Патент ссср 400107

 

ОПИСАНИЕ 400l07

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента №

Заявлено 02.Ill.1971 (№ 1628539/23-4) M. Кл. С 07g 7/028

Приоритет 03.III.1970, № 10240/70, Beëèêîáðèтания

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР ао делам изобретений и открытий

Опубликовано ОЗ.Х.1973. Бюллетень K- 39

Ъ ДК 577.15.072(088.8) Дата опубликования описания 16.IV.1974

Автор изобретения

Иностранец

Антоон Джерардус ван Вельцен (Нидерланды) Иностранная фирма

<Конинклийке Нидерландше Гистен Спиритусфабрик Н. В.» (Нидерланды) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОЙ КОМПОЗИЦИИ

Изобретение относится к способу получения ферментной композиции, которая может найти применение в составе моющих средств.

Известен способ получения ферментной композиции, состоящий в том, что водный раствор фермента контактирует с водным раствором полимера, имеющего углерод-у-глеродную цепь и содержащего в качестве заместителей углеводородные и карбоксильные группы, Контакт фермента с полимером проводится в пределах рН среды 3,0 — 3,5, причем выпадает осадок фермент-полимерного комплекса.

В качестве фермента используют очищенный препарат трипсина, а в качестве полимера— полиметакриловую кислоту с мол. в. около

50 000.

Предлагаемый способ получения ферментпой композиции состоит в том, что водный раствор фермента контактирует с водным раствором полимера, имеющего углерод-углеродную цепь и содержащего в качестве заместителей углеводородные и карбоксильные группы. Контакт фермента с полимером происходит в пределах рН 2 — б, причем выпадает осадок фермент-полимерного комплекса.

В качестве полимера применяют, например, сополимер малеиновой кислоты и стирола с соотношением остатков малеиновая кислота:

: стирол 3: 1 — l:3 и средним мол. в. выше

20 000.

Наилучшие результаты дает применение со5 поли repa малепповой кислоты и стирола с соотношением оста t ков малепновая кислота:

: стирол, равным 1: l, u средним мол. в. выше

10000. Этот полимер применяют в виде 15—

25%-ного водного раствора, добавляя его в

10 требуемом количестве к раствору фермента, Заводская марка С-942 (фирма «Дюпон де

Немур») представляет собой 25%-ный водный раствор.

Количество полимера, которое должно использоваться для образования комплекса, заННсНТ от природы фермента и его концентрации, а также условий среды, таких как рН, присутствие солей и т. и. Оптимальное комплексообразование зависит от электростатических зарядов фермента и полимера. 1 ребуемые соотношения растворов фермента и полимера могут быть установлены экспериментально.

В качестве фермента используют про.". продуцируемую при культивировании микроорганизма вида Bacillus, например В. subtilis или В. alkalophilus, а также амилазу или липазу и некоторые другие ферменты. Источни40О107

65 ком фермента служит отфильтрованный клеточный экстракт.

Образующийся фермент-полимерный комплекс подвергают дополнителы!Ой обработке раствором, содер>кащим ионы металла такого, как, алюминий, железо, хром, цирконий. Ионы этих металлов, взаи чоде1!ствуя с карбоксильными группами фермент-полимерного комплекса, способствуют образованию поперечных связей и осаждению. 11омимо указанных ионов могут быть использованы другие реагенты, способные к аналогичному взаимодейcTBBlo с карбоксильными группами.

Комплекс отделяют от раствора фильтрованием, промывают органическим растворителем (ацетоном или диэтиловым эфиром) и высушивают.

Предлагаемый способ обеспечивает получение ферментной композиции с высокой активностью в сочетании с высокой стабильностью и низким содержанием примесей при отсутствии токсических.

Пример 1. Сырую протеазу, полученную ферментапией В. subtilis, растворяют в воде и рН доводят до 7. К раствору фермента добавляют подходящее количество (около

10 об.%) 15%-ного раствора сополимера малеиновая кислота: стирол 1: 1. Выпадает небольшое количество осадка. Смесь перемешивают и рН регулируют до 5 путем добавления разбавленной НС1. Образуется большое количество осадка, который является комплексом протеазы и полимера. Полученную суспензию перемешивают в течение одного часа.

Осадок отфильтровывают и промывают ацетоном и фильтруют. Затем осадок сушат. Полученный комплекс протеазы имеет в 2 — 4 раза большую чистоту, чем исходный сырои материал.

Пример 2. К концентрированному фнльтрату культуры, полученной ферментацией

В. subtilis, с рН 7 добавлено 10 об.% разбавленного (20%-ного) раствора G-942 в воде. Образовалось небольшое количество осадка, рН поддерживают около 4 добавлением разбавленной серной кислоты. Образовавшийся осадок является полимерно-протеазным комплексом. Осадок отделяют таким же образом, что и в примере 1. Полученный препарат протеазы имеет чистоту в 2 — 4 раза больше, чем препарат, полученный обычным способом. Выход 90%, рассчитанный из активности протеазы в начальном растворе. Из этого ферментного комплекса получена моющая композиция с такими же моющими свойствами, как мо1ощая композиция, полученная с использованием соответствующего количества обычного препарата этого же фермен1;:.

Пример 3. К раствору алкалазы (заводская марка для фермента, полученного из

В, subtilis) добавлено 5 об.% разбавленного раствора G-942. рН регулировалось до 4,2 с помощью 4 и. уксусной кислоты. Осадок отделен фильтрацией, промыт и высушен ацетоном. Выход 92%.

Пример 4. К 800 мл фильтрату культуры

Ь. айа!Ор1н1ив дооавлено 16 мл разбавленного в соотношении l: 5 полимерного р3с! I30pa G-942. рН регулировалось до 4,2 4 н. уксуснои кислотой. Оорàзованный осадок отпев!рифугирован, промыт смесью метилового спирта и ацетона с соо!ношением 1: 1 и высушен. Выход 86%.

11р и м е р 5. К. 200 мл раствора амилазы, полученной из H. subtilis, добавлено 20 мл разбавленного в соотношении 1: 5 раствора !

1-942, р11 регулировалось до 4 добавлением

l н. соляной кислоты. Образованный осадок отцентрифугирован и смешан с небольшим количеством воды. рН суспензии регулировали до 7 с помощью 1 H. гидроокиси натрия.

За!ем к суспензии добавлено три объема ацетона. После фильтрации, промывки ацетоном и сушки получен продукт, имеющий 81% начальной активности амилазы.

Пример 6. К 20 мл раствора, содержащего 600 мг препарата липазы, получе!шой из бульона культуры В. subtilis и имеющего рН 4,5, добавлено 2 мл разбавленного в соотношении 1: 5 раствора G-942, рН регулировалось до 3,5 1 и. соляной кислотой. Осадок выделен центрифугированием, промыт ацетоном и высушен. Выход 263 мг продукта, содержащего около 90% начальной активности липазы.

Пример 7. К 40 мл раствора, содержащего 1% препарата лактазы, полученного из дрожжей, и 0,5% желатина, добавлено 4,4 мл разбавленного в соотношении 1: 5 раствора

G-942. рН регулировалось до 4. Образованный осадок имел 61% активности лактазы от начального раствора. Контрольный опыт проведен таким же путем, но при разрушении

G-942, в результате чего также получен осадок после подкисления. Однако этот осадок содержит менее 1% первоначальной активности лактазы.

Пример 8. Фильтрат алкогольдегидрогеназы получен из автолизата пекарских дрожжей. К 120 мл этого фильтрата (рН 7) д: бавлено 4 об. разбавленного в соотношении

1: 5 раствора G-942. рН регулировалось до

4,5 4 н. уксусной кислотой. Осадок выделен центрифугированием, Предмет изобретения

l. Способ получения ферментной композиции, отличающийся тем, что водный раствор фермента контактирует с раствором полимера, растворимого в водной щелочи и имеющего нормальпу!о или разветвленную углерод-углеродную цепь с карбоксильной группой, распределенной по этой цепи, при этом в кя !естве допоl!нителы!Ых заместителей этОт полимер может содержать не обязательно замещенные углеводородные группы, причем углерод-углеродная цепь и/или углеводородный заместитель (заместители) не обязательно прерываются гетероатомами, предпочтительно

400107

Составитель В. Пастухова

Техред Т. Ускова

Редактор П. Джарагетти

Корректор А. Степанова

Заказ 223/15 Изд. № 57 Тираж 523 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, К-35, Раугнская иаб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2 атомами кислорода, при этом указанный полимер имеет молекулярный вес, по меньшей мере, 10000.

2. Способ по п. 1, отл и ч а ю щи йс я тем, что в качестве фермента используют протеазу, получаемую из микроорганизма вида Bacillus, а также амилазу или липазу.

3. Способ по п. 1, отлич а ю щи йс я тем, что указанный полимер содержит— — CHXCY(COOH)-группу, где Х вЂ” атом водорода или карбоксильная группа, à Y — атом водорода или метильная группа, причем по5 лимер может быть сополимеризован с одним или более мономером, или неполными низшими алкиловыми эфирами или неполными амидами этих мономеров.