Способ получения стимулятора иммуногенеза

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ () t) 47)70!

Сок)э Советских

Социалистических

Ресл1блик (61) Зависимый от патента (51) М. Кл. А 61b 27/00 (22) Заявлено 17.11.72 (21) 1862905/31-16 (32) Приоритет 19.11.71 (31) 7141610 (33) Франция

Опубликовано 25.05.75. Бюллетень № 19

Государственный комитет

Совета Министров СССР (53) УДК 576.8.097 (088,8) оо делам иэооретений и открытий

Дата опубликования описания 03.09.75 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Арлетт Адам, Франк Милан Бержер, Луи Шедэд, Эдгар Ледере и жан Франсуа Пти (Франция) Иностранная фирма

«Ажанс Насьональ де Валоризасьон де Ля Решерш» (Франция) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА ИММУНОГЕНЕЗА

Изобретение относится к области медицины и касается стимуляторов иммуногенеза.

Известен способ получения стимулятора иммуногенеза путем гомогенизации микроорганизмов типа Mycobacteria или .Хосагйа и обработки гомогената органическими растворителями.

Целью изобретения является снижение токсичпости препарата.

Для достижения поставленной цели гомогенат перед делипидизацией обрабатывают протеолитическими ферментами, лиофилизируют, обрабатывают ацетатом аммония, повторно подвергают обработке протеолитическими ферментами и лиофилизации, а затем растворяют в воде и фракционируют, например, с использованием сефадекса G — 50.

Пример 1. Штамм Mycobacterium

smegmatis, культивируют в склянках Рюкса на среде Саутона в течение 12 дней, при 37 С, отфильтровывают, промывают дистиллированной водой и до непосредственного использования выдерживают при 20 С.

100 г клеток суспензируют в 500 мл дистиллированной воды путем смешивания при низких температурах в смесителе Уаринга, который предварительно охлаждают до тех пор, пока суспензия не становится гомогенной. 3атем эти клетки расщепляют в предварительно охлаждаемом французском прессовом устройстве, работающем в условиях комнатной тем5 пературы при давлении 420 кг/см . После первоначального прохождения через прессовое устройство добавляют 1 мг D(X A-зы для снижения вязкости, и затем эту суспензию вторично пропускают через то же устройство.

10 Кроме расщепления клеток путем воздействия механического давления, они могут быть расщеплены также звуковым колебанием 30 мл суспензии в течение 25 мин в звуковом осцилляторе, предварительно охлажденном и рабо15 тающем с частотой колебаний 70 кгц/сек, а также замораживанием оттаиванием при обработке их цеолитом, встряхиванием их вместе со стеклянными шариками или обычными средствами, используемыми для расщепле20 ния микробных клеток.

Получаемую в результате суспензию центрифугируют три раза в течение 15 мин в количестве 800 г в охлаждаемой центрифуге.

Шарики, состоящие из нерасщепленных кле25 ток, удаляют. Получаемую всплывшую на поверхность жидкость центр и фуги р уют в течение 1 час в количестве 27500 г. Шарики из

47170 1

Предмет изобретения

Составитель С. Щенева

Техред 3. Тараненко

Корректор Л. Котова

Редактор Д. Пинчук

Заказ 2098!16 Изд. М 747 Тираж 559 Иод гисное

Ц11ИИГ1И Государственного когиитета Совета Министров СССР по дела:я изобретений и открытий

Москва, 7К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 всщества стенки клеток превращают в суспензию 750 мл буферного раствора фосфата натрия (0,066 М; рН 7,8), в которую добавляют 125 мл трипсина, 125 мл химотрипсина и небольшое количество антисептического агента (например, толуол), чтобы предогвратить какое-либо бактериальное загрязнение. Этот продукт выдерживают в инкубаторе в течение ночи при обычной комнатной температуре с помощью магнитной мешалки, и после этого смесь центрифугируют 1 час. Шарики, состоящие из вещества стенки клеток, промывают, помещая их снова в суспензию, центрифугируя три раза вместе с холодным буферным раствором фосфата и три раза вместе с холодной дистиллированной водой.

Далее вещество стенки клеток делипидируют при обычной комнатной температуре с помощью нейтральных растворителей. С этой целью материал помещают в суспецзию примерно в 30 объемов растворителя, который может воздействовать примерно в течение одного дня при перемешивании, Вещество стенки клетки, таким образом, делипидируют три раза ацетоном, три раза этанолом-эфиром (1: 1), три раза хлороформом и три раза хлороформом-метанолом (2: 1), затем это вещество высушивают с помощью ацетона. Делипидированное и высушенное вещество степки клетки до его непосредственного использования можно выдерживать при комнатной температуре.

100 г делипидированного вещества стенки клетки суспензируют в 250 мл 0,1 М-ного раствора ацетата аммония, с рН 6,2 и выдерживают эту суспензию в течение ночи в холодном состоянии, добавляя несколько капель толуола. Вещество фильтруют, используя фильтр из сплавленного стекла, промывают этанолом и хлороформом. Промытый материал помещают снова в суспензию в 150 мл ацетата аммония (0,1 М; рН 6,2), к которому добавлено 12 мг лизозима и несколько капель толуола; этот продукт выдерживают в течение ночи в инкубаторе при 37 С и перемешнвании. После фильтрации с помощью сплавленного стекла остаток обрабатывают еще раз лизозимом в тех же условиях, что и первоначально.

5 Ооа фильтрата смешивают, лиофилизируют, снова растворяют в воде и лиофилизируют до удаления ацетата аммония. Выход: примерно

90 мг сырого растворимого в воде продукта на 1 г высушенного делинидированного ве10 щества стенки клетки.

Растворимый в воде сырой продукт (500 мг) фильтруют через колонку, наполненную Sephadex G-50 (высота колонки 80 см, диаметр 2,5 см) в равновесии с 0,1 Х-ной ук15 сусной кислотой.

Первый пик выходящего из колонки продукта, хорошо отделенного от оставшегося продукта, содержит рассматриваемый в данном описании агент в чистом виде (150 мг).

20 Фильтрация через колонку, наполненную

Sephadex G-75, приводит к более размытому пику выхода, включающему плечо.

Этот пик выхода продукта содержит две фракции одинакового состава, различающиеся

25 лишь по молекулярному весу.

Франкции, соответствующие второму пику выхода продукта при фильтрации через колонку, наполненную Sephadex G-50 содержат вещества с более низким молекулярным ве30 сом.

Способ получения стимулятора иммуногене35 за путем гомогенизации микроорганизмов типа Mycobacteria или Nocardia и делипидизацпи гомогената, отличающийся тем, что, с целью снижения токсичности препарата, гомогенат перед делипидизацией обрабатыва40 ют протеолитическими ферментами, лиофилизнруют, обрабатывают ацетатом аммония, повторно подвергают обработке протеолитическими ферментами и лиофилизации, а затем растворяют в воде и фракционируют, напри55 мер, с использованием сефадекса G-50.