Способ получения карбоксипептидазы

 

r Q (11)575353

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 2201.76 (21) 2318310/23-04 (я) м. к . с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (43) Опубликовано 0510,77. Бюллетень № 37 (45) Дата опубликования описания 261077

С 07 0 7/020

А 61 К 37/48

faeyCapereeaae(l aeeaxez

Вевета Миивтрев CCOP ие диая азвбретий а втирмтю% (53) УДК 577.15.07 (088. 8) (72) Авторы изобретения A-с ° Цыперович, н. и. поликарпова и А. с.: пилявская (71) Заявитель

Институт биохимии им.A.Â.Ïàëëàäèíà, (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КАРБОКСИПЕП1 ИДАЭЫ

Изобретение относится к способу получения протеолитнческого фермента— карбоксипептидаэы (КФ 3.4.12), применяемой в пищевой, текстильной и медицинской промышленности а также в на- 5 учной и лабораторной практике.

В продымленном масштабе карбоксипептидаэу получают из сырья животного происхождения — поджелудочной железы крупного рогатого скота — путем много-10 стадийной очистки.и выделения фракции, содержащей карбокснпептидазу, В результате получают суспензню фермента, весьма нестойкую при хранении °

В настоящее время наиболее перспе тивными являются способы получения ферментов иэ микробных источников— дешевого сырья и мощного продуцента ферментов со специфическими свойствами.

Одним из таких способов является получение карбоксипептидазной фракции иэ проназы — ферментного комплекса актиномицета StreptorngcesqНвеиь (зйт

1 Иьеаз ) путем осаждения белков со- 25 лями, например сульфатом аммония, и органическими растворителями, фракциОнирования белков на ионообменных смолах и молекулярных ситах с выделением смеси ферментов, входящих в состав 30

2 проказы, и vx хроматографированил на колонке с амберлитом.

Белок карбоксипептндазной фракции осаждают нз раствора сульфатом азаюння, осадок растворяют в буфере и дат лее диализуют с получением фермента в виде раствора.

К недостаткам известного способа относятся низкий выход целевого продукта н получение фермента с низкими удельными актнвыостью и стабильноотьф при хранении. цель изобретения - повмиение стабильности фермента, его удельной активности и выхода — достигается тем> то нз культуральной жидкости актнно мицета зтг. seve после фильтрования осаждают белки добавлением сульфата аммония до полного насыщения, а полученную после диалнэа карбоксипепт тидазу лиофилизируют в ацетатном буфере, содержащем ионы кальция, предпочтительно в 0,05 М ацетатноМ буфере, содержащем 0,01 И ацетат кальция

Пример. 1,5 л культуральной жидкос). тн ктиномицета Stv. seue штаьм С-5 полученной с Киевского завода медпре паратов, фильтруют, добавляют к фильм» рату сульфат аммония до полною васы щения (700-720 r соли на 1 л фильтра»

575353

Формула изобретения

Составитель A Бочаров

Техред С, Беца Корректор A.Êðàâ÷åíêî

Редактор Т. Шар г анов а

3988/18 Тираж 553 Подписное

4HMMHM Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Заказ

Филиал ППП Патент . г,Ужгород, ул.Проектная, 4 та), центрифугируют (4000-6000 об/мин) на холоду в течение 1 час и суспенди руют осадок в 50 мл воды, содержащей

0,001 М ацетат кальция.

Затем смесь диалиэуют 4-5 час против проточной воды и 12 час против дистиллированной воды с добавлением

0,001 М ацетата калъция. Обаем жидкости после диалиэа увеличивается до

100 мл, Диалиэат наносят на колонку (5 х х 40 см), заполненную натрийкарбоксиметилцеллюлозой с емкостью 0,7 мг-экв.

Белковые фракции влюируют линейным градиентом хлорида натрия (в одном сосуде 0,005 М ацетатный буфер, содержащий 0,001 М ионов кальция, а в другом 500 мл 0,35 М раствора хлорида натрия в буфере)., 39

Полученную после хроматографии тре тью фракцию осаждают насыщенным pac" твором (98%) сульфата аммония, центрифугируют на холоду, растворяют в минимальном количестве 0,05 М ацетат е5 ного буфера, содержащего 0,01 М ацетат кальция, и диализуют 2 час против проточной воды 12 час против буфера.

Полученный диалиэат наносят на колонку (2 х 30 см) с амберлитом СУ-50 ® в Ha - форме, уравновешенную тем же буфером, и элюируют белковые фракцюи лмнейиым градиентом ацетата натрия (в одном сосуде 500 мл 0,05 М аце» татного буфера, содержащего 0,01 М ионов кальция, в другом 1 М раствор ацетата натрия в этом же буфере).

Полученную после хроматографий третью фракцию, содержащую карбоксипептидаэу, осаждают сульфатом аммония, диализуют против ацетатного буфера и лиофилиэируют в 0,05 M ацетатном буфере, содержащем 0,01 М ацетат кальция.

Получают препарат карбоксипептидазы, гомогенной при рехроматографни на колонке с амберлитом СУ-50, при элект" рофореэе в полиакриламидном геле и пб

H-концевому анализу (аланин).

К преимуществам предлагаемого способа относятся получение высокоактивного, стабильного (лиофилизированный препарат, содержащий 5-10% белка, сохраняет свою активность в течение нескольких лет) препарата карбокси-: пептидаэы с высоким выходом (выход по белку от белков культуральной жи кости 4-5%, по активности 10-20%) и микробного сырья, являющегося отход м прн производстве антибиотиков.

1. Способ получения карбоксипептида,эы иэ белкового сырья актиномицета

Ыгар оюусез уйвенл, включающий извлечение из сырья белков осаждением сульфатом аююния, фракционирование белков ионообменной хроматографи(eN с последующим диалиэом, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения стабильности фермента, его уделъной .активности и выхода в качестве белкового сырья используют культуральную жидкость актиномицета, иэ которой после фильтрования осаждают белки добавлением сульфата аммония до полного насыщения, а полученную после диалиэа карбоксипептидазу лиофилизируют в ацетатиом буфере, содержащем ионы кальция.

2.Способ по п.l, о т л и ч а вшийся тем что лиофилизацию проводят в 0,05 М ацетатном буфере, содержащем 0,01 М ацетат кальция.