Патент ссср 413189

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

4I3I89

Союз Советских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт, свидетельства №

М. Кл. С 12d 13/10

Заявлено 18.Ч.1972 (№ 1785769/28-13) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 30.1,1974. Бюллетень № 4

Дата опубликования описания 28Л .1974

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

УДК 577 15 08(088 8) Авторы изобретения Р. В. Фениксова, Н. А, Тиунова, Д. А. Пириева и В. Д. Кузнецов

Ордена Ленина институт биохимии им. А. Н. Баха

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИТИНАЗЫ

Известен способ получения хитиназы путем культивирования ее продуцентов на водной питательной среде, содержащей источник углерода с последующим выделением хитиназы из культур ал ьно и жидкости.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход хитиназы.

Для этого в качестве продуцентов используют вид Actinomgces Kurssanovii:

Из вида Actinomyces /(urssanovii используют штамм 93.

В качестве источника углерода можно использовать деминерализованный панцирь крабов.

Выращивание указанного штамма можно осуществлять на водной питательной среде, содержащей 1 — 3% деминерализованного панциря крабов, 0,1 — 0,5% пептона или казеинового гидролизата, 2 — 5% однозамещенного фофсфата калия и 0,5% сернокислого магния.

Пример. Панцирь заливают 4 — 5%-ным раствором соляной кислоты в соотношении

1: 4, Смесь оставляют на 24 час при 4—

25 С. Деминерализованный панцирь промывают водой до нейтральной реакции и в измельченном виде используют в качестве источника углерода прп культивировании продуцента хитин азы.

Для культивирования микроорганизмов в ферментерах выращивают посевной материал в колбах емкостью 750 мл на качалке (150—

200 об/мин) в течение 3 суток при 27 — 28 С.

5 Посевной материал вносят в среду в количестве 1 — 4% от общего объема среды, содержащей следующие компоненты, %:

Деминерализованный панцирь крабов 3

10 Пептон 0,2

К,НР04 3

Мдяо, 0,5.

Среду. для культивирования актиномицета

15 стерилизуют при 1 атм в течение 1 час, при этом рН после стерилизации равен 7,0 — 7,5.

Температура культивирования 27 — 28 С.

Аэрация при выращивании в ферментерах

0,5 — 2 объема воздуха на 1 объем среды в

20 1 мин. Скорость вращения мешалки 200—

400 об/мин. Длительность культивирования

2,5 — 4,0 суток.

Сухой препарат хитиназы получают путем осаждения фермента из культуральной жид25 кости четырьмя объемами этилового спирта, тремя объемами ацетона или сернокислым аммонисм при полном насыщении.

Менее очищенный технический препарат можно получить высушиванием фильтрата

30 культуры на распылительной сушке.

413189

15

25

Предмет изобретения

Составитель Б. Дунье

Редактор Л. Ксенофонтова Техред 3. Тараненко Корректор Н. Учакина

Заказ 1157/10 Изд. № 1205 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Культуральная жидкость, полученная после отделения мицелия, способна расщеплять неизмененный нативный хитин, выделенный в виде очищенного соединения из животных объектов и грибов, а::также хитин, содержащийся непосредственно в панцирях ракообразных и скелетах насекомых (расщепление коллоидного хитина, регинированного из растворов в концентрированных кислотах, тем более не представляет больших трудностей и протекает значительно быстрее). При этом преобладающим продуктом ферментативного гидролиза является N-ацетилглюкозамин. Активность

1 мл фильтрата культуральной жидкости предлагаемого штамма (продуцента хитиназы) 18 — 22 ед.

Деминерализованный панцирь крабов, предварительно измельченный в шаровой мельнице, можно расщепить на 32% до N-ацетилглюкозамина за 3 суток при 40 С под действием культуральной жидкости актиномицета А.

Концентрация панциря составляет 5, следовательно, 56о/о хитина, содержащегося в деминерализованном панцире, превращается в

N-ацетилглюкозамин.

Вместо культуральной жидкости в качестве фермента может быть применен раствор сухого препарата хитиназы.

Культурально-морфологическая характеристика Actiuomyces Kurssanovii 93.

На синтетических средах (Чапек-агар, сахарозо-нитратный агар) колонии темно-оранжевые, среды окрашиваются в желтый цвет. Воздушный мицелий темно-серый. На картофельных пластинах колонии оранжевые, буро-оранжевые, бурые. Среда не окрашена. Воздушный мицелий розовато-серый.

На синтетической среде CP 1 с глюкозой воздушный мицелий телесно-розовый (05) (обозначения окраски даны по «шкале цветов»

Бондарцева, 1954) мучнистый, субстратный ржавый (Ж 1), пигмент буланый (Ж 1).

На среде Ваксмана воздушный мицелий мучнистый, темно-инкарнатный (В 5), субстратный буланый (К 1), пигмента нет.

На овсяной среде воздушный мицелий мучнистый, бледно-сероватый (А 6), субстратный рыжеватый (Ж 2), пигмент кожано-бурый (Ж 2).

На гороховом агаре воздушный мицелий белый (Д 3), мучнистый, субстратный бистровый (К 7), пигмент темно-коричневый (Л 5).

На среде Гаузе 2 воздушный мицелий не образуется. Субстратный мицелий темно-коричневый (Л 5), пигмент темно-коричневый (Л 5).

На кукурузной среде М 2 воздушный мицелий не образуется, субстратный мицелий бистровый (К 7), пигмент сигарный (Д 7), Спороносцы короткие образуют петли и крючки. Споры цилиндрические с гладкой оболочкой.

Физиолого-биохимические свойства штамма

75. Штамм гидролизует крахмал, образует меланоидный пигмент. Использует в качестве единственных источников углерода глюкозу, сахарозу, ксилозу, фруктозу, Не использует арабинозу, рамнозу, инозит, маннит. Желатину окрашивает в светло-оливковый цвет, разжижает ее. Молоко пептонизирует без коагуляции. На клетчатке растет слабо. Нитраты восстанавливает слабо.

1. Способ получения хитиназы путем культивирования ее продуцентов на водной питательной среде, содержащей источник углерода, с последующим выделением хитиназы из культуральной жидкости, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода хитиназы, в качестве продуцентов используют вид

Actinomvces Kurssanovii.

2. Способ по п. 1, отл и ч а ю щи и с я тем, что из вида Actinomyces Kurssanovii используют штамм 93.

3. Способ по пп, 1 — 2, отличающийся тем, что в качестве источника углерода используют деминерализованный панцирь крабов.

4. Способ по пп. 1 — 3, отличающийся тем, что выращивание указанного штамма осуществляют на водной питательной среде, содержащей 1 — 3 /о деминерализованного панциря крабов, 0,1 — 0,5% пептона или казеинового гидролизата, 2 — 5 /о однозамещенного фосфата калия и 0,5 /о сернокислого магния.