Способ выделения глутаминовой кислоты из культуральной жидкости

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено ОЗ.VIII.1970 (№ 1465908!28-13) с присоединением заявки ¹

Приоритет

Опубликовано 24.Ч.1972. Бюллетень № 17

Дата опубликования описания 20Х1.1972

М. Кл. С 12d 1.3. 06

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

УДК 547.466.64 (088.8) -""ÑÑÎÞÇÍÀß

"-ХЕ а т-. . а t Заб т уеКгБ

«у

r...:t"„..J ÉÑ- õ A

Л. M. Евстюгов-Бабаев, Н. В. Матвебвук и А. Ф..Шолии

Авторы изобретения

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Заявитель

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ГЛУТАМИНОВОЙ КИСЛОТЫ

ИЗ КУЛЬТУРАЛЬНОЙ )КИДКОСТИ

Изобретение относится к производству аминокислот, в частности глутаминовой кислоты из культур альной жидкости микроорганизмов.

Известен способ выделения глутаминовой кислоты из культуральной жидкости путем отделения от нее биомассы, полученной в результате выращивания,продуцентов глутаминовой кислоты на питательной среде, которая содержит в качестве источников углерода и азота, необходимых для биосинтеза, мелассу, соли аммония и мочевину. Отделенную культуральную жидкость пропускают через две ионообменные колонки с катионитами, элюируют глутаминовую кислоту с колонок раствором аммиака с последующим выделением кислоты в виде кристаллов и регенерируют ионообменные смолы.

С целью получения более очищенной глутаминовой кислоты по предлатаемому способу раствор, выходящий из первой ионообмен ной колонки, собирают и производят выделение из него кристаллов глутаминовой кислоты, например, путем охлаждения раствора и подкисления его. При этом через вторую ионообменную колонку пропускают раствор после отделения от него кристаллов глутаминовой кислоты с дальнейшей элюцией глутаминовой кислоты раствором аммиагка и после упаривания элюата с последующим выделением из данного раствора аналогичным способом также кристаллов глутаминовой кислоты и смешиванием полученных кристаллов с первой и второй ионообменных колонок.

Для упрощения генерации смолы этот про5 цесс целесообразно проводить путем пропуска раствора из неорганических кислот последовательно через обе колонки.

Подкисление раствора для выделения кристаллов глутаминовой кислоты проводят до

10 рН 3,2.

Элюироваиие глутаминовой кислоты проводят пугем пропуска;раствора аммиака последовательно через обе колонки.

Выделенную после первой стадии кристал15 лическую глутаминовую кислоту растворяют в растворе аммиака, используемого для регенерац ии ионообменных смол на колонках, причем перед кристаллизацией данный раствор упаривают и подиисляют до рН 3,2.

20 - Предлагаемый способ выделения глутаминовой кислоты осуществляют следующим способом, Культур альную жидкость после отделения биомассы и других взвешенных частиц про25 пускают через колонку с сульфокатионитом в

Н-форме. Кислый раствор, поступающий из колонны, сначала направляют на слив, и после прохода глутаминовой кислоты собирают в сборник. Затем культуральную жидкость про30 пускают через колонку в таком количестве, 339577 пока в условиях фронтального хроматографического процесса глутами новая кислота, поглощенная катионитом, вытеснится катионами щелочных и щелочноземелыных металлов, содержащимися в култьуральной жидкости. Собранный раствор (рН 2 — 4) с увеличенным по ср авнен ию с исходньгм содержанием глутаминовой кислоты и значительно уменьшенным содержанием катионов охлаждают до 5 С. Выделившуюся кристаллическую глутаминовую кислоту через 10 — 20 час отфильтровывают на друк-фильтре, фильтрат, содержащий глутаминовую кислоту, подают на вторую колонку с тем же катионитом, что и первая колонна, где глутаминовая кислота сорбируется на катионите (объем смолы второй колончы вдвое меньше, чем первой);.

Пропускание раствора через вторую колонну заканичвают до прохода глутаминовой кислоты. Раствор, выходящий из второй колонны и не содержащий глутаминовой кислоты, направляют на слив. После промывания колонны со смолой двукратным объемом воды на объем смолы для десорбц ии глутаминовой кислоты через .колонну .пропускают 8-ный раствор аммиака. B этих условиях с аммиачным раствором из смолы элюируется вся глутаминовая кислота, а катионы щелочных и щелочно-земельных металлов практически, полностью остаются на катионите. В собранной аммиачной фракции с глутаминовой кислотой растворяют ранее выделенную кристаллическую глутаминовую кислоту, содержащую посторонние примеси, затем раствор подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН

3,2. Глутаминовая кислота выпадает в виде кристаллов при охлажден ни до 5 С в течение

10 час. Кристаллы отфильтровывают и сушат.

Обе колонны с катионитом регенерируют пропусканием 1,5 н. раствора соляной кислоты последовательно через вторую и первую колонны.

Пример. Среда для микробиологического синтеза глутамнновой кислоты имеет следующ ий состав, %. мел асса 20 сернокислый аммоний 0,5 двузамещенный фосфат калия 0,5 сернокислый магний 0,3 мел 1 мочевина 1

Штамм-продуцент М. glutamicus 490. После окончания процесса ферментации кольтуральная жидкость содержит 40 г/л глутаминовой кислоты.

Для отделения биомассы и других взвешенных частиц в культуральную жидкость вводят прои перемешиван ии негашеную известь в виде порошка в количестве 20 г/л. Ра=твор нагревают до кипения, продолжающегося в течении 15 мин. После охлаждения раствора до

70 С осадок гидроок иси кальция и биомассы отфильтровывают на друк-фильтре при давлении 4 кг/см2 со средней скоростью фильтрац ии 0,2 м /м- час при толщине осадка 20 мм.

15 гс

25 зо

Осадок промывают водой, взятой в количестве 10 /о от объема пропущенной через фильтр культуральной жидкости. Промывные воды соединяют с основным фильтратом.

Полученный фильтр ат (рН 12,0 — 12,5, содержит 43 г/л глутаминовой икслоты) нейтрализуют при перемешивании концентрированной 73 /О-ной ортофосфорной кислотой (10 мл на 1 л фильтрата) до рН 7. Затем, раствор нагревают до кипения, выдерживают при 95—

100"С 10 мин и выпавший осадок фосфатов кальция фильтруют также как и в предыдущем случае после остывания раствора до 70 С.

Осадок промывают водой, взятой в количестве 10 /о от объема пропущенной через фильтр жидкости.

Полученный inосле второй фильтрации раствор содержит глутаминовую кислоту в концентраци|и 50 г/л (концентрация увеличивается за счет частичного упаривания жидкости), содержание сухих веществ 11, зольность

2,5 /о, содержащие Са2+ 100 мг-экв/л.

Обработанный раствор культуральной жидкости пропускают через колонку, заполненную еульфокатионитом КУ-2-20 в Н+-форме. Объем смолы в колонке 200 мл, высота слоя

250 мм, диаметр колонки 30 мм. Скорость пропускания раствора 0,21 мл/см -мин (0,5 объема раствора на 1 объем смолы в час). Через колонку пропускают 600 мл раствора (3 объема на 1 обьем смолы). Первые 200 мл раствора, выходящего из колонки и не содержащего глутаминовую кислоту, направляют Hd слив. Весь остальной раствор собгграют в одну емкость. Оставшийся в колонке между зернами катионита раствор вытесняют из колонки 100 мл воды, пропускаемой с той же скоростью, что и первоначальная, Собранный раствор с,рН 3,8, содержащий глутаминовую кислоту, охлаждают до 10 С. Через 12 час выпавшие кристаллы глутаминовой кислоты отфильтровывают, промывают холодной водой, подкисленной до рН 3,2, и сушат при б0 — 70 С.

Выход глутаминовой кислоты на этой стадии составляет около 30 от общего содержания в исходном растворе, пропускаемом через первую колонку, В первой колонке остается незначительное количество сорбированной глутаминовой кислоты, которую в дальнейшем элюируют раствором аммиака.

Фильтрат после отделения кристаллов глутаминовой кислоты пропускают через вторую колонку с тем же катионитом, что и первая.

Объем смолы во второй колонке (80 мл) примерно в два с lnOJIOBHnoH меньше, чем в первой. Диаметр колонки 20 мм, высота слоя смолы 250 мм, скорость пропускания раствора 0,47 мл/см .мин (0,5 объема раствора на

1 объем смолы в час). Через колонку пропускают 500 мл раствора, причем глутаминовая кислота в конце операци|и не обнаруживается на выходе колонки, а выходящий раствор направляют на слив. Глутаминовую,кислоту, сорбированную во второй колонке, элюируют

8 /о-ным раствором аммиака. Раствор аммиа339577

Составитель С. Могилевский

Техред 3. Тараненко

Корректор T. Бабакина

Редактор В. Блохина

Заказ 1839г8 Изд. М 811 Тираж 448 Подписное

ЦНИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров СССР

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 415

Сапунова, 2

Типография, пр. ка пропускают последовательно через первую и вторую колонки. Всего пропускают 240 мл раствора аммиака (3 объема на 1 объем смолы во второй колонке) с такой же скоростью, что и при насыщении смолы глутаминовой

1оислоты во второй колонке. После элюирования аммиаком обе колонки:последовательно промывают 300 мл воды со скоростьго

200 мл/час. Первые 150 лгл промывной воды присоединяют к элюату. Собранный элюат содержит глутаминовую кислоту в концентрации 40 г/г, незначительные примеси других аминокислот и неорганических катионов (например, Сав+ — 20 мг-экв/л) .

Из элюата при нагревании отходит аммиак, раствор упаривагот до объема 80 мл, подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 3,2 и охлаждают до 5 С. Через 10 час выпавшие кристаллы глутампновой KiHслоты отфильтровывают и сушат при температуре не выше 90 С.

Ионообменную смолу регенерируют пропусканием 200 мл 1,5 н. раствора НМОз последовательно через первую и вторую колонки со скоростью 200 мл/час. Выходящий раствор не содержит глутаминовой кислоты. Перед следующим циклом колонки промывают

600 мл во ды.

В результате кристаллизации из раствора после пропускания через первую колонку получают 10 г глутаминовой кислоты (30% от всего содержания в исходном растворе) с содержанием основного вещества 94%. Из аммиачного элюата выделяют 18,5 г глутаминовой кислоты 99%-ной чистоты, зольность менее 0,3%, точка плавления 199 . Выход из этой стадии около 60 . Суммарный выход глутаминовой кислоты 90%.

Предмет изобретения

1. Способ выделения глутаминовой кислоты из культуральной жидкости путем отделения от нее биомассы, полученной в результате выращивания продуцентов глутаминовой кислоты на питательной среде, содержащей в,качестве

45 источников углерода и азота, необходимых для биосинтеза, мелассу, соли аммония и мочевину, пропускания отделенной культуральной жидкости через две ионообменные колонки с катионитами, элюирования глутаминовой кислоты с колонок раствором аммиака с последующим выделением кислоты в виде кристаллов и регенерацией ионообменных смол, отличагощийся тем, что, с целью получения более очищенной глутам|иновой кислоты, раствор, выходящий из первой ионообменной колонки, собирают и производят выделение из него кристаллов .глутаминовой кислоты, например, путем охлаждения раствора и подкисления его, при этом через вторую ионообменную колонку пропускают раствор после отделения от него кристаллов глутаминовой кислоты с дальнейшей элюцией глутаминовой кислоты раствором аммиака и после упаривания элюата с последующим выделением из данного раствора аналогичным способом также кристаллов глутаминовой кислоты и смешиванием полученных кристаллов с первой и второй ионообменных колонок.

2. С пособ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса регенерации смолы,.процесс, проводят путем пропуска ра-Tвора одной из неорганических кнслот последовательно через обе колонки.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что подкисление раствора для выделения кристаллов глутаминовой кислоты проводят до рН 3,2.

4. Способ по пп. 1 — 3, отгичающийся тем, что элюирова нее глутамиповой кислоты проводят путем пропуска раствора аммиака пос. ледовательно через обе колонки. 5. Способ по пп, 1 — 4, отличающийся тем, что выделенную после первой стадии кристаллическую глутаминовую кислоту растворяю г в растворе аммиака, используемого для регенерации ионообменных смол на колонках, при этом перед кристаллизацией данный раств0p упаривают и под кисляют до величины рН, преимущественно равной 3,2.