Способ получения антигена для серологических реакций при безноитиозе животных

 

уус .".:-.-;:- :.: . Л ",:. :: .. б бибгпто \ гвнй аз А

;«Ф

3S 8863

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Соеетскин

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ф

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 25.1.1971 (Ko 1616731/30-15) М. Кл. А 61k 23/00 с присоединением заявки №

Приоритет

Комитет по делам изобретений н открытий нрн Сонете Министров

СССР

Опубликовано 08.11.1973. Бюллетень № 10

Дата опубликования описания 28Х!.1973

УДК 619.616.9.993.1 (088.8) Авторы изобретения

Ж. К. Омаров, В. М. Красов, М. В. Хван

Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ

РЕАКЦИЙ ПРИ БЕЗНОИТИОЗЕ ЖИВОТНЪ|Х

Изобретение относится к способам получения биологических препаратов, а именно нативных протозойных, гельминтозных антиген ов.

Известны способы получения антигепов из инвазионного материала, из которого путем ферментативного гидролиза получают очищенные цисты Besnoitia besnoiti с последующим шуттелированием, гомогенизированием и обезжириванием эфиром.

Однако этот способ очень продолжителен, трудно получать стандартный антиген.

Цель изобретения — получение стандартного и высокочувствительного аптигена для серологических реакций при безноитиозе крупного рогатого скота, реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой, гемагглютинации (РНГА), реакции преципитации в агаровом геле (РП-гель) ..

Предлагаемый способ позволяет получагь стандартный антиген.

Способ осуществляют путем применения трех технологических этапов: извлечение и очистка цист В, besnoiti (исходного материала), дезинтеграция цист ультразвуком, изоионное фракционирование ультразвукового лизата.

Цисты безноитий получают,при помощи специальной среды (растворов с низким значением рН), которую используют для механического извлечения цист пз соединительной ткани крупного рогатого скота, пораженного безноитиозом, и окончательно очищают их от остатков структурных элементов ткани фер5 ментативным перевариванием. Для получения антигена очищенные цисты дезинтегрируют ультразвуком, чтобы экстрагировать активное начало бензоитпй, после чего из озвученной среды (лизата) путем пзопонного фракцпо10 нирования (осаждения в изоэлектрической точке) выделяют основную антигенную фракцию, свободную от неспецифических балластных веществ.

Помимо безпоитиозного антигена способ

15 позволяет получать токсоплазменный, финнозный, цистицеркозный, туберкулезный и бруцеллезный антигецы, Способ приготовления антигена заключается в следующем.

Реактивы и растворы:

1. Натрий хлорпстый х. ч.

2. Калий тетргоксалат х. ч.

3. Соляная кислота х. ч.

25 4. Едкий натр х. ч.

5. Пепсин

6. 0,85 /О -ный раствор хлористого натрия (физиологический раствор).

7. О,1 и. раствор соляной кислоты на фи30 зиологпческом растворе хлористого натрия.

368863

65

Извлечение и очистка цист В. besnoiti. 3—

5 г фарша соединительной ткани, пораженной цистами безноитий, дополнительно измельчают ножницами, переносят в сосуд размельчителя тканей, заливают 300 — 400 мл 0,05 М раствора тетраоксалата калия на физиологическом растворе хлористого натрия (раствор 8) и гомогенизируют 5 — 7 мин. Полученную смесь центрифугируют при 1000—

1500 об)лин в течение 1 — 2 лин. Надосадочную жидкость, содержащую мукополисахариды, удаляют с помощью водоструйного насоса. Осадок ресуспендируют в 300 — 400 мл

0,05 М раствора тетраоксалата калия на физиологическом растворе и переносят в сосуд размельчителя тканей. Снова гомогенизируют

5 — 7 лин, смесь центрифугируют при том яе режиме с последующим удалением надосадочной жидкости. Эту процедуру повторяют

3 — 5 раз до полной прозрачности надосадочной жидкости. После этого осадок, содержащий цисты, переносят в химическую колбочку с 50 — 100 лл 0,5 /о-ного раствора пепсина на 0,05 М раствора тетраоксалата калия с

0,85О/О хлористого натрия (раствор 9) и ставят в термостат при 37 С. Через каждые 1—

2 час из ферментативной смеси пастеровской пипеткой на предметное стекло наносят каплю пробы для микроскопического контроля очистки цист. Цисты микроскопируют под малым увеличением микроскопа. Фермен тативное переваривание ведут до полного освобождения цист от остатков коллагеновых и мышечных волокон (в среднем 4 — 6 час). После окончания переваривания цнсты 2 — 3 раза отмывают на микроразмельчителе тканей гомогенизированием в 50 мл 0,05 М раствора тетраоксалата калия на физиологическом растворе хлористого натрия (раствор 8) в течение

2 — 3 лин. В осадке находятся извлеченные и очищенные от остатков тканей цисты безноитий.

Очищенн|ые цисты используют для изготовления антигена непосредственно после получения или хранят в физиологическом растворе хлористого натрия (раствор 6) с добавле= пнем мертиолата 1: 10000 при 4 С.

Дезинтеграция цист B. besnoiti. Дезинтеграцию проводят в специальном сосуде с водяным охлаждением для предотвращения нагревания озвучиваемой среды. В сосуд вносят

2 — 3 г (по сырому весу) очищенных цист безноитий и заливают 50 — 100 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты на физиологическом растворе хлористого натрия (раствор 7).

Дезинтеграцию осуществляют с помощью

УЗДН-1 воздействием ультразву.ковых волн частотой 22 — 35 кгпв/сек в течение 45 — 90 лин (в зависимости от степени очистки цист) до просветления обрабатываемой среды.

Озвученная среда представляет собой беловато-сероватую жидкость с небольшим количеством осадка, состоящего из кру.пных взвешенн ых частиц, осколков оболочек цист и отдельных неразрушенных цист безноитий

Осадок отделяют от жидкой части центрифугированием в течение 15 — 20 лин при 8000—

10000 об/лин и затем "àñòâîðÿþò в 20 — 30 мл дистиллированной воды при рН, равном

9 — 10, и температуре 35 — 40 С. Нерастворившуюся часть осадка удаляют центрифугированием при том же режиме.

Из надосадочной жидкости (Л) и растворенного осадка (Б) изоионным фракционированием выделяют специфическую антнгенную фракцию.

Выделение антигенной фракции из надосадочной жидкости (А). Надосадочная жидкость является основным материалом для получения безноитиозного антигена. Эту ан тигенную фракцию выделяют медленной нейтрализацией (изменением рН) надосадочной жидкости растворами едкого натра. Для этих целей используют 15, 10, 5 и 2,5О/о-ные растворы едкого IBTpa, При усреднении надосадочной жидкости в пределах рН от 3,5 до 5,5 выпадает обильный осадок. Формирование осадка происходит быстро и полно (крупны= ми хлопьями) в изоэлектрической точке при рН, равном 4, и температуре 35 — 40 С.

Эту специфическую аптигенную фракцию (фракция 1) отделяют от жидкой части центрифугированием в течение 15 — 20 мин при

8000 — 10000 об/мин. Если надосадочную жидкость подвергнуть дальнейшему подщелачиванию, то в пределах рН 9 0 — 10 5 может произойти выпадение незначительного количества второго осадка (фракция 2). Выпадение этого осадка прежде всего зависит от количества цист, взятых для дезинтеграции, их качества, полноты разрушения (дезинтеграции), точного установления изоэлектрической точки (рН 9,6) и температуры (35 — 40 С).

После центрифугирования и отделения второго осадка (при, 8000 †100 об!мин в течение 15 — 20 мин) надосадочная жидкость еще содержит вещества, дающие слабую положи= тельную реакцию на белок с реактивом Фолина, которые однако нельзя осадить в изоэлектрической точке без предварительного концентрирования надосадочной жидкости (фракция 3).

Исходя из того, что из трех фракций основ= ной (серологически высокоактивной и специ= фической) является фракция 1, весь процесс выделения из надосадочной жидкости ан1тигенной фракции практически сводится к осаждению только фракции 1.

Выделение антигенной фракции из растворенного осадка озвученной среды (Б). Из осадка озвученной среды, суспензированного в 20 — 30 лл дистиллированной воды, медленной нейтрализацией 10, 5 и 2,5О/о-ными рас= творами соляной кислоты при рН 3,5 — 5,5 (изоэлектрическая точка рН-4) и температуре

35 — 40 С осаждают антигенную фракцию, которая тождественна основной антигенной фракции 1 из надосадочной жидкости озвученной среды. Эту фракцию отделяют от жидкой части центрифугированием в течение

368863

Предмет изобретения

Составитель P. Махнюк

Редактор Е. Хорнна

Корректор Е. Михеева

Техред Т. Ускова

Заказ 1750/2 Изд. № 1388 Тпрагк 457 Подписное

Ц11ИИПИ Комитета по делам нзобрстсшгй и открытий при Совете Министров СССР

Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4, 5

Типография, пр. Сапунова, 2

15 — 20 мин при 8000 — 10000 об!мин и соединяют с ранее полученной фракцией 1. Надосадочную жидкость, содержащую балластн ые вещества отбрасывают.

Приготовление безноитиозного антигена.

Осадки антигенной фракции с изоэлектрической точкой рН-4, выделенные из надосадочной жидкости (Л) и осадка озвученной среды (Б), трехкратно промывают в дистиллированной воде центрифугированием при 8000—

10000 об!мин в течение 10 — 15 мин и затем растворяют в предельно малом объеме подщелаченной дистиллированной воды (30—

50 лгл) при рН 9,0 — 9,5 и температуре 35—

40 С. Этот раствор является безноитиозным антигеном.

Приготовленный таким образом безноптпозиый антиген не обладает антикомплементарными свойстгами. Он проявляет высокую активность н специфичность в реакции связывгния комплемента и других серологических реакциях. Хорошая растворимость антигена в дистиллированной воде позволяет различные серии этого препарата стандартизировать

5 по содержанию белка.

Для длительного хранения безноитиозный антиген консервируют мертиолатом (1: 10000) и ."табилизируют очищенной желатиной или лиофилизируют в защитной среде.

Способ получения антигена для серологических реакций при безноитиозе животных, 15 включающий извлечение и очистку цист

Besnoitia besnow>iti, отлггчагогг,инея тем, что, с целью стандартизации антигена, цисты дезинтегрируют улыразвуком, после чего проводят гыделение акт ганой и специфической фрак20 ции путем изононного фракционнрования.