Способ выделения синтетических нуклеозидмонофосфатов
<)505640
Союз Советских
Социалистических
Реслублин
ОЛИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕН ИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 29.04.74 (21) 2019338/23-4 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (51) М.Кл С 07 D 239/00
Государственный комитет
Совета Министров СССР ло делан изобретений, н открытий (43) Опубликовано 05.03.76. Бюллетень № 9 (53) УД К 547.657.7.02 (088.8) (45) Дата опубликования описания 14.06.76 (72) Авторы изобретения
И. М. Кошкина, Л. А. Ремизова и И. А. Фаворская (71) Заявитель Ленинградский ордена Ленина и ордена Трудового Красного
Знамени государственный университет им. А. А. Жданова (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СИНТЕТИЧЕСКИХ
НУКЛ ЕОЗИДМОНОФОСФАТОВ
Изобретение относится к способу разделения и очистки нуклеотидов, в частности к способу выделения синтетических нуклеозидмонофосфатов (НМФ), позволяющему быстро получить препаративные количества НМФ, необходимых для проведения медико-биологических исследований.
Известный способ выделения НМФ ионообменной хроматографией на сефадексе довольн о сложен.
С целью упрощения процесса предлагается синтетические препараты НМФ с высоким содержанием минеральных солей делить на катионообменниках на основе сефадекса в Н+форме, проводя элюирование дистиллированной водой.
Обычно используют SE- или СМ-сефадекс
С-25 при соотношении 140 — 150 мг разделяемой смеси на 80 — 100 г сефадекса.
Разделяемая смесь может содержать максимум 28 — 30% НМФ, 4 — l5% одинакового по гетерооснованию нуклеозидфосфата и 68—
80% минеральных солей (хлоридав и фосфатов) .
Предлагаемым способом при общей загрузке 100 — 140 мг за 3 — 5 час можно выделить в чистом виде 30 40 мг целеваго,продукта в виде водного раствора, не содержащего минеральных солей.
Пример. Очистка синтетического препарата дезоксицитидинмонофосфата (ДЦМФ).
ДЦМФ, полученный фосфорилированием дезоксицитидина 4-кратным избытком хлорокиси фосфора, по дакным тонкослойной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе (0,6—
0,8 мэкв/г) в системе 0,02 н. соляная кислота содержит 17% ДЦМФ, 4% дезоксицитидиндифосфата (ДЦДФ) и 79% минеральных солей (хлориды и фосфаты).
Очистку проводят íà SE-сефадексе в Н+форме на колонке 63ХЗ см, элюируя водой при скорости 3 мл/мин и объеме фракции
3,6 мл.
Навеску (140 мг) ДЦМФ растворяют в
2 мл дистиллированной воды, наносят на колонку, промывают поверхность геля 2Х1 мл воды, заполняют колонку растворителем и начинают элюирование. Сначала собирают 240—
250 мл элюата, содержащего ДЦДФ и минеральные соли. С фракции, имеющей оптическую плотность 0,500 (по спектрофотометру), начинают собирать ДЦМФ. Когда оптическая плотность раствора, пройдя через бесконечность, снизится до 0,500, сбор элюата, содержащего ДЦМФ, заканчивают. Общий объем элюата, содержащего ДЦМФ, составляет
170 мл. Время разделения (от момента загрузки колонки) 3 час. Собранный элюат обрабатывают раствором аммиака до слабощелочной з0 реакции, упаривают в ротационном испарите505640
Таблица 1 ле при 10 — 15 С/5 — б лм и сушат остаток в вакуум-эксикаторе над Р20з. Вес сухого остатка 23,8 лг, Содержание в проое, /, Количество пробы, наносимой на колонку, мг нуклеозид- минеральных
| . дпфосфата солеи (Очищаемый
5 НМФ
Количественное определение выделенного
ДЦМФ проводят на спектрофотометре СФ-4А.
В аналогичных условиях очищают цитидинмонофосфат (ЦМФ), аденозинмонофосфат (АМФ) и гуанозинмонофосфат (ГМФ). Состав смеси, наносимый на колонку, приведен в табл. 1.,8, 1, 1
Спектрофотометрические характеристики выделенных НМФ, приведены в табл. 2.
Таблица 2
Концентрация раствора рн
Выделенный
НМФ
7 макс, г нм г250/г260 г280/г260
С 10 —, моль
Формула изобретения на катионообменниках на основе сефадекса в
Н+-форме, проводя элюирование дистиллированной водой.
1. Способ выделения синтетических нуклеозидмонофосфатов ионообменной хроматографией на сефадексе, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, синтетические препараты .нуклеозидмонофосфатов с высоким содержанием минеральных солей делят
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют SE- или СМ-сефадекс
С-25 при соотношении 140 — 150 л г разделяемой смеси .на 80 — ll00 г сефадекса.
Составитель А. Кост
Техред А. Камышникова
Редактор T. Шарганова
Корректор В. Гутман
Заказ 563/815 Изд. № 257 Тираж 576 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий
Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Тип. Харьк. фил. пред. сПатент
ДЦМФ
ЦМФ
АМФ
ГМФ
560
ДЦМФ
ЦМФ
10 АМФ
ГМФ
12200
257
256
140,0
96,3
101,8
109,7
0,45
0,46
0,83
0,99
17,0 4,0
28,0 2,0
18,6 4,9
26 6
2,07
2,05
0,21
0,68
79,0
70,0
76,5
71,6
