойств различных пектинов от структурных особенностей и молекулярной массы. Для исследования противоопухолевого действия полисахаридов были использованы клеточные линии мышиной аденокарциномы молочной железы C127, карциномы шейки матки HeLa, карциномы толстой кишки человека SW620, аденокарциномы молочной железы человека HTB-30 и нормальные клетки сетчатки глаза RPE. Оценку противоопухолевого и цитотоксического действия пектинов проводили с помощью теста на метаболическую активность методом МТТ-анализа и с помощью прижизненной окраски флуоресцентными ДНК-связывающими красителями Hoechst и пропидия йодидом живых и мертвых клеток. Показано, что образцы цитрусовых пектинов во всем выбранном диапазоне концентраций обладали значительным противоопухолевым эффектом по отношению к клеточной линии аденокарциномы C127, снижая метаболическую активность и пролиферацию клеток, а также проявляя выраженный цитотоксический эффект.
Противоопухолевые препараты, содержащие в своем составе ионы металлов, играют важную роль в химиотерапии опухолей.
В литературе известна высокая цитотоксическая активность координационных соединений биогенных металлов [D.A. Guk, O.O. Krasnovskaya, E.K. Beloglazkina. Russ. Chem. Rev., 2021. 90 (12). 1566 - 1623 (обзор). https://doi.org/10.1070/RCR5016?locatt=label:RUSSIAN] и каталитических систем (комплексы переходных металлов (Со, Fe, Мn и др.), а также их перспективность в качестве потенциальных противоопухолевых агентов. В приведенном обзоре показано, как варьирование структуры лиганда может заметно изменить не только цитотоксичность координационного соединения, но и механизм связывания с ДНК, а в некоторых случаях сделать основным другой механизм цитотоксического действия.
В работе [Панкратов Андрей Александрович. Автореферат диссертации «Противоопухолевая эффективность и токсичность бинарных каталитических систем на основе металлокомплексов кобальта: Экспериментальное исследование» на соискание степени к.б.н. по специальности 14.00.14. - 31 с.] автором изучены противоопухолевые и токсические свойства бинарных каталитических систем на основе комплексов кобальта и аскорбиновой кислоты на экспериментальных животных in vivo.
Заявителем в предшествующем уровне техники не выявлены пектиновые металлокомплексы, проявляющие цитотоксическую активность в отношении опухолевой клеточной линии А549 (карцинома легкого человека), MCF-7 (аденокарциномы молочной железы). Известны первичные данные по угнетению жизнеспособности клеток карциномы шейки матки М-HeLa при воздействии натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo), величина IC50 составила 2.00%±0.20, полученные авторским коллективом заявителя [Минзанова С.Т., Волошина А.Д., Архипова Д.М., Краюшкина А.В., Миронова Л.Г., Сапунова А.С., Куфелкина А.А., Кулик Н.В., Миронов В.Ф., Милюков В.А. Синтез и противоопухолевая активность комплексов кобальта с полигалактуронатом натрия // Материалы ХШ Международной конференции «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Сочи, 4-8 июня 2018 г. - Москва: РУДН, 2018. - С.634-637].
Проведенный анализ литературных данных демонстрирует, что реакция опухолевых клеток на действие пектинов зависит как от типа используемого соединения (пектины из различных растительных источников, пектины с различными свойствами, такими, как молекулярная масса, вязкость, степень этерификации), так и от чувствительности самих клеток к пектинам. Кроме того, некоторые пектиновые препараты плохо растворимы в воде, из-за чего для достижения терапевтического эффекта возникает необходимость увеличения дозы препарата, что в свою очередь вызывает сильные побочные эффекты. Известно, что с увеличением растворимости лекарственных препаратов для перорального приема повышается их эффективность, поэтому создание биодоступных (водорастворимых или жирорастворимых) лекарственных средств на основе пектиновых биополимеров остается актуальной задачей.
Серьезной медицинской и социальной проблемой являются рак легкого и рак молочной железы. В развитых странах рак легкого является наиболее часто встречающейся злокачественной опухолью и наиболее распространенной причиной смерти от онкологической патологии. Согласно данным международного агентства по изучению рака, ежегодно в мире регистрируется около одного миллиона новых случаев рака легкого, и 60% онкологических больных погибает в результате данного заболевания. В России рак легкого занимает первое место среди онкологических заболеваний, его доля в данной патологии составляет двенадцать процентов, а в пятнадцати процентов случаев у умерших онкобольных был выставлен диагноз рак легкого. По данным ВОЗ 2000 года мужчины болеют раком легкого значительно чаще: рак легкого стал причиной смерти 32.0% мужчин, и 7.2% женщин, у которых были обнаружены какие-либо злокачественные новообразования [В.А. Нидюлин Б.В. Эрдниева. Об эпидемиологии рака легких // Медицинский вестник Башкортостана: обзорная статья // Башкирский государственный медицинский университет, 2009. 4 (1). 66-71. ISSN 1999-6209].
C раком молочной железы в России сталкивается каждая десятая женщина. Самым распространенным типом онкологической патологии грудных желез является аденокарцинома, она бывает двух видов: как новообразование, развивающееся в дольках молочной железы (10%); или как опухоль, которая возникает в грудных протоках (90%). Диагностика аденокарциномы молочной железы обязательно включает в себя стандартные клинические анализы крови и мочи, также оценивается гормональный фон. Кроме того, сдается кровь на онкологические маркеры (наибольшее значение имеет показатель специфического антигена СА15-3). По показаниям проводится генетическое тестирование для определенных генов [Хирургические болезни: учебник / под редакцией А.Ф. Черноусова. М.: ГЭОТАР-МЕДИА, 2010. 664 с. - ISBN 978-5-9704-1278-7].
Рак шейки матки - злокачественное новообразование, возникающее в области шейки матки. Гистологически различают две его основные разновидности: карцинома и плоскоклеточный рак. Заболеваемость раком шейки матки значительно превышает заболеваемость другими опухолями женской половой системы. В начале XXI века отмечается увеличение больных раком шейки матки на поздних стадиях: доля рака IV стадии, по разным данным, составляет 37,1% - 47,3% [Палийчук О.В., Полищук Л.З. Роль инфекционных факторов в этиологии и патогенезе интраэпителиальной неоплазии и рака шейки матки // Репродуктивное здоровье женщины. 2007. 32 (3). 10-16; Современные подходы к хирургическому лечению шейки матки. Доклад Морхова К.Ю. на онкологическом съезде «Белые ночи». 2015; https://www.youtube.com/watch?v=sX0Jkgu2-o0].
Техническая проблема, на решение которой направлено изобретение, состоит в расширении арсенала водорастворимых средств на основе пектинового биополимера, обладающих при этом селективной цитотоксической активностью в отношении опухолевой клеточной линии карциномы легкого человека А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и карциномы шейки матки М-HeLa, практически не оказывающих токсического влияния на нормальные клетки человека.
Техническим результатом, обеспечиваемым изобретением, является реализация изобретением указанного назначения.
Техническая проблема решается, и технический результат достигается предложенной группой изобретений, относящихся к объектам одного вида одинакового назначения и обеспечивающих получение одного и того же технического результата (варианты) - средствами, обладающими селективным противоопухолевым действием при карциноме легкого А549, аденокарциноме молочной железы MCF-7 и карциноме шейки матки М-HeLa, при этом не оказывающих влияния на нормальные клетки человека средствами - водорастворимыми металлокомплексами пектиновых полисахаридов с биогенными макро- и микроэлементами и фармакологическими композициями на их основе.
В одном варианте осуществления изобретения заявляемыми средствами являются водорастворимые натрий-кобальт-полигалактуронат (ПГNaCo), или калий-кобальт-полигалактуронат (ПГКCo), или их смеси в массовом соотношении 1-2:1-2.
В другом варианте осуществления изобретения заявляемыми средствами являются новые, ранее не описанные водорастворимые фармакологические композиции, содержащие натрий-кобальт-полигалактуронат (ПГNaCo) и металлокомплекс пектинового биополимера, выбранного из группы натрий-цинк-полигалактуронат, или натрий-марганец-полигалактуронат, или натрий-хром-полигалактуронат, или натрий-магний-полигалактуронат (ПГNaZn, ПГNaMn, ПГNaCr, ПГNaMg), в массовом соотношении 3:1 соответственно.
При этом заявляется селективная цитотоксическая активность:
водорастворимого натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) - в отношении карциномы легкого А549 и аденокарциномы молочной железы MCF-7 (активность ПГNaCo в отношении карциномы шейки матки М-HeLa известна из уровня техники);
водорастворимого калий-кобальт-полигалактуроната (ПГКCo), водорастворимых фармакологических композиций, представляющих собой смесь калий-кобальт-полигалактуроната (ПГКCo) и натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) в массовом соотношении 1-2:1-2, и
водорастворимых фармакологических композиций, содержащих натрий-кобальт-полигалактуронат (ПГNaCo) и металлокомплекс пектинового биополимера, выбранный из группы натрий-цинк-полигалактуронат, или натрий-марганец-полигалактуронат, или натрий-хром-полигалактуронат, или натрий-магний-полигалактуронат (ПГNaZn, ПГNaMn, ПГNaCr, ПГNaMg), в массовом соотношении 3:1 соответственно, -
в отношении карциномы легкого А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7, и карциномы шейки матки М-HeLa.
Согласно классификации опасности веществ по степени воздействия на организм [ГОСТ 12.1.007.76 и Измеров Н.Ф., Саноцкий И.В., Сидоров К.К., Параметры токсикометрии промышленных ядов при однократном введении (справочник), М.: Медицина, 1977. С.196-197] заявленные противоопухолевые средства не проявляют токсических эффектов на экспериментальных животных. При пероральном введении мышам в дозах 5000-15000 мг/кг не вызывают гибели животных. Это позволяет отнести заявляемые средства к классу малотоксичных (малоопасных) соединений.
Металлокомплексы на основе полигалактуроната натрия со степенью солеобразования 100% - ПГNaCo, ПГNaZn, ПГNaMn, ПГNaCr и ПГNaMg - известны из уровня техники, а именно сведения о структуре, характеристиках и способе получения [RU2219187 C1, 20.12.2003; S.T. Minzanova, V.F. Mironov, A.B. Vyshtakalyuk, O.V. Tsepaeva, L.G. Mironova, A.Z. Mindubaev, I.R. Nizameev, K.V. Kholin, V.A. Milyukov. Complexation of pectin with macro- and microelements. Antianemic activity of Na, Fe and Na, Ca, Fe complexes // Carbohydrate Polymers, 2015. 134. 524-533 (DOI: 10.1016/j.carbpol.2015.07.034); В.Ф. Миронов, А.Н. Карасева, О.В. Цепаева, А.Б. Выштакалюк, С.Т. Минзанова, В.И. Морозов, В.В. Карлин, Э.Р. Юнусов, А.З. Миндубаев. Некоторые новые аспекты комплексообразования пектиновых полисахаридов с катионами d-металлов. // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2003. 4 (1-3). С.45-50; Vasilii A. Milyukov, Anna V. Khabibullina, Daria M. Arkhipova, Vladimir F. Mironov, Ayrat R. Khamatgalimov, Irina S. Ryzhkina, Leysan I. Murtazina, Lubov G. Mironova, Alexandra B. Vyshtakalyuk, Andrey V. Nemtarev, Nail G. Nazarov, Kirill V. Kholin, Irek R. Nizameev, and Salima T. Minzanova. Synthesis, Physicochemical Properties and Anti-Fatigue Effect of Magnesium, Zinc and Chromium Polygalacturonate Based Composition // ChemistrySelect. 2019. 4 (14). 4331-4338. DOI:10.1002/slct.201803812; RU2564949 C1, 10.10.2015].
Характеристики металлокомплексов на основе полигалактуронатов натрия и калия, в том числе ранее не известного из уровня техники калий-кобальт-полигалактуроната (ПГКCo), представлены в таблице 1. Содержание металлов в заявляемых средствах определено методом атомно-эмиссионной спектроскопии на АЭС ИСП iCAP 6300 DUO. Удельное оптическое вращение металлокомплексов пектина измерялось на поляриметре Perkin-Elmer 341 (концентрация c дана в г/100 мл, длина волны 589 нм, температура 20°С). Элементный состав образцов определен на приборе Euro EA - CHNSO Elemental Analyser с использованием стандарта стрептоцид (C6H8O2N2S).
Способ получения полигалактуроната калия (ПГK) со 100%-ой степенью солеобразования аналогичен описанному в [RU2281957 C1, 20.08.2006] способу получения полигалактуроната натрия (ПГNa) обработкой пектина щелочью при 50-60°С, но отличается тем, что доведение раствора пектина до рН 9 проводится добавлением 0.1 н. раствора KOH вместо NaOH. Полигалактуронат калия (ПГK) - порошок бежевого цвета, ИК спектр (KBr, v, см-1): 1610 (C=O).
Способ получения калий-кобальт-полигалактуроната (ПГКCo) аналогичен способу получения натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) [RU 2281957 C1, 20.08.2006], но отличается тем, что в качестве исходного соединения используется полигалактуронат калия вместо полигалактуроната натрия. Калий-кобальт-полигалактуронат (ПГKCo) - аморфный порошок сиреневого цвета, ИК спектр (KBr, v, см-1): 1609 (C=O).
Натрий и калий - это щелочные металлы первой группы главной подгруппы, встречаются во всех известных биологических системах. Получают водорастворимые фармакологические композиции, представляющие собой смесь калий-кобальт-полигалактуроната (ПГКCo) и натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) простым смешением в массовом соотношении 1-2:1-2 водорастворимых ПГNaCo и ПГКCo при тщательном перемешивании, например, на шаровой мельнице в течение 3-5 минут.
Как уже упоминалось, противоопухолевые свойства в отношении карциномы шейки матки М-HeLa натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) ранее нами описаны [Минзанова С.Т., Волошина А.Д., Архипова Д.М., Краюшкина А.В., Миронова Л.Г., Сапунова А.С., Куфелкина А.А., Кулик Н.В., Миронов В.Ф., Милюков В.А. Синтез и противоопухолевая активность комплексов кобальта с полигалактуронатом натрия // Материалы ХШ Международной конференции «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», Сочи, 4-8 июня 2018 г. - Москва: РУДН, 2018. С.634-637], однако способность ПГNaCo ингибировать рост онкоклеток карциномы легкого А549 и аденокарциномы молочной железы MCF-7, равно как и цитотоксическая активность в отношении карциномы легкого А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и карциномы шейки матки М-HeLa калий-кобальт-полигалактуроната (ПГКCo) и смесей калий-кобальт-полигалактуроната (ПГКCo) и натрий-кобальт-полигалактуроната (ПГNaCo) в массовом соотношении 1-2:1-2, не известны заявителю из уровня техники.
Предложенные фармакологические композиции по второму варианту изобретения, содержащие натрий-кобальт-полигалактуронат (ПГNaCo) с одним из металлокомплексов пектинового биополимера (ПГNaZn, ПГNaMn, ПГNaCr, ПГNaMg) также являются новыми, не описанными ранее. Получают указанные фармакологические композиции простым смешением в массовом соотношении 3:1 ПГNaCo с металлокомплексом пектинового биополимера с макро- и микроэлементами при тщательном перемешивании, например, на шаровой мельнице в течение 3-5 минут.
Способность ингибировать рост онкоклеток карциномы легкого А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и карциномы шейки матки М-HeLa фармакологических композиций на основе ПГNaCo с одним из ПГNaZn, ПГNaMn, ПГNaCr, ПГNaMg при массовом соотношении 3:1 также не известны заявителю из уровня техники.
В таблице 2 представлено содержание металлов в заявляемых композициях.
Поддержание нормального гомеостаза связано с разложением и синтезом белков, углеводов и жиров в организме, возможность прохождения которых и регулирование определяют ионы металлов. В случае двух- и многокомпонентных композиций особое значение приобретают типы взаимодействия между ионами металлов. Конечный результат физиологического эффекта может быть обусловлен синергизмом или антагонизмом. Массовое соотношение ПГNaCo с металлокомплексом пектинового биополимера (ПГNaZn, ПГNaMn, ПГNaCr, ПГNaMg) в заявляемых фармакологических композициях обусловлено снижением цитотоксической активности при уменьшении доли в композиции ПГNaCo.
Ниже приведена краткая характеристика и биологическая роль биогенных металлов в заявляемых средствах (фармакологических композициях): микроэлементы (кобальт, цинк, хром и марганец), а также макроэлемент - магний.
Кобальт (Co) представляет собой важный редокс-микроэлемент, широко распространенный в клетках млекопитающих. Этот металл участвует в ряде окислительно-восстановительных процессов, алкилировании и генерировании (разрушении) свободных радикалов, проходящих в живой клетке. Наиболее часто встречающимся механизмом цитотоксичности, обнаруженном для координационных соединений кобальта (II), является связывание с ДНК и последующий запуск апоптоза [D.A. Guk, O.O. Krasnovskaya, E.K. Beloglazkina // Russ. Chem. Rev., 2021, 90 (12) 1566 - 1623. DOI: 10.1070/RCR5016?locatt=label:RUSSIAN].
Злокачественные опухоли легче развиваются на фоне пониженного уровня цинка (Zn). Цинк участвует в метаболизме клеток и содержится в активном центре более 200 металлоферментов. Добавки цинка стимулируют выработку белых кровяных клеток - одного из противоопухолевых компонентов иммунной системы, и поддерживают общую активность нейтрофилов и Т-лимфоцитов. С учетом физиологической потребности целях рекомендуется ежедневная профилактическая доза 15 - 25 мг цинка [D.A. Guk, O.O. Krasnovskaya, E.K. Beloglazkina. Russ. Chem. Rev., 2021, 90 (12). 1566-1623, DOI: 10.1070/RCR5016?locatt=label:RUSSIAN; Gray, L. Zinc. Marshall Cavendish / L. Gray. 2006. - Р. 9].
Магний (Mg), как и цинк, обладает иммуномодулирующим действием. Магний находится во всех тканях организма и необходим для нормального функционирования клеток. Участвует в большинстве реакций обмена веществ, в регуляции передачи нервных импульсов и в сокращении мышц, оказывает спазмолитическое и антиагрегантное действие. Наиболее общий эффект воздействия Mg2+на любую ткань заключается в том, что ионы Mg2+стабилизируют структуру транспортной РНК, контролирующей общую скорость ресинтеза белков. При дефиците магния происходит дестабилизация транспортных - некодирующих РНК (увеличивается число дисфункциональных молекул РНК), что сопровождается снижением и замедлением скорости синтеза белковых структур клеток с относительным преобладанием процессов апоптоза (один из механизмов старения). Суточная потребность в магнии составляет 350 - 500 мг [Русский медицинский журнал: https://www.rmj.ru/articles/kardiologiya/Roly_deficita_magniya_v_ patogeneze_metabolicheskogo_sindroma/#ixzz7EwdOkfBz].
Хром (Cr) - один из биогенных элементов, входящий в состав тканей растений и животных. У животных хром участвует в обмене липидов, белков (входит в состав фермента трипсина), углеводов. Снижение содержания хрома в пище и крови приводит к уменьшению скорости роста, увеличению холестерина в крови. Биологическая активность хрома объясняется способностью ионов Сг3+образовывать комплексные соединения. Например, ионы Cr3+участвуют в стабилизации структуры нуклеиновых кислот.Хром оказывает действие на процессы кроветворения, обладает способностью активировать трипсин, так как входит в состав кристаллического трипсина в виде лабильного соединения, способного отщеплять ионы хрома. Соли хрома подавляют спиртовое брожение, ускоряют работу инсулина; влияют на углеводный обмен и энергетические процессы. В организме взрослого человека содержится 6 мг хрома [A.P. Avtsyn, A.A. Zhavoronkov, M.A. Rish. Mikroelementozy cheloveka // Human Micronutrient Balance Disorders. Moscow. 1991. 496 p.].
Важным микроэлементом является марганец, биогенная функция ионов Mn2+состоит в регуляции активности ферментов. Поэтому ионы Mn2+обладают широким спектром биологических эффектов: оказывают влияние на кроветворение, минеральный обмен, рост, размножение и т.д. Кроме того, ионы Mn2+стабилизируют структуру нуклеиновых кислот.Марганец защищает стенки артерий, делая их устойчивыми к образованию атеросклеротических бляшек. Марганец жизненно важен для функции мозга, для образования кожного пигмента, входит в состав белков и ферментов и обладает выраженной антиоксидантной активностью. Суточная потребность в марганце составляет 2.5 - 5.0 мг [A.P. Avtsyn, A.A. Zhavoronkov, M.A. Rish. Mikroelementozy cheloveka // Human Micronutrient Balance Disorders. Moscow. 1991. 496 p.].
Исследование противоопухолевой активности заявляемых средств
Оценка цитотоксического действия заявляемых средств на клетки опухолевых линий осуществлялась in vitro на культурах клеток карциномы легкого человека А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7 (плевральная жидкость) и карциномы шейки матки М-HeLa из коллекций Института цитологии РАН (Санкт-Петербург); в качестве нормальных клеточных линий были использованы клетки печени (Chang liver из коллекции НИИ вирусологии РАМН (Москва).
Цитотоксическое действие заявляемых средств определяют путем подсчета жизнеспособных клеток опухолевых культур А549, MCF-7 и М-HeLa, а также культуры нормальных клеток печени (Chang liver) с помощью многофункциональной системы Cytell Cell Imaging (GE Helthcare Life Science, Швеция), используя приложение Cell Viability BioApp, которое позволяет точно подсчитать количество клеток, оценить их жизнеспособность на основании интенсивности флуоресценции [A.D. Voloshina, A.S. Sapunova, N.V. Kulik, M.G. Belenok, I.Yu. Strobykina, A.P. Lyubina, S.K. Gumerova, V.E. Kataev, Antimicrobial and cytotoxic effects of ammonium derivatives of diterpenoids steviol and isosteviol, Bioorg. Med. Chem. 32 (2021) 115974. https://doi.org/10.1016/j.bmc.2020.115974].
Для культивирования клеток используют стандартную питательную среду «Игла» производства Московского института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова фирмы «ПанЭко» с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% заменимых аминокислот.
Рассев клеток проводят на 96-луночную панель фирмы «Eppendorf» в концентрации 100 тыс.кл/мл в каждую лунку в объеме 150 мкл среды и культивируют в СО2-инкубаторе при 37°С.Через 24 ч после посадки клеток в лунки отбирают культуральную среду, а в лунки вносят по 150 мкл растворов изучаемого препарата в заданных разведениях. Разведения соединений готовят непосредственно в ростовой питательной среде.
Цитотоксическое действие заявляемых средств определяют в следующих концентрациях, масс. %: 0.047%, 0.093%, 0.1875%, 0.375%, 0.75%.
Расчет ингибирующей концентрации, при которой погибает 50% клеток, - IC50 - производят с помощью онлайн-калькулятора: MLA - «Калькулятор Quest Graph (IC50». AAT Bioquest, Inc, 4 июня 2021 г., https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator [V. Kaur, M. Kumar, A. Kumar, K. Kaur, V. Singh Dhillon, S. Kaur, Pharmacotherapeutic potential of phytochemicals: Implications in cancer chemoprevention and future perspectives // Biomed. Pharmacother. 2018. 97. 564-586. DOI: 10.1016/j.biopha.2017.10.124].
Индекс селективности (SI) рассчитывают, как отношение значения IC50 для нормальных клеток к значению IC50 для раковых клеток; высокоселективными считаются соединения с SI≥10 [
O, Villarreal M, 
L, Meneses-Acosta A, 
V. Cytotoxicity, post-treatment recovery, and selectivity analysis of naturally occurring podophyllotoxins from bursera fagaroides var. fagaroides on breast cancer cell lines // Molecules. 2016; 21 (8). 1013. DOI: 10.3390/molecules21081013].
Результаты заявляемых противоопухолевых средств в сравнении с противоопухолевыми препаратами растительного происхождения представлены в таблице 3. В качестве препаратов сравнения используют исходный цитрусовый пектин, метанольный экстракт Thymus vulgaris L. (тимьян обыкновенный) [Балакина А.А., Кузьмина Е.А., Древова А.Н., Мубарак М.М., Карсункина Н.П., Калашникова Е.А., Чередниченко М.Ю. Оценка цитотоксического действия экстрактов из лекарственных растений на клеточную линию М-HeLa. Электронный научно-производственный журнал «АгроЭкоИнфо»] и лекарственный препарат Арглабин, представляющий собой лиофилизат биологически активного сесквитерпенового лактона, выделенного из полыни гладкой Artemisia glabella (Карагандинский фармацевтический комплекс, ТОО) [Н.А. Неверова, А.Н. Жабаева, А.А. Левчук, В.А. Бабкин, А.Р. Бейсенбаев, Л.И. Ларина, А.Н. Сапожников, С.М. Адекенов. Исследование физико-химических свойств механообработанного арглабина и его механокомпозитов на основе арабиногалактана. Химия растительного сырья. 2019. 4. 105-112. DOI: 10.14258/jcprm.2019046259].
Данные таблицы 3 показывают, что практически все заявляемые средства превосходят выбранные препараты сравнения - метанольный экстракт Thymus vulgaris L. (тимьян обыкновенный) и пектин цитрусовый по цитотоксичности в отношении онкоклеток. При этом все они имеют большую селективность по сравнению с указанными сравниваемыми средствами: индекс селективности (SI) метанольного экстракта Thymus vulgaris L. (тимьян обыкновенный) в отношении MCF-7 составляет 2.6, А-549 - 1.1, в отношении M-HeLa - 1.4; пектин цитрусовый не обладает селективностью, показатели его цитотоксичности (IC50) в отношении всех видов раковых клеток и нормальных клеток печени (Chang liver) превышают 1.5%. Лекарственный препарат Арглабин является эффективным противоопухолевым средством широкого действия, активным, что иллюстрируют данные таблицы 3, в отношении опухолевых клеток карциномы легкого человека А549 (IC50 0.0008), аденокарциномы молочной железы MCF-7 (IC50 0.0008) и карциномы шейки матки M-HeLa (IC50 0.001). Основным недостатком препарата сравнения Арглабин является полное отсутствие селективности, показатель его цитотоксичности (IC50) в отношении нормальных клеток печени (Chang liver) составляет 0.0006. Показатель индекса селективности лекарственного препарата Арглабин в отношении клеток опухолевых линий очень низкий: в отношении А549 и MCF-7 равен 0.8, в отношении M-HeLa - 0.6.
Данные таблицы 3 показывают, что водорастворимый ПГNaCo продемонстрировал высокую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток карциномы легкого человека А549 - IC50 0.023% (IC50 метанольного экстракта Thymus vulgaris L. (тимьян обыкновенный) составляет 0.34%) при высоком индексе селективности, равном 39 (IC50 0.9% в отношении Chang liver). При этом в отношении аденокарциномы молочной железы MCF-7 цитотокисчность ПГNaCo ниже цитотоксичности метанольного экстракта Thymus vulgaris L. (тимьян обыкновенный) - IC50 2.2% против IC50 0.14% соответственно.
Аналогичным образом калий-кобальт-полигалактуронат и композиции натрий-кобальт-полигалактуроната и калий-кобальт-полигалактуроната в массовом соотношении 1-2:-1-2 показывают высокую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток карциномы легкого человека А549 и аденокарциномы шейки матки M-HeLa, меньшую в отношении опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7: IC50 ПГКCo в отношении А549 равна 0.06%, M-HeLa - 0.05%, MCF-7 - 0.8%; для композиций ПГNaCo:ПГКCo эти показатели составляют соответственно:
при массовом соотношении 1:1 - 0.08%, 0.22% и 0.51%,
при массовом соотношении 1:2 - 0.14%, 0.31% и 0.55%,
при массовом соотношении 2:1 - 0.26%, 0.34% и 0.62%.
При этом их цитотоксичность в отношении онкоклеток селективна, поскольку IC50 ПГКCo и ПГNaCo:ПГКCo в отношении Chang liver больше 1.0.
Индекс селективности соединения ПГКCo в отношении А549 равен 17, в отношении M-HeLa - 20, что указывает на высокую селективность данного соединения в отношении данных опухолевых линий, т.к. соединения с SI (10 считаются высокоселективными. При этом SI ПГKCo в отношении MCF-7 равен 1.5. Высокоселективной является композиция ПГNaCo и ПГKCo в массовом соотношении 1:1 в отношении карциномы легкого человека А549 (SI>12.5), однако и композиции в других соотношениях селективны в отношении всех представленных онкоклеток (табл.3).
Композиции, содержащие ПГNaCo и металлокомплекс пектинового биополимера с макро-или микроэлементом в массовом соотношении 3:1, также проявляют высокую цитотоксичность в отношении опухолевых клеток карциномы легкого человека А549 и меньшую в отношении опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7, IC50 в отношении А549 составляет для ПГNaCo:ПГNaZn - 0.07%, ПГNaCo:ПГNaCr - 0.1%, ПГNaCo:ПГNaMn - 0.2%, ПГNaCo: ПГNaMg - 0.1%; в отношении MCF-7 - для ПГNaCo:ПГNaZn - 0.12%, ПГNaCo:ПГNaCr - 0.8%, ПГNaCo:ПГNaMg - 0.7%, для ПГNaCo:ПГNaMn>1.0%. В отношении аденокарциномы шейки матки M-HeLa IC50 составляет для ПГNaCo:ПГNaZn - 0.9%, ПГNaCo:ПГNaCr - 0.2%, ПГNaCo: ПГNaMg - 0.2%.
При этом высокую селективность проявляют: ПГNaCo:ПГNaZn - в отношении двух видов раковых клеток (индексы селективности в отношении А549 - 20, в отношении MCF-7 - 12), ПГNaCo:ПГNaCr и ПГNaCo:ПГNaMg как в отношении А549 (индексы селективности 13 и 9 соответственно), так и в отношении M-HeLa (индексы селективности 7 и 4.5 соответственно).
Таким образом, заявленные средства обладают высокой цитотоксичностью в отношении опухолевых клеток карциномы легкого человека А549 и проявляют высокую селективность к нормальным клеткам печени Chang liver, что обусловливает возможность их использования в качестве противоопухолевых препаратов.
В отношении опухолевых клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 эффективной является фармакологическая композиция ПГNaCo:ПГNaZn (IC50 0.12; SI 12). В отношении опухолевых клеток карциномы шейки матки M-HeLa из предложенных фармакологических композиций на основе ПГNaCo наибольшую противоопухолевую активность проявила композиция ПГNaCo:ПГNaCr (IC50 0.2; SI 7).
Индукция апоптотических эффектов заявляемыми средствами
Для установления связи цитотоксического действия тестируемых заявляемых противоопухолевых средств с индукцией апоптоза методом проточной цитометрии определено апоптотическое действие на раковые клетки заявляемых средств, результаты представлены для фармакологических композиций ПГNaCo:ПГNaCr (3:1) и ПГNaCo:ПГKCo (1:1) на раковые клетки M-HeLa. Апоптоз - регулируемый процесс программируемой клеточной гибели, в результате которого клетка распадается на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной. Фрагменты погибшей клетки обычно очень быстро (в среднем за 90 минут) фагоцитируются макрофагами либо соседними клетками, минуя развитие воспалительной реакции [Сербин М. Е., Щербак Е. В. Апоптоз и его молекулярные эффекторы // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии: Сборник / под редакцией проф., д.м.н. Н.Н. Ильинских. - Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2004. Вып.11].
Апоптотические эффекты измеряли методом проточной цитометрии с использованием протокола окрашивания аннексином V-Alexa Fluor 647. Значения представлены как среднее (стандартное отклонение (n=3). L - живые клетки; D - мертвые клетки; Ea - клетки в раннем апоптозе; La - клетки в позднем апоптозе [Voloshina AD, Sapunova AS, Kulik NV, Belenok MG, Strobykina IYu, Lyubina A, et al. Antimicrobial and cytotoxic effects of ammonium derivatives of diterpenoids steviol and isosteviol // Bioorg. Med. Chem. 2021. 32. 115974. DOI: 10.1016/j.bmc.2020.115974].
Клетки M-HeLa обрабатывали в течение 24 часов заявляемыми средствами ПГNaCo:ПГNaCr (3:1) и ПГNaCo:ПГKCo (1:1) в концентрациях 0.1% и 0.2%. Результаты представлены на фигуре. Можно видеть, что, после 24 часов обработки для обеих фармакологических композиций наблюдались апоптотические эффекты в клетках M-HeLa. Анализ апоптотических эффектов характеризует дозозависимый характер, особенно в случае позднего апоптоза. В концентрации 0.1%, не превышающей IC50, фармакологическая композиция ПГNaCo:ПГNaCr (3:1) вызывает ранний и поздний апоптоз в 12.83% и 13.82% клеток M-HeLa, соответственно, а фармакологическая композиция ПГNaCo:ПГKCo (1:1) - ранний и поздний апоптоз в той же концентрации в 5.61%. и 6.64% клеток М-HeLa соответственно. Видно, что композиция ПГNaCo:ПГNaCr (3:1) в концентрации 0.1% более активно индуцирует апоптоз, чем ПГNaCo:ПГKCo (1:1). При увеличении концентрации соединений до 0.2% количество клеток в позднем апоптозе увеличивается: для композиции ПГNaCo:ПГNaCr (3:1) более, чем в 2 раза (с 13.82% до 28.30%); для композиции ПГNaCo:ПГKCo (1:1) - более, чем в три раза (с 6.64% до 21.34%). Результаты предполагают, что цитотоксичность исследованных фармакологических композиций в раковых клетках M-HeLa обусловлена апоптотическим путем.
Таким образом, заявляются средства, расширяющие арсенал противоопухолевых водорастворимых средств на основе пектинового биополимера, обладающих биодоступностью, малотоксичностью (ЛД50 выше 15000 мг/кг) и селективной цитотоксической активностью в отношении опухолевой клеточной линии карциномы легкого человека А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и карциномы шейки матки М-HeLa, практически не оказывающих токсического влияния на нормальные клетки человека. Достоверно установлено, что макро- и микроэлементы в составе пектиновых металлокомплексов при их пероральном применении всасываются в кровь и усваиваются организмом. Это позволяет ожидать перспективность заявляемых средств для лечения онкологических заболеваний, а также расширяет спектр известных лекарственных средств в этой области медицины.Противоопухолевые средства на основе макро- и микроэлементсодержащих полигалактуронатов (варианты)
| Таблица 1 Характеристики используемых металлокомплексов | |||||
| Образцы | Содержание металлов, % | Элементный состав, % | [α]D20 | ||
| С | Н | N | |||
| ПГNaCo | 4.68 (Na); 3.28 (Co) |
31.91 | 4.70-4.51 | 0.40 | +201.7 (С 0.5; H2O) |
| ПГКCo | 5.79 (K); 3.50 (Co) |
31.00-31.51 | 4.99-5.12 | (0.50 | +189.5 (С 0.5, H2O) |
| ПГNaZn | 3.44 (Na); 3.13 (Zn) |
30.63-30.55 | 5.75-5.87 | (0.50 | +195.4 (С 0.5; H2O) |
| ПГNaCr | 4.60 (Na); 2.87 (Cr) |
31.65-31.67; | 5.70-5.63 | (0.50 | +176.5 (С 0.5; H2O) |
| ПГNaMn | 4.92 (Na); 2.68 (Mn) |
30.45-30.52 | 5.65-5.71- | (0.50 | +210.2 (С 0.42; H2O) |
| ПГNaMg | 4.60 (Na); 2.75 (Mg) |
30.62-30.13 | 4.7-4.66 | (0.50 | +191.0 (С 0.5; H2O) |
Противоопухолевые средства на основе макро- и микроэлементсодержащих полигалактуронатов (варианты)
| Таблица 2 Содержание металлов в заявляемых композициях | |||
| Композиция | Содержание металлов, % | ||
| ПГNaCo: ПГКCo (1:1) | 3.42 (Сo) | Na (2.23) | K (3.71) |
| ПГNaCo: ПГКCo (2:1) | 3.36 (Co) | Na (3.12) | K (1.93) |
| ПГNaCo: ПГКCo (1:2) | 3.41 (Co) | Na (1.56) | K (3.86) |
| ПГNaCo: ПГNaZn (3:1) | 2.67 (Сo) | Na (4.70) | Zn (0.96) |
| ПГNaCo: ПГNaCr (3:1) | 2.54 (Сo) | Na (4.88) | Cr (0.36) |
| ПГNaCo: ПГNaMg (3:1) | 2.80 (Сo) | Na (4.70) | Mg (0.53) |
| ПГNaCo: ПГNaMn (3:1) | 2.45 (Сo) | Na (4.47) | Mn (1.43) |
Противоопухолевые средства на основе макро- и микроэлементсодержащих полигалактуронатов (варианты)
| Таблица 3 Цитотоксичность заявляемых противоопухолевых средств на основе макро- и микроэлементсодержащих полигалактуронатов | |||||||
| Наименование образца | Опухолевые линии | Нормальные линии | |||||
| MCF-7 | А549 | M-HeLa | Chang liver | ||||
| IC50, % | SI | IC50, % | SI | IC50, % | SI | IC50, % | |
| ПГNaCo | 2.2±0.2 | - | 0.023±0.002 | 39 | известно | 0.9±0.07 | |
| ПГKСо | 0.8 | 1.3 | 0.06 | >17 | 0.05 | >20 | >1.0 |
| ПГNaCo: ПГKСо (1:1) | 0.51±0.03 | >2 | 0.08±0.07 | >12.5 | 0.22±0.01 | >4.5 | >1.0 |
| ПГNaCo: ПГKСо (1:2) | 0.55±0.04 | >1.8 | 0.14±0.01 | >7 | 0.31±0.01 | >3.2 | >1.0 |
| ПГNaCo: ПГKСо (2:1) | 0.62±0.04 | >1.6 | 0.26±0.02 | >3.8 | 0.34±0.01 | >2.9 | >1.0 |
| ПГNaCo: ПГNaZn | 0.12±0.01 | 12 | 0.07±0.006 | 20 | 0.9±0.07 | 1.5 | 1.4±0.1 |
| ПГNaCo: ПГNaCr | 0.8±0.06 | 1.6 | 0.1±0.008 | 13 | 0.2±0.01 | 7 | 1.3±0.1 |
| ПГNaCo: ПГNaMn | >1 | 0.4 | 0.2±0.02 | 2 | - | - | 0.4±0.03 |
| ПГNaCo: ПГNaMg | 0.7±0.06 | 1.3 | 0.1±0.009 | 9 | 0.2±0.01 | 4.5 | 0.9±0.07 |
| Пектин цитрусовый | >1.5 | 1 | >1.5 | 1 | >1.5 | 1 | >1.5 |
| Метанольный экстракт Thymus vulgaris L. (тимьян обыкновенный) | 0.14±0.01 | 2.6 | 0.34±0.02 | 1.1 | 0.25±0.02 | 1.4 | 0.36±0.01 |
| Арглабин | 0.0008 | 0.8 | 0.0008 | 0.8 | 0.001 | 0.6 | 0.0006 |
1. Водорастворимое средство на основе полигалактуроната, обладающее селективной цитотоксической активностью в отношении карциномы легкого А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и карциномы шейки матки M-HeLa, представляющее собой калий-кобальт-полигалактуронат (ПГКCo) или его композицию с натрий-кобальт-полигалактуронатом (ПГNaCo) в массовом соотношении 1-2:1-2.
2. Водорастворимое средство на основе полигалактуроната, обладающее селективной цитотоксической активностью в отношении карциномы легкого А549, аденокарциномы молочной железы MCF-7 и карциномы шейки матки M-HeLa, представляющее собой композицию, содержащую в массовом соотношении 3:1 натрий-кобальт-полигалактуронат (ПГNaCo) и металлокомплекс пектинового биополимера натрий-металл-полигалактуронат соответственно, где биогенный металл представляет собой цинк, марганец, хром или магний (ПГNaZn, ПГNaMn, ПГNaCr, ПГNaMg).
