Способ получения литических ферментов

 

СОЮЗ Советских

Социалистических

Респттблнн

К АВТОРСКОМУ СВЙДЕТЕЛЬСТВУ

Зависимое от авт. свидетельства №

М. Кл. С 2 i id 13 10

Заявлено 22,Х,1971 (№ 1707477/28-13) с присоединением заявки №

Государственный комитет

Совета Министров СССР оо делам изаеретений и открытий

Приоритет

О убликова,() 10.Х11.1973. Вюллет=ни № >7

УДК 577,15.07(088.8) Дата опубликования описания 1.IV.1)7!

Авторы изобретения

Л. Г. Логинова, И. Г. Головина, Л. М. Серегина и Э. П. Гужова

Институт микробиологии АН СССР

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

Изобретение относится к микробиологии.

Известен способ получения литических ферментов путем выращивания их продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота в присутствии минеральных солей с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости.

Для повышения активности ферментов в качестве продуцента используют микроорганизмы рода Micromonospora.

Из рода Micromonospora используют микроорганизм вида vul garis.

В качестве продуцента из вида используют штамм Micromonospora vulgaris РА-11-4.

В качестве источника углерода и азота для данного штамма используют кукурузную муку с добавлением к ней сухих кормовых дрожжей.

Термофильный актиномицет Micromonospora vulgaris РА-11-4 выделен из содержимого рубца крупного рогатого скота (проба рубцовой жидкости привезена из Ашхабада).

Характеристика Micromonospora vulgaris

PA-11-4. Морфология. Мицелий несептированный, тонкий. На гифах формируются одиночные споры диаметром 0,5 — 0,7 мк. Спороношение обильное. Споры имеют округлые очертания и полигональную форму. Оболочка спор гладкая.

Культуральные признаки. Рост на органических средах. Крахмально-казеиновая среда.

При 27 C роста нет. При 35 С и 65 С рост очень слабый. Рост хороший при 50 — 60 С.

5 Шестисуточные колонии при 55 С с диаметром

5,0 — 8,5 см плоские, с мелкимп радиальными складками, светло-бурые, центр колонии несколько приподнят. Нижняя сторона колоний окрашена в желтовато-бурый пли охряно-бу10 рый цвет. Пигмент в среду не выделяется. Воздушный мицелий белый, мучнистый или тонковолокнистый.

Сусло-агар — нет роста. Ломтики картофеля — нет роста, но на 200 о-ном картофельном

15 отваре рост культуры хороший. МПА — рост хороший. Колонии кожистые, плоские, вросшие в агар. Нижняя сторона колоний буроватая. Среда не пигмептирована. Воздушный мицелпй белый, мучнистый.

20 Рост на синтетических средах CPI, CPI I I, среда Чапека — Докса — слабый. На специально подобранной среде с глюкозой рост хороший. Колонии бесцветные нли буроватые.

Нижняя сторона колонии желтовато-бурая.

25 Воздушный мицелпй белый. Среда не пигмептирована.

Физиолого-биохимические свойства. )Келатину разжижает. Крахмал гидролизует. Молоко коагулирует, пептонизирует. Нитраты не вос30 станавливает. Кл тчатку не разлагает, 407945

100

ОД реакционной смеси без фермента через время 1

Из источников углерода хорошо усваивает глюкозу, крахмал, декстрин, глицерин, мальтозу, маннит и фруктозу, Хуже усваивает лимоннокислый и яблочнокислый натрий. Нет роста на средах с арабинозой, галактозой, ксилозой, лактозой, рамнозой, сахарозой, маннозой, инулипом, инозитом, дульцитом, натриевыми солями уксусной, щавелевой, янтарной и пировиноградной кислот.

Из минеральных источников азота усваивает KNO3 в сочетании с (NH4) 2SO.„no каждую из этих солей в качестве единственного источника азота плохо использует.

Из органических источников азота лучше всего усваивает пептон, хуже аспарагнн, глпцин, мочевину. Не усваивает алании как единственный источник азота.

Культура обладает очень слабой антибиотической активностью.

В лабораторных условиях культивирование

Misromonospora vulgaris PA-11-4 проводят глубинным способом (на качалке с 200—

250 об/мин) в колбах Зрленмейера емкостью

250 мл с 50 мл питательной среды.

Состав среды следующий, г/л:

Кукурузная мука 20

Кормовые дрожжи (сухие) 5 (N,Н4) gSOz 1

Ca COç 1

В среде водопроводной воды находится до

1 л; рН среды после стерилизации 7,0 — 7,2.

Температура культивирования 45 — 50 С, Длительность культивирования 48 час.

Реакционная смесь без фермента

Од через время t

Спектр действия препарата литических ферментов Micromonospora vulgaris PA-11-4 представлен в таблице.

Клетки грамположительных и грамотрицательных бактерий растворяются как мертвые, так и живые, причем последние характеризуются наибольшей степенью чувствительности.

Из испытанных 12 видов грамотрицательных бактерий легче всего лизировались клетки

E. coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas bluoresens, Aегоbacter cloacea.

Суспензии мертвых клеток указанных бактерий при инкубации с ферментным препаратом в конечной концентрации 0,01% просветлялись на 100% за 10 мин, а суспензии живых клеток — за 30 мин при концентрации более высокой — 0,025%. Кивые клетки других грамотрицательных бактерий: Aегоbacter aегоgenes, Vibrio costicolus некоторых видов рода

Hydrogenomonas лизировались на 60 — 90% при инкубации в течение 1 — 2 час или более при 0,025% концентрации ферментпого препарата.

4

В качестве посевного материала используют споровую суспензию Micromonospora vulgaris

PA-! 1-4, выращенного на агаризованной среде указанного выше состава.

Характеристика спиртового препарата литическик ферментов kficromoriospora ои/дапв PA-I I-4.

Литические ферменты в виде технического препарата получают путем выделения их (при охлаждении) из центрифугата культуральной жидкости осаждением этиловым спиртом в соотношении 1:4 (по объему). Выход препарата составляет в среднем 3 г/л. О качестве ферментного препарата судим по литической активности, определяемой по изменению оптической плотности суспензии испытуемых микроорганизмов и но протеолитической активности, определяемой по методу Номото и

Нарахаши в модификации Каверзневой и Pàñсулина.

При определении литической активности

4,5 мл суспепзни мертвых или живых клеток испытуемых микроорганизмов (с начальным ОД 0,5 — 1,0, что соответствует 8 — 16 мг по сухому весу) в 0,025-метровом фосфатном буфере с рН 8,0 с 0,5 мл 0,1% или 0,25%-ного раствора ферментного препарата в том же буфере инкубировали при 60 С. Гидролиз проводили в пробирках, помещенных в ультратермостат, Оптическую плотность измеряли в пробирках на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 мм. В качестве контроля на автолиз брали ту же суспензию клеток испытуемых микроорганизмов и буфер вместо фермента. Коэффициент уменьшения мутности рассчитывается по формуле (в %): реакционной смеси с ферментом через время 1

По отношению к клеткам грамположительных бактерий действие препарата литических ферментов Micromonospora vulgaris PA-11-4 было менее эффек1ивным: за 30 мин — 1 час степень их лизиса составляла 20 — 40% и не увеличивалась при более продолжительном времени инкуба ции.

Еще большая устойчивость к лизису наблюдалась у организмов рода Mycobacterium, Brevibacterium u Corynebacterium. Исключение составляла культура Mycococcus lactis, выраженная на среде с н-парафинами, лиофильно-высушенные клетки которой лизировались на 94% при пятнадцатиминутной инкубации с ферментным препаратом в концентрации 0,01%, а живые клетки — на 50% через 1 час.

Из дрожжей были испытаны Candida tropicalis и С. guilliermondii, выращенные в средах с углеводородами. Степень лизиса мертвых клеток дрожжей составляла 50 — 60% при инкубации с ферментным препаратом в течение

1 час, а живых — 3 час.

407045

Коэффициент уменьшения оптической плотности

ОД, %

Конечная концентрация ферментного препарата, %

Время инкубации, Испытуемый организм мин

Ба к те ри и г р амотр и ца тельные

Escherlchia со11 125 мертвые клетки живые клетки

0,002

0,01

Proteus vulgaris 127 мертвые клетки живые клетки

0,01

0,025

Pseudomonas fluorescens 540 мертвые клетки живые клетки

0,01

0,025

100

Aегоbacter с1оасеа А — 30 живые клетки

0,01

100

Aегоbacter aегоgenes 906 мертвые клетки живые клетки

96,5

72,5

0,01

0,025

120

Serratia marcescens живые клетки

0,01

56,0

Vibriocosticolus живые клетки

62,9

0,025

Alcalfgenes sp. живые клетки

52,0

0,01

Hldrogenomonas rullandli живые клетки

0,025

94,6

Hidrogenomonas sp, 17549АТСС живые клетки мертвые клетки

Hidrogenomonas eutropha живые клетки

0,025

0,025

65,2

22,4

240

41,4

120

0,1

Hidrogenomonas sp. 17716АТСС живые клетки

0,025

100

120

Б а к т е р и и г р а м положи т е л ь н ы е

Mlctococcus I vsodefktfcus 109 мертвые клетки живые клетки

50,8

40,6

0,01

0,025

120

Micrococcus denftifffcans живые клетки

0,025

50,0

240

Sarcina lutea 486 мертвые клетки

Staphylococcus aureus мертвые клетки

Bacillus megaterium 512 мертвые клетки

Вас. subillls 428 мертвые клетки

Вас. cereus 370 мертвые клетки

Вас. brevis 224 (термофильный штамм) живые клетки

44,0

0,01

20,3

0,01

28,8

0,01

0,01

18,9

20,0

0,01

0,025

40,0

Arthrobacter cftreus 654 мертвые клетки живые клетки

0,025

0,025

74,1

54,5

120

Другие и икроорганизмы

Mvcococcus factis 41 мертвые клетки живые клетки

94,0

50,0

0,01

0,01

Спектр действия литических ферментов термофильного актиномицета

Micrornonospora Vulgaris PA-11-4

40794о

Продолжение

Кон.чная концентрация ферментного препарата, %

Коэффициент уменьшения оптической плотности

Од, %

Время инкубацип, Испытусмьш организм мин

0,01

44,4

0,01

16,5

0,01

6,3

0,01

12,7

0,01

7,5

0,01

0,025

50,9

65,6

1с".0

Сап 1Ыа guilllermondti НП » и s JJu с кл т!»и живые клетки

0,01

0,025

61,6

66,6

180

AspergIllua terrcus 17 P (термофильиый штамм) живые клетки

0,025

180

36,2

Предмет изобретения

Составитель Г. Субботина

Редактор 3. Твердохлебова Техред 3. Тараненко Корректор Л. Новожилова

Заказ 1050 8 Изд № 329

LIHHHHH Государственного комитета по делам изобретений и

Москва, OK-35, Раушская

Тираж 647 Подписное

Совета Мипистров СССР открытий наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Мусососсп- luteua 650 мертвые клетки

lIycobacterIum album 88 мертвые клетки

МусоЬас;erium phlct 648 мертвые клетки

Сог, nebacterium тн.higanen=e мертвые клетки

BrcvIbactcrium ammonIagene 677 мертвые клетки

CandIda 1гор1са11з Т вЂ” 20 мертвые клетки живые клетки

1. Способ получения литических ферментов путем выращивания их продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода и азота в присутствии минеральных солей с последующим выделением ферментов из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения активности ферментов, в качестве продуцента используют микроорганизмы рода Micromonospora.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из рода Micromonospora используют микроорганизм вида vtt1gаиs.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что в качестве продуцента из.вида используют штамм Micromonospora vulgaris PA-11-4.

4. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся тем, что в качестве источника углерода и азота для данного штамма используют кукурузную

10 муку с добавлением к ней сухих кормовых дрожжей.