Штамм trichoderma vir1de ген-к9-10-продуцент целлюлолитических ферментов1

 

О П И С А Н И Е 399522

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Сометских

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №.Ч. Кл. С 12d li3/10

Заявлено ЗО.Х11.1971 (№ 1731155j28-13) с присоединением заявки ¹

Приоритет

Опубликовано 03.Х.1973. Бюллетень ¹ 39

Дата опубликования описання 28.П.1974

Госудерстееннмй камнтет

Совета Мнннстрав СССР ео делам нзооретеннй

И OTKPblTHH

УДК 577.15.07(088.8) Авторы изобретения

Ъ

Е. С, Морозов, С. И. Алиханян и Г. А. Тренина

Заявитель

Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

ШТАММ TRICHODERMA VIRIDE ГЕН-К9-10-ПРОДУЦЕНТ

ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ

20

Изобретение относится к области микробиологии, а более точно — к штамму Trichoderma viride Ген-К9-10-продуценту целлюлолитических ферментов.

Целлюлолитические ферменты осуществляют энзиматический гидролиз целлюлозосодержащих растительных субстратов. Конечным продуктом гидролиза является глюкоза.

Препараты целлюлолитических ферментов, получаемые путем микробиологического синтеза, используются для переработки отходов сельского хозяйства, в пищевой промышленности, в фармакологии, и наиболее широко— в животноводстве для улучшения качеств грубых растительных кормов и трудносилосуемых трав.

Предлагается штамм культуры Trichoderma viride Ген-К9-10-мутант, полученный в результате применения мутагенного фактора

N-метил-Л -нитро-N-нитрозогуанидпна с последующим ступенчатым отбором активного варианта.

Новый штамм выведен из штамма № 1 культуры Trichoderma viride.

Штамм Ген-К9-10 (в лабораторных условиях) на седьмые сутки роста на жидкой питательной среде со свекловичным жомом в качестве источника углерода имеет следующее среднее превышение в активности ферментов на разных субстратах, %:

На обезжиренном хлопке 40 — 50

На смешанных древесных опилках 30 — 40

На фильтровальной бумаге 80 — 90

На натрий-карбоксиметилцеллюлозе (определение по глюкозе) 25 — 35

1-1а натрий-карбоксиметилцеллюлозе (определение по изменению вязкости раствора) 50 — 55

Прн проведении ферментацин на той же среде в фсрментерах опытной установки, на шестыс-седьмые сутки роста штамм Ген-К9-10

15 имеет следу|ощее превышение в активности фсрмсптов на разных субстрактах по сравнению со штаммом № 1, о о:

На обезжиренном хлопке 30 — 40

На натрий-карбоксиметилцеллюлозе (определение по изменению вязкости раствора) 35 — 40

Содержание растворимого белка в фильт. рах культур, выращенных в лабораторных

25 условиях в течение семи суток на жидкой питательной среде со свекловичным жомом в качестве источника углерода, составляет,,я:/лл:

Штамм Ген-К9-10 зо Ш . №

399522

Характеристика культурно-морфологических признаков штамма Trichoderma "irid с

Ген-К9-10 в сравнении с исходным штаммом Trichodårtkè viride ¹ i

Табли ца 1

Ген-К9-10

Среды

Синтетическая среда Чапека

Рост 7 суток

T 28 С

Посев уколом

Синтетическая

Рост 12 суток

Т 28 С

Посев уколом среда с крахмалом

Сусло-агар

Рост 4 суток

Т 28 С

Посев уколом среда по прописи с добавлением 1;, экстракта

Ломтики картофеля

Рост 30 суток

T 28 С

Посев штрихом

Разжижения не наблюдается вплоть до 30 суток инкубации

Послойное разжижение наблюдается к 6 — 7-му- дню инкубации.

Желатина

Рост 30 суток

Т 28 С

Посев уколом

Молоко пеитоиизирует медленно рН среды 7,7 — 7,8

Молоко (не агаризованное, рН 6,3)

Рост 30 суток

Т 28 С

Посев суспензией спор

Молоко пептонизирует быстро рН среды не меняется

Слабое восстановление наблюдается к 30-ым суткам нкубации

Восстановление наблюдается к

10-му дню инкубацип

Нитраты

Рост 30 суток

Т 28 С

Посев суспензией спор

1(рахмал гидролизует интенсивно.

Крахмал гидролизует слабо.

Крахмал

Рост 10 суток

Т 28 С

Посев суспензией спор

П р и и е ч а н и е. На жидких средах с различными источниками углерода, (глюкозой„галактозой, лактозой, мальтозой. ксилозой, маннозой, рамнозой, сахарозой и глицерино») существенных различий в характере роста ие наблюдается.

Органическая

Роулен-Тома кукурузного

Рост 4 суток

Т 28=С

Посев уколом

1. Колония занимает всю поверхность чашки.

2. Воздушный мицелий тонкий, стелющийся, бесцветный

3, Конидий в желтых подушечках, расположенных компактно в центре колонии и редко по периферии.

4. Среда не окрашена, 1. Диаметр колонии 65 .и,и.

2. Воздушный мицслий ползучий, едва заметный, бесцветный.

3. Конидий не образуется.

4. Среда не окрашена.

1. 1(отония занимает всю поверхность чашки.

2. Воздушный мицелий белый, войлочный, хорошо развит по всей поверхности колонии.

3 Конидии в желтых или беловатых подушечках, расположенных по всей поверхности колонии.

4. Среда окрашена в светло-желтый цвет.

1, Колония занимает всю поверхность чашки.

2. Воздушный мицелий бесцветный, тонкий, распростертый.

3. Конидии в беловато-зеленых подушечках, расположены в центре колонии и редко по периферии.

4. Среда не окрашена.

1. Рост ограничен только по штриху.

2. Воздушный мицглий развит хорошо, бесцветный.

3. Конидии в зеленых подушечках

4. Субстрат не окрашен.

1. Диаметр колонi и 90 .и.ll.

2. Воздушиь.й ми цели Й тонк и й, слегка ириподнимающиися, бесцветный, 3. !(оиидии в виде зеленых подушечек, расположенных в центре.

4, Среда окрашена в яркий зеленовато-желтый цвет.

1. Диаметр колонии 34 льи.

2. Воздушный мицелий иаутинообразный, прииолиим ющийся, бесцветньш

3. Кон; дии в виде редких зеленых подушечек в месте укола.

4. Среда це окрашена.

1 диаметр котоиии 70 иst

2. Воздушнгяй мицелий бесцветный, прижатый, с хорошо выраженными концентрическими окружностями.

3. Конидий Нс образуется.

4. Среда окрашсна в желтый цвет.

1, Ко10Hllkt занимает почти всю поверхность чашки.

2. Воздушньш мице:Itllt бесцветный, тонкий. Хорошо выражена радиальная исчерченность.

3. Конидий не ооразуется.

4. Среда не окрашена, 1, Рост очень интенсивный, захватывает всю поверхность ломтика.

2. Воздушный мицелий пушистый, желтый.

3. Конидиеобразование обильное.

4. Субстрат интенсивно окрашен в ярко-желтый цвет.

399522

Характеристика цитологических особенностей штамма Trichoderma viride Ген-К9-10 в сравнении с исходным штаммом Тг1сЬoderma viride ¹ 1 на синтетической среде Чапека

)ча

Ген-К9-10

СоС1> 6НяО

20Моз 2НаРО4 48Н О

;или (NH4) а 4Н О . /Мот0 4

20 рН 40 — 42

0,5

10,0

10,0

1,0

0,8

0,5

Сравнение уровней биосинтеза целлюлолитических ферментов штаммом Trichoderma игЫе Ген-К9-10 и штам ом Trichoderma viride № 1

Таблица 2

Активность

Количество повторных проверок ш т а м м kk

Суостраты отношение

Ген-К9-10 к№1

Измерение активности № 1 Ген-К9-10

В лабораторных условиях

Обезжиренный хлопок

Смешанные древесные опилки

Фильтровальная бумага

Натрий-карбоксиметплцеллюлоза

Натрий-карбоксиметилцеллюлоза

Растворимый белок

Глюкоза л/г/л/,г

Глюкоза мг л/л

Глюкоза, л/г мл

Глюкоза, л/г/мл

11,44

12,92

1,54

17,08

7,97

9,64

0,83

13,23

1,44

1,34

1,86

1,29

Изменение вязкости раствора

Определение по методу

Лоури, .иг/л/л

31, 41

1,53

20,60

8,56

1,54

0,18 рН культуральной жидкости на 7-е сутки роста

5,9 — 6,1

3,4 — 3,6

В условиях опытной остановки

Обезжпренньш хлопок

Натрий-карбоксиметилцеллюлоза

Глюкоза, л/г/л/л

Изменение вязкости раствора

11,84

20,25

8,70

14,72

1,36

1,38

1. Набухание конидий через 8 — 10 час инкубацип.

2. Прорастание конидпй через 16 час инкуоацип, как правило, с одного конца, редко с двух.

3. Гифы длинные, волокнистые, слегка разветвленные, окрашены интенсивно.

4. Конидпеносцы формируются к 49 час инкубапии, нет в и с ты е.

5. Зрелые коиидпи появляются через 96 час инкубацпи. Конпдиеобразование сильное.

6. Конпдип крупные, овальнь;е, окрашены в синий цвет с ярким красным ядром.

7. Лпзис культуры наблюдается через 144 час инкубацип.

Штамм Ген-К9-10 хранят в виде лиофильно высушеншях конидий культуры в стеклянных ампулах.

Питательные среды для выращивания посевного материала и ферментапии штамма

Tri chod erma vi ride Ген-К9-10.

Среда для выращивания посевн о г о м а т е р и а л а. Лгаризованная среда по прописи Роулен-Тома с добавлением 1% кукурузного экстракта.

Среда для фермептации, %;

Свеклови /ный жом 4,0 (NH<) zSO4 0,14

КН.РО4 0,1

Мр5О., 0,03

СаС1з 0,03

Мочевина 0,3

Микроэлементы, лг/л среды;

FeSO 7НяО

ZnC1

МпSO4. -I O

1. Набухание конидий через 4 — 6 час инкубации.

2. Прорастание конидий через 8 — 10 час инкубации, как правило, с двух концов, иногда с трех.

3. Гпфы длинные и короткие, сильно искривленные, ветвистые, окрашены интенсивно.

4. Конпдиеносцы формируются к 24 час инкубации, сильно ветвистые.

5. Зрелые конидии появляются к 30 час инкубации.

Конпдиеобразование менее обильное, чем у штамма №

6. Конидпп меньшего размера, чем у штамма № 1.

Форма и окраска те же.

7, Лизис культуры наблюдается через 72 час инку15 бацпи.

Выращивание посевного материала и условия ферментации.

Культуру штамма Trichoderrri/2 viride ГенК9-10 выращивают четверо суток при 28 С на скошенном агаре (по прописи Роулен-Тома с добавлением 1% кукурузного экстракта). Посевным материалом служит водная суспензия конидий культуры, выращенной на агаризо30 ванной среде. Количество инокулята 5 — 10% от объема засеваемой среды.

Ферментацию проводят в колбах Эрленмейера емкостью 250 лл. Объем среды 50 мл.

Инкубапия 7 суток при 28 С на качалках, 35 вращающихся со скоростью 220 — 250 оборотов в лшн.

399522

Таблица 3

Использованные методы количественного определения содержания целлюлоз в фильтратах культуральной и>идкостн

Условия пнкубацпи

Методы определения активности

Един:)цы выражения активности

Состав реакционных смесей время темпера тура, С

Калориметрический метод определения количества Itz редукцирующпх сахаров по методу Сомоджп-Нельсона в модификации Родионовой

25 мг

0,5 л1л

Кол:.)÷åñòBî глюкозы, Atz > образующейся при, действии на субстрат 1 мл неразведенного фильтрата культуральной жидкости

96 час 50

2.5 мл

50 л1г

1,0 л л

1,0 ли

24 час 50

10 л1г

2,0 мл

0,5 мл

1 час

1 час

2,5 мл

0.5 мл

Впскозометрический метод определения изменения вязкости раствора натрий-карбоксиметилцеллюлозы

Изменение обратной величины относительной вязкости раствора за 1 лшн при действии 1 мл неразведенного фильтрата культуральной жидкости

5,0 мл

О, 2, 4, 6 мин

0,5 мл

0,5 мл

Предмет из о бр етения

В условиях опытной установки ферме»таци1о осуществляют в ферментсрах емкостью

20 л. Объем среды 10 л. В качестве пеногасителя,используют кашалотовый жир

1. Обезжиренный хлопок

Ацетатный буфер 0,1 моль, рН 5,0

Фильтрат культуральной жидкости в соответствую щем разведении

2. Смешанные древесные опилки

Натрий-цитратный буфер

0,05 люоль, рН 4,8

Фильтрат культуральной жидкости в соответствующем разведении

3. Размельченная фильтровальная бумага (фпльтрат № 3)

Ацетатный буфер 0,1 моль, РН 4,7

Фильтрат культуральной жидкости в соответствующем разведении

4. Раствор натрий-карбокспметилцеллюлозы (степень полимеризации 350, степень замещения 55), приготовленный на ацетатном буфере 0,05 моль, рН 4,5.

Концентрация 0,3), Фнльтрат культуральной жидкости в соответствуЮщим разведении

5. Раствор натрий-карбоксиметил целл юлозы (данные те же, что в и. 4), приготовленный на дистиллированной воде

Ацетатный буфер 1 моль, рН 5,6

Фильтрат культуральной жидкости в соответствукицем разведении

Штамм Trichodermtt. игЫе Ге)1-К9-10-продуцент целл)ололитическпх фсрAII IITI): Культурально-морфологические»риз»аки.

Синтетическая среда Чапека. Посев уколом. Через 7 суток роста при 28 С диаметр колоний 90 л1л1. Воздушный мицелий тонкий, слегка приподнятый, бесцветный. Ко»идий в виде зеленых подушечек, располо?кс»»ых в центре. Среда окрашивается "". яркий зеленовато-желтый цвет, Синтетическая среда с крахмалом. Посев уколом. Черсз 12 суток роста пр» 28 С»laметр колонии 34 л1л, В месте укола образу(0,4 o<).,p ) . Объем подаваемого воздуха

1: 1 в 1ин. Псремсшива»ие со скорость)о 700 оборотов в лип. Продолжитсль»ость ферMåíтапии 7 суток. Температура и»кубации 28 С. ются конидий в виде редких зеленых подушечск. Среда»с окрашивается.

Сусло-агар. Черсз четверо суток роста при

28 С д»амстр коло»ий 70 л1м. Воздушный ми»слий бес»вот»ый, прижатый, с хорошо выр гl ?к Г»» 1>l ч» к оп и с» T p I I ч ес к и м и окружностями.

Ко»»дии»с образуются. Среда окрашивается в желтый цвет.

Орга»»ческая среда Роулен-Тома с добав:tell»eu. 1 jp кУкУРУзного экстРакта. Конидий ло Обрапс»T. СрЕда»e ИЗМЕНяЕт цВЕта.

15 ".îìòèêè картофеля. Посев штрихом. Через 30 суток выращивания при 28 С колония з;:,.р гва.т всю»оверх»ость ломтика, Воздушки", . ми»слий пушисты11> желтый. Конидиеоб399522

Корректор Е. Миронова

Техред Т Ускова

Редактор О. Стенина

Заказ 800/7 Изд. № 70 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 разование обильное. Субстрат интенсивно окрашен в ярко-желтый цвет.

Желатину не разжижает (через 30 суток инкубирования).

Молоко пептонизирует медленно. рН среды 7,7 — 7,8.

Нитраты восстанавливают к 30 суткам инкубации.

Крахмал гидролизует интенсивно, Отношение к источникам углерода. Глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу, ксилозу, маннозу, рамнозу, сахарозу, глицерин ассимилирует.

Цитологические особенности штамма на синтетической среде Чапека. Набухание конидий происходит через 4 — 6 час инкубации, прорастание через 8 — 10 час инкубации, чаще с двух концов, иногда — с трех.

10 Гифы длинные и короткие, сильно искривленные, ветвистые, интенсивно окрашенные.

Конидиеносцы формируются к 24 час инкубации, ветвистые.

Зрелые конидии образуются к 30 час ин15 кубации.

Лизис культуры через 72 час инкубации.