Патент ссср 389446

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства ¹

М. Кл. 6 01п 21 00

А 23k 1/00

Заявлено 26.XI.1971 (№ 1719429/30-15) с присоединением заявки №

Гасударственный комитет

Савета Министрав СССР па делам изобретений и аткрытий

Приоритет

Опубликовано 05.VII.1973. Бюллетень № 29

Дата опубликования описания 20.XI.1973

УДК 543:636,085(088,8) ",бЦ 3CllEP 708

Автор изобретения

А. H. Леонов

Всесоюзный научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии

Заявитель

СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ В КОРМАХ

Изобретение относится к способам токсикологических исследований комбикормов и зернофуража.

Известен способ обнаружения в кормах токсических веществ, включающий получение фракций, содержащих зеараленон, афлатоксин и охратоксин, из хлороформенного экстракта исследуемого образца путем его обезжиривания гексаном и бензолом с последующей промывкой экстракта на колонке, содержащей силикагель, тремя соответствующими системами растворителей и определение этих трех веществ с помощью тонкослойной хроматографии. Однако этот способ позволяет обнаружить лишь некоторые микотоксины.

Предлагаемый способ увеличивает количество определяемых групп микотоксинов. Это достигается тем, что после обезжиривания гексаном хлороформенный экстракт элюируют этилацетатом и в полученном элюате определяют микотоксины из группы диацетоксисцирпенолов.

Кроме того, гексановый и бензольный алюат, содержащие жировую фракцию, выпаривают до полного удаления растворителя и исследуют на наличие жирорастворимых микотоксинов, например комплекса фузариогенинов (поэфузариогенина и спорифузариогенина), представляющих собой вещества из группы стеролов циклопентафенантренового ряда, имеющие шестичленное ла кто новое кольцо с двумя двойными связями в положении а — P, у — 6, путем обработки части полу5 ченных жиров щелочью до получения однородной эмульсии в присутствии небольших количеств обезвоженного диэтилового эфира.

Наличие в жировой фракции фузариогенинов, реагирующих со щелочью, ведет к образова10 нию смолообразных продуктов конденсации, нерастворимых в щелочном растворе и эфире, что вызывает образование темного слоя на границе раздела этих двух фаз (эфир: щелочь) . Наличие такого слоя свидетельствует

15 о том, что исследуемая проба содержит фузариогенины, а отношение его объема к объему исследованного жира позволяет судить об их количестве. Эту же жировую фракцию проверяют на содержание ряда

20 других микотоксинов, которые могут в ней содержаться, т. е. определяют в масле кислотное число, стойкость водномасляной эмульсии и проводят с экстрагированными жирами ряд микрохимических реакций, ха25 рактеризующих их доброкачественность.

Способ осуществляют следующим образом.

Берут определенную навеску зерна (дерти, комбикорма), высушенного до воздушносухого состояния, измельченного и просеянного

З0 через две пары сит для получения однород389446

60

65 ной фракции частиц, и экстрагируют эту навеску, увлажненную половинным по весу объемом дистиллированной воды, химически чистым хлороформом (десятикратным объемом по отношению к объему воды) в присутствии диатомовой земли (/> по весу от веса исследуемого образца). Экстрагирование ведут 30 мин в плотно закрытом сосуде, или в течение меньшего времени в скоростном блендоре (мацераторе), Полученный экстракт отфильтровывают через бумажный фильтр под слабым разряжением, или без такового, и часть получаемого фильтрата (0,2 от объема хлороформа использовавшегося для экстр акции) переносят на хроматографическую колонку, последовательно заполненную обезвоженным сульфатом натрия и силикагелем в соотношении: Na SO4 . силикагель:

: NaqSO4 (5: 10: 15), таким образом, чтобы общий вес веществ, наполняющих колонку, составлял половину от веса взятой для исследования пробы продукта. (Силикагель должен иметь размер частиц 0,05 — 0,2 мм и активирован 1 час при 105 †1 С перед внесением в колонку) . Исследуемый хлороформенный фильтрат на колонку переносят с помощью трехкратного объема гексана.

Элюирование гексаном жировой фракции проводят со скоростью 10 — 20 мл/мин, Полученный элюат (I) отбирают и выпаривают для получения жира, с которым затем проводят микрохимические реакции. Промывают колонку. гексаном, а затем таким же количеством этилацетата и полученную фракцию (П) сохраняют для определения в ней токсинов диацетоксисцирпенола и родственных ему веществ, образуемых грибами

F. tricinetum F. sporotrichieIla и некоторыми другими. Продолжают промывать колонку бензолом и отобранную фракцию (IП) сохраняют для проведения микрохимических исследований. Промывают колонку системой растворителей ацетон: бензол (9: 95 по объему), общий объем которой составляет пятикратный объем первоначально внесенного на колонку хлороформенного экстракта, и отбирают фракцию (IV), содержащую зеараленон. Колонку промывают трехкратным по отношению к первоначальному хлороформенному объему количеством безводного диэтилового эфира и выпаривают его. В том случае, если после выпаривания получен жир (V), исследуют его микрохимически. Элюируют фракцию (VI), в которой далее определяют афлатоксин, трехкратным объемом системы хлороформ — метанол (97: 3 по объему). Фракцию (VII) элюируют с помощью пятикратного объема системы бензол: ледяная уксусная кислота (1: 9 по объему). В полученном элюате определяют охратоксин.

Выпаривают полученные фракции (IV и VI) до сиропообразной консистенции, а фракцию (VI) — досуха в роторном испарителе, избегая сильного нагревания. Хлороформом переносят все три остатка в пробирки с при5

5О тертыми пробками, выпаривают растворитель в токе азота и хранят полученные вещества для тонкослойной хроматографии определения зеараленона, афлатоксина и охратоксина, т. е, подвергают разделению фракции в тонком слое силикагеля при наличии на пластинках вещества — свидетеля в системах растворителей:

Для фракции (IV) — бензол: уксусная кислота (9: 1) и этанол: хлороформ (5: 95) при объеме пробы, наносимой на пластинку, 10 мкл от 0,5 мл бензола, в котором растворен сухой остаток.

Для фракции (VI) — хлороформ: ацетон (9: 1), при том же объеме наносимой на пластинку пробе.

Для фракции (VII) — бензол: уксусная кислота (9: 1) и толуол: этилацетат: формамид (5; 4: 1) при тех же условиях.

Проявление хроматографии производят с помощью длинного и короткого ультрафиолетового света с длиной волны порядка 366 и

254 нм. Для определения токсинов F. tricinetum полученную фракцию (П) осторожно выпаривают и наносят в этилацетате (10 мкл из 0,5 мл) на пластинку, и разделяют в системе этилацетат: толуол (3: 1). После подсушивания пластины ее опрыскивают концентрированной серной кислотой и нагревают при 125 С. Появляющиеся после такого проявления буровато-коричневые пятна, локализованные в зоне RF 0,2 — 0,25, как правило, свидетельствуют о наличии эфира 4-ацетамидо-4-гидрокси-2-бутеновой кислоты у-лактона, а зеленоватые или серовато-зеленые пятна, локализованные в зоне с RF — 0,6, соответствуют другому токсину F. tricinetum, а именно — 4р, 15-диацетокси - 8а- (3- метилбутирилокси) - 12,13 - эпокситризотец - 9-ен-За-ол (Т-2токсин). Определение этих токсинов, как и определение токсинов, содержащихся во фракции IV, VI и VII, желательно проводить в присутствии вещества — свидетеля.

Масла, полученные в результате выпаривания гексановой промывки (фракции 1), используют для подтверждения наличия в исследуемом образце зерна токсических веществ, образуемых некоторыми грибами из рода Fusarium. Эти вещества, представляющие из себя стеролы циклопентафенантренового ряда с шестичленным лактоновым кольцом, реагируя со щелочами, способны образовывать нерастворимые в последних соединения. Поэтому при воздействии на водномасляную эмульсию растворов щелочей на границе раздела фаз возникает темно-окрашенное кольцо. Эту микрохимическую реакцию проводят следующим образом. В пробирку с 0,1 — 0,2 мл масла, полученного в результате выпаривания гексанового элюата (фракция I) и элюата, полученного после промывки диэтилового эфира (фракция V), приливают 5 мл 2н. NaOH и эмульгируют масло в щелочи. К щелочной эмульсии масла приливают небольшое (1 — 2 мл) количество

389446

Составитель Р, Махнюк

Тсхред T. Миронова

Корректоры: Л. Царькова и Л. Орлова

Редактор О. Филиппова

Заказ 3005/8 Изд. М 800 Тираж 755 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, >К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, и диэтилового эфира. Появление бурого кольца на границе раздела двух фаз указывает на наличие в маслах упомянутых выше токсических стеролов. Этот же феномен, получаемый с маслами из фракции V, свидетельствует о весьма значительном содержании в пробе >кирорастворимых микотоксинов. Полученный результат может быть подтвержден постановкой кожной пробы на кролике с маслами, полученными из гексановой фракции (I), Масла, находящиеся в бензольном элюате (фракция II), желательно использовать для определения кислотного числа. Для этого

0,1 — 0,2 г масла растворяют в этанольно-диэтилово-эфирной смеси (1: 1) и титруют

0,1 н. раствором едкого кали в присутствии фенолфталеина. Для вычисления кислотного числа количество (лл) щелочи умножают на ее титр и на 1000 (перевод в мг) и относят к навеске масла (в г). Кислотное число, превышающее 30, как правило, свидетельствует о недоброкачественности исследуемого зерна в санитарно-микологическом отношении.

Предмет изобретения

1. Способ обнаружения микотоксинов в кормах, включающий получение фракций, содер>кащих зеараленон, афлатоксин и охратоксин, из хлороформенного экстракта исследуемого образца путем его обезжиривания гексаном и бензолом с последующей промыв5 кой экстракта на колонке, содержащей силика гель, тремя соответствующими системами растворителей и определение этих трех веществ с помощью тонкослойной хроматографии, от гичающийся тем, что, с целью увели10 чения количества определяемых групп микотоксинов, после обезжиривания гексаном хлороформенный экстракт, внесенный в колонку, элюируют этилацетатом и в полученном элюате определяют микотоксины из

15 группы диацетоксисцирпенолов.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что, с целью получения данных, косвенно свидетельствующих о наличии в исследуемом образце ряда микотоксинов неопределенной струк20 туры, масла, полученные в результате обезжиривания экстракта гексаном и бензолом, используют для постановки микрохимических реакций для выявления наличия в исследуемом образце токсических стеролов цикло25 пентафенантренового ряда, содержащих лактоновое кольцо, а также для определения кислотного числа, являющегося показателем качества исследуемого образца.