Способ определения гистамина

 

1 ч

jii! 8619

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Йоюе Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (б1) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 28.01.76 (21) 2310251/28-13 (51) N, Кл.- GOIN 33/16 с присоединением заявки №

Государственный комитет

Совета Министров СССР (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.10.77. Бюллетень № 40 (53) УДК 615.476(088.8) (45) Дата опубликования описания 03.11.77 по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения (71) Заявители

В. А. Мурза и Ю. А.-И. Плюшкис

Научно-исследовательский институт экспериментальной и клинической медицины Министерства здравоохранения

Литовской ССР и Научно-исследовательский институт эпидемиологии, микробиологии и гигиены (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТАМИНА

Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в медицине для диагностики гиперчувствительности немедленного и замедленного типа, а также оценки эффективности лечения.

Известен способ определения гистамина в различных фракциях крови путем ее экстракции, перевода в водную фазу, конденсации с о-фталевым альдегидом и спектрофлуориметрирования.

Однако известный способ является трудоемким, малоинформативным и не обеспечивает стабильности результатов.

С целью упрощения способа и увеличения стабильности результатов гистамин из крови 15 экстрагируют гептиловым спиртом.

Способ осуществляется следующим образом.

В центрифужную силиконированную пробирку с 0,5 мл 3%-ного раствора триолона 20 берут из локтевой вены 5 мл крови, осторожно перемешивают и наслаивают на поверхность смеси уротраста и фикола (10 частей

40% -ного раствора уротраста с конечной плотностью 1200 г/мл и 24 части 9%-ного 25 раствора фикола, полимера с молекулярным весом около 400000; конечная плотность смеси 1073 г/мл) в другой силиконированной пробирке. После оседания эритроцитов плазменный слой разделяется на две части: верхний широкий слой плазмы с взвешенными лимфоцитами, моноцитамп, базофилами и тромбоцитами и нижний узкий слой с гранулоцитами и эозинофилами. Лимфоцптарную и гранулоцитарную фракции отсасывают силиконированной пипеткой в отдельные центрифужные пробирки. Для подсчета лейкоцитов как лимфоцитарной, так и гранулоцитарной фракций из обеих пробирок в отдельные лейкоцитарные меланжеры набирают плазму с лейкоцитами до метки 0,5 и 0,05%-ный раствор метиленовой сини в 0,5%-ном растворе уксусной кислоты до метки 11. Обе пробирки центрифугируют при 1600 д и 0 — 5 С в течение 20 мин. Надосадочную плазму верхнего лимфоцитарного слоя сливают в другую пробирку для определения количества свободного гистамина в плазме, а надосадочный слой гранулоцитарной фракции крови с примесью фикола и уротраста выбрасывают. Получают две пробирки с осадками лейкоцитов: смесь лимфоцитов, моноцитов и базофплов (выход около 90% ), смесь гранулоцитов с эозинофилами (выход около 50%). Обе пробирки с осадками лейкоцитов, а также плазму без форменных элементов с осадками лейкоцитов и плазму без форменных элементов быстро охлаждают до температуры минус

578619

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Техред Л. Гладкова

Редактор М. Дмитриева

Корректоры: Л. Брахнина

О. Тюрина

Заказ 2417/10 Изд. № 877 Тираж 1109 Подписное

НПО Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

40 C и в таком виде оставляют в холодной камере на 1 — 6 суток. При продолжении анализа прооирки оттаивают. Процедуру замораживания и оттаивания повторяют еще раз, после чего к 2 мл плазмы или к осадкам лейкоцитов добавляют бидистиллированную воду до 4 мл, тщательно перемешивают и прибавляют 0,5 мл 5 н. едкого натрия.

Смесь насыщают хлористым натрием и добавляют 10 мл гептилового спирта. После перемешивания на качалке в течение 30 мин пробирки центрифугируют при 1600 q в течение 10 мин, 8 мл органической фазы переносят в другую пробирку с 3 мл 0,1 н. соляной кислоты, встряхивают в течение 20 мин и центрифугируют при 36 q в течение 10 мин.

1 2 мл водной фазы с гистамином добавляют

0,4 мл 1 н. едкого натрия, содержимое пробирки тщательно встряхивают и добавляют

0,1 мл свежеприготовленного 1 /о-ного раствора о-фталевого альдегида в абсолютном метиловом спирте. После тщательного перемешивания выжидают в течение 4 мин. Затем добавляют 0,2 мл 3 н. раствора соляной кислоты.

Флуориметрирование проводят при максимуме спектра возбуждения 360 нм и сканировании спектра флуоресценции (максимум при

450 нм). При работе с флуоресцентным спектрофотометром Hitachi MPF — 2А используются щели прибора величиной соответственно 10 и 20 нм, чувствительность 2, дополнительное шунтирование фильтром УИ вЂ” 39. Одновременно анализу подвергают 4 мл бидистиллированной .воды и два образца с 0,5 мкг гистамина в 0,1 н. растворе соляной кислоты. Однако в одном из них при реакции конденсации меняют очередность добавления

3 н. соляной кислоты и о-фталевого альдегида, так как в кислой среде реакция конденсации гистамина с о-фталевым альдегидом не происходит. Неспецифическую флуоресценцию реактивов вычитают. В наших условиях она не превышает интенсивности свечения

0,01 мкг гистамина с о-фталевым альдегидом в кювете.

Подсчет количества лейкоцитов в лимфоцитарном и гранулоцитарном слоях венозной крови, с учетом гемограммы и числа лейкоцитов капиллярной крови, позволяет полученный результат перевести на концентрацию резервного гистамина в мкг/10 лейкоцитов лимфоцитарной или гранулоцитарной фракции венозной крови, а также концентрацию гистамина в отдельных фракциях капиллярной крови.

Предлагаемый способ определения гистамина повышает точность и надежность результатов, уменьшает возможность ошибок при экстрагировании вещества, упрощает процедуру исследования, требует меньших затрат труда и лабораторного оборудования, дает возможность судить о содержании свободного и резервного гистамина в отдельных фракциях венозной и капиллярной крови.

Способ определения гистамина в различных фракциях крови путем ее экстракции, перевода в водную фазу, конденсации с о-фталевым альдегидом и спектрофлуориметриро35 вания, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и увеличения стабильности результатов, гистамин из крови экстрагируют гептиловым спиртом.