Способ иммобилизации микробных клеток

 

ОП ИСАНИЕ

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) б 08479

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 260375 (21) 2119868/04 (23) Приоритет - (32) 27. 0 3. 74 (51) М. Кл.

С 07 G 7/02//

//Ь 61 К 37/48 (31) 455143 . (33) США (43) Опубликовано 250578, Бюллетень № 19

Государственный комитет

Совета )еннистрав СССР оо делам изобретений и открытии (53) УУЖ 547.15.07 (088.8) (45) Дата опубликования описания 260478

Иностранец

Роджер Питер Нельсон (ClaA) (72) Автор изобретения

Иностранная фирма

14Пфe 3e HHKтв (США) (7е) Заявитель (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК

Изобретение относится к способу получения препаратов микробных клеток, иммобилизованных на нерастворимой подложке, которые и в связанном виде об ладают присущей им. в нативном состоянии способностью каталиэнровать неко торые химические превращения благодаря наличию внутриклеточных Ферментов.

Предлагаемые препараты могут найти применение в химической, фармацевтнчес- 10 кой и пищевой промышленности.

В литературе описаны способы получения препаратов иммобилиэованных на носителях микробных клеток °

В частности, описан способ получения адсорбированных на кожном коллагене клеток штамма Streptorn ces рЪаеос И о м о яе ив э содержащих активную глюкозоиэомеразу и способ удержания в геле грибковых клеток, содержащих Я) гидроксилирующнй фермент, способный катализировать превращение, конечным продуктом которого является кортизол.

Однако, в литературе отсутствуют сведения о способе получения иммоби- 25 лиэованных микробных клеток, предотвращающем диссоциацию (вымывание) клеток из носителя прн манипулировании с такими препаратами в реакторах. Диссоциация клеток сопровождается снижени- З0 ем активности реактора и загрязнением реакционного потока. Для предотвращения такой диссоциации или сведения ее к минимуму приходится жестко ограничивать условия проведения реакций.

Предлагается способ получения стабильных препаратов иммобилизованных микробных клеток, в которых не происходит вымывание клеток- иэ носителя в процессе реакции, заключающийся в том, что иммобилиэация микробных клеток происходит посредствам создания ковалентных связей между клетками и водонерастворимой полимерной матрицей.

В предлагаемом способе нативные мнкробные клетки ковалентно связываются с водонерастворимыми макрочастицами полимера, несущими реакционноспособные группы, На наружной поверхности клеточных мембран находится большое количество -.Функциональных групп—

{таких как амйногруппы,.гидроксильные и сульфгидрильные...группы н др.), способных,реагировать с реакцнонноспособиыми группами, содержащимися в полймере (например, эпоксидных, галоидкарбонильных или галоидметнлкарбонильных).

Образование ковалентных связей может происходить либо перед, либо после образования полимера. В первом слу608479 чае микробные клетки контактируют с этиленненасыщенным мономером, содержащим реакционноспособные группы, а а:;.-тем мономер подвергают полимеризации или сопОлимеризации B присутствии мО" номера, образующего поперечные связи, и инйциирующей системы. Во втором случав, микробные клетки подвергают не= посредственному взаимодействию с макрочастицами полимера, содержащего реакционноспособные группы, Такими полимераьи могут быть природные, а также синтетические органические полимеры1

Применяемые этиленненасыщенные мо15 номеры имеют формулу

СИ = С-9/

2 (1)

3, 20 где R-водород, метильная группа или хлор;

О 0 0

1 ц

%.- S-È, O s-и, -с-я

О О

iihH

0 и

- с- х-(-R )

П где R - галоген, азйдная, 2,3-зпоксий пропоксидная, 2,3-эпитиопропоксидная, Й -(2,3-эноксипропил)аминная, М. -((П—

-диаэонийхлорид)фенил) аминная, акрилоилоксильная, низшая алкилоксикарбонилоксильная или бензолсульфонилоксильная группа;

Х - кислород или NRs где Я,— водород или алкил С вЂ” Се;

У - алкилен„Св- СЗ,.

П - целое число, 1 или 2;

Х - галоидацетильная, 2-(4,б-ди- 40 хлор)-5-триазинильная, л -толуолсульфонильная, П вЂ (галоидметил)-бен- .; эоильная или цианильная группа;

К вЂ” Х, при условии, когда Z !

"И -толуолсульфонильная группа, то Х вЂ” 45 кислород.

Предпочтительным для образования связей являются мономеры и полимеры, содержащие эпоксидные, галокарбонильные и галометилкарбонильНЫе группы. 50

Особенно предпочтительными являются те полимеры, которые содержат реакционноспособные мономеры 2,3-эпоксипропилметакрилат (глицидилметакрилат), 2,3-эпитиопропилметакрилат, метакрило- 55 ил хлорид и .бромацетилгидроксизтилметакржлат.

В этом случае, когда мономеры и полимеры содержат нереакционноспособные функциональные группы, когда например, И « гидроксильная группа или 2 60 водород в мономере формулы I, то эти функциональные группы могут быть переведены в .реакционноспособные заместители известными способами. Это требует использования полифункциональ- 65

ИОГО < низкомс11екулярного реагента .

Таким Образом, когда В представя..ет с.бой гидроксиль: ую группу в формуле

1 „ ro карбоксильные группы мономера или полимера могут быть активцрОвань! при помощи реакции с соответствующим реагентом, активирующим карбоксип,ные

Гру11пы та):. л I как; карбодиимид q H . пример, дициклогексилкарбодиимид ил11 этилморфолинокарбодиимид; М -зтил-5-фенилизоксазолин-3-сульфонат (реактив Будворда); кетенимины, такие как пентаметиленкетен циклогексилимин; простые ацетиленовые эфиры, например, этоксиацетилен; гексагалоциклотрифос фатриазины; )) -гидроксифтальимид или (4 -гидроксисукцинимид и другие реактивы, используемые для образования пептидной связи. Когда в формуле 1 водород, то гидроксильные груш1ы мономера или 11олимера могут переведены в активированное состояние при помощи стандартных методов, предусматривающих обработку соединением формулы Z — галлоид и, Особенно бромацетилбромидом, цианогенбромидом и 2-амино-4,б-дихлор-1,3,5-триазином.

Процесс иммобилизации применяют к микробным клеткам, таким как бактерии, дрожжи, актиномицины и грибки.

Предпочтительными клетКами являются такие клетки, в которых первичная ферментативная система представляет собой оксидоредуктазы, Особенно такие, как

Оксидаза глюкозы, которая не требует .решения проблемы растворимости субстрата, гидролазы, такие как ОС, Р --амилазы и пептидазы, и особенно ацилаза пенициллина; лиазы, предпочтительно вызывающие разрыв углерод — кислородных связей, и особенно такие, как фенилаланинаммонийлиаза и аспарат аммонийлиаза, которые вызывают расщепление по связям углерод-азот; и изомеразы, такие как рацемазы, зпимеразы, цис-транс-изомеразы, и особенно изомеразы глюкозы. Предпочтительными видами бактерий являются:

Pseudornonas, xauthàrnonas; Асе1о11ас1ег, А6са61депе s; F (ayobact erbium, Escher i eh a, Асгооас1ег, Ermine ia,ser гас1о; Ргoteus,м1сгососсоs, Sar eina,:LackоbaciИо,Бас СЕus,uocavJia, Мгер1от сеь, Согреве вастег1от.

Предпочтительными грибковыми и дрожжевыми культурами являются:

)(Ьойо1гцса,МЪобоьрогidiurn, Ьрогobotornv— сеь, hhucor, Fusariurn,рenic Иыт, Asper pic(us, Ыо пегеИа Rhizopus, Saccharorn ces,Соп1Й оbotus,9 ssochEarn s, Candida,Chaetorniurn, Tr (сhodeгтпа,бер1ог(а,сорг1nus, Hurnuсîta. и Тмсhosporon.

Предпочтительным актиномицетом является микрополиспора. Особенно предпочтительными штаммами являются:

Escher ichia соБ,Bacterium сойамегus,Proteus rett åã1, hodotruса сггас16 s, PeniCIf(Pium с11г sog enurn и Asperg 46f us n iq er.

6084?9

Образование ковалентных связей клеток и реакционноспособного полимера, или связей клеток с реакционноспособным мономером с последующей полимериэацией или сопольмериэацией, проте» кает в водной среде. Температура реакции образования связей с полимером или мономером, или реакции полимери- зации после образования связей с мономером, может меняться в широком ди-. апазоне, но предпочтительный диапазон составляет от 5 до 50 С, и особенно о предпочтительный от 10 до 30 С. Время, необходимое для образования связей, будет зависеть от выбранной системы и температуры образования связей, но обычно составляет от 0,5 до 35 час1 предпочтительное время образования связей с полимером составляет от 15 до 30 час, тогда как время образонания связей с мономером — от 1 до 5час.20

Процесс полимериэации обычно протекает в пределах от 1 до 6 час. Весовое соотношение полимер-клетки (сухой вес) может широко меняться, но предпочтительное отношение находится в преде- 25 лах от 0,1 до 25, особенно от 0,5 до .4.

Состав полимера может меняться в широких пределах, но предпочтительный состав, определяемый молярным процентным содержанием всего мономера, составляет от 15 до 90% реакционноспособного по отношению к клетке мономера, от 0 до 60% сомономера и от 10 до 40Ъ мономера, образующего поперечные связи. Эти пропорции яьляются предпочтительными, независимо от того, .связываются ли клетки с мономером или полученным предварительно полимером.

В некоторых случаях клетки обрабатываются полифункциональным сшивающим реагентом для понижения потерь фермента иэ клеток. Предполагают, что один класс полифункциональных реагентов приводит к образонанию поперечных связей на клеточной поверхности посредством взаимодействия с аминогруппами клеточной мембраны, в результате чего существенно понижается пористость мембраны; другой класс обеспечивает такой результат за счет активации карбоксильных групп, присутствующих в мембране, которые затем нзаимодействуют с аминогруппами мембраны и образуют.амидные связи. Типичными примерами первого класса соединений являются такие реагенты, как альдегид пировиноградной кислоты, глиоксаль, гидроксиадипальдегид, хлорангидрид циануровой кислоты, тетраазотированныв

Когда клетки связаны с реакционноспособным мономером, начинается процесс последующей полимеризации, протекающий в водной среде в присутстнии одного или более сомономера или без него и бифункционального мономера, приводящего к образованию поперечных связей, и инициирующей системы. Могут быть взяты любые из сомономеров или мономеров, обеспечивающих образование поперечных сняэей, и инициирующих систем, используемые для проведения полимериэации такого типа и не приводящие к снижению ферментативной актив- 4" ности.

Подходящими сомономерами являются, например, акриловые, А -хлоракриловые, метакриловые кислоты и глициди- ловые, алкильные сложные эфиры на ос- 45 нове низших алкилов, N, N †(дизамещенные)аминоалкильные сложные эфиры, амиды, замешенные низшим алкилом амиды, амиды с.метилольными заместителями, )(-монозамещенные аминоалкил- 50 амиды, M, M -дизамещенные аминоалкиламиды, стирол, бутадиен и иэопрен. В качестве предпочтительных сомономеров можно назвать стирол, акриловую кислоту, (2-гидрокси-3-(1- ((4-метил-пиперазинил))-пропил)метакрилат и, особенно, метилметакрилат.

Может быть использован целый ряд мономеров, образующих поперечные связи и придающих. конечному полимеру характер пространственной сетки и водонерастворимость, например, акриловые мономеры или олефиновые соединения и другие мономеры, известные в этой области. Примерами таких мономеров яв ляются 1-3-бутилен диакрилат, этилен- 65 гликоль диметакрилат, 1,3-бутилен диметакрилат, 1,б-гексаметнлендиакрилат, этилендиакрилат, диэтиленгликоль диметакрилат, Й, Й -метиленбисакриламид, неопентилгликоль диметакрилат, 1,1,1—

-триметилолэтан триметакрилат и дивинилбензол. Предпочтительным мономером, образующим поперечные связи, является М,М -метиленбисакриламид.

Реакции полимеризации и сополимеризации инициируются свободными радикалами. Пригодными инициирующими свободнорадикальные процессы системами являются такие системы, которые генерируют свободные радикалы и обеспечивают протекание реакций полимеризации и сополимеризации с соответствующей скоростью в мягких условиях, что обусловлено термической чувствительностью клеточных ферментов, По этой причине предпочтительными являются окислительно-восстановительные инициирующие системы. Примерами таких систем являются перекисные соединения, такие как персульфаты аммония, натрия или калия, перекись бензоила и ди(втор.бутил)—

-пероксидикарбонат в сочетании с восстановительным агентом, таким как тиосульфат натрия, метабисульфат натрия, гексагидрат ферроаммоний сульфата, диметиламинопропионитрил или рибофлавин. Предпочтительной инициирующей системой является система диметиламинопропионитрилперсульфат аммония.

608479 о-дианизидин, бис-диаэатированный бензидин, 1,3-дифтор-4,6-динитробенэол, толуол 2,4-диизоцианат и, особенно, глутаральдегид, тогда как во второй класс входят такие соединения, как 5 этилхлорформиат и водорастворимые карбодиимиды, например, 1-этил-3-(3-диI метиламинопропил)-карбодиимид.

Обработку клеток проводят перед присоединением к реакционноспособному мономеру или полимеру. Такую обработку проводят в водной среде. Эффективную обработку клеток можно проводить в широком температурном диапазоне, но предпочтительным диапазоном является интервал от 5 до 50 С, и особенно о от 10 до 30 С.. В зазисимости от температуры и природы используемого агента такая обработка требует обычно от

0,5 до 10 час, предпочтительно, когда она протекает в течение 2-4 час. Количество используемого реагента может существенно изменяться„ обычно оно колеблется от 1 до 50 вес.Ъ клеток (сухой вес", предпочтительно †. от 5 до ?5 вес.Ъ. 25

Предлагаемый процесс иммобй пизации микробных клеток водонерастворимым полимером, протекающий с образованием химических ковалентных связей, с дополнительной обработкой, необходимой 30 для минимизации потерь клетками фермента, приводит к получению стабильной системы имиобилизованного фермента, не требующей вь еления требуемого фермента. Вследствие устойчивости сис- 35 темы н легкости фильтрации полученный продукт можно эффективно использова-ь в водных каталитических химических процессах, проводящихся либо периодически с повторным использованием сме- 40 си, либо непрерывно, Применяемые в споссбе в качестве исходных веществ соединения могут быть получены известными способами. Продукты ферментативных превращений выделяют известными методами.

Пример 1. К 80 г глицидилметакрилата и 1 л воды добавляют при перемешивании 30 г((, И -метиленбисакриламида. После перемешивания смеси в течение 15 мин при комнатной температуре добавляют 10 г метилметакрилата, смесь охлаждают до 5 С и в течение 15 мин через охлажденную смесь пропускали азот. Затем добавляют 20 мл диметиламинопропионитрила и 2 r персульфата аммония. Смесь, находящуюся под атмосферой азота, перемешивают при 10 С до начала процесса полимеризации, затем дополнительно час при температуре окружающей среды, и вы- 60 стаивают в течение 2 час. К образовавшемуся осадку добавляют 750 мл воды, и смесь интенсивно перемешивают, чтобы собрать полимер. Осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат на воздухе, в результате получают 120 г полимерного материала, белого цвета.

Ферментативную культуру А псе /1(R Rel

-ЗР11тег Cultus e! Ъ вЂ” 2454 выращенную в азробных условиях при

33 С и рН 5,8-7,0 на глюкозе, отфильтровывают, а клетки промывают водой и получают полусухую пасту. Клетки (250г/

55 г сухого веса) поместили в раствор, содержащий 22 r 25%-ного водного глутаральдегида в 1000 мл воды, рН суспензии довели до 6,2 и перемешивают. в течение 1-3/4 час при комнатной температуре. Осадок отфильтровывают и промывают водой, в результате чего получают 104 r сырых обработанных клеток,.обладающих 76% активностью от начальной активности оксидазы глюкозы.

Суспензию 32 r сырых обработанных клеток и 16 r глицидилметакрилатного полимера в 240 мл воды перемешивают в теченйе 30 час при комнатной температуре, а затем отфильтровывают. Осадок промывают водой, получают 126 г сырых иммобилизованных клеток, обладающих

58% активностью оксидазы глюкозы исходных необработанных клеток.

Пример 2. К суспензии 600 мл сырых обработанных клеток А. и (д ег полученных как и в примере 1 (активность оксидазы глюкозы 23 единицы/100 мг), в 20 .мл ацетонитрила добавляют одновременно 600 мг метакрилоил хлорида и 400 мг триэтиламина. Смесь перемешивают при комнагной температуре в течение 2 час, затем помещают в 20 мл воды "(конечное значение рН 6,03). К водной смеси в атмосфере азота, добавляют 1,3 г М,М -метиленбисакриламида, 750 мг метилметакрилата и 300мг акриловой кислоты. рН смеси доводят до

6,7 и обрабатывают 0,5 мл диметиламинопронионитрила и 250 мл персульфата аммония. Через 2 час от начала реакции смесь дополнительно обработали

150 мг персульфата аммония и перемешивают в течение часа. К реакционной смеси добавляют равный объем воды, смесь отцентрифугируют. Осадок отфильтровывают и промывают водой, получают

32,25 r сырых иммобилиэованных клеток, обладающих 78Ъ активностью оксидаэы глюкозы нативных клеток.

Пример 3. 47,3 г сырых иммобилизованных клеток из примера 1 помещают в 100 мл водного раствора, содержащеro 10 г глюкозы, смесь перемешивают 21 час при комнатной температуре с аэрацией. В конце реакции .остаточная активность фермента 753 от исходной, а конверсия глюкозы до смеси глюконовой кислоты и У -глюконолактона составляет 99%.

Процесс окисления можно проводить, используя 30 r сырых иммобилиэованных клеток примера 2 в 20 мл водного раствора, содержащего 2 r глюкозы, при этом достигают сравнимые степени кон608479

10 версии субстрата и инактивации фермента.

Пример 4. ьульонную ферментативную культуру,voteus ettgeri(АТСС

9250,Pfizer Cult F 2 ) 18470-76-60, выращенную в аэробных условиях при

28 С и рН 6,8-7,0 на молочном казеине центрифугируют, клетки смешивают с водой, получают полусухую пасту. К суспензии сырых клеток (7,5 г сухого веса) в 100 мл воды добавляют 4 r 25Вного водного глутаральдегида. Смесь рН 7,0 перемешивали в течение 3 час„ а затем центрифугируют. Обработанные клетки повторно суспендируют в 100 мл воды, а затем при перемешивании доба- вили 7,5 г глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1, Смесь с рН 7,0 перемешивают при комнатной температуре в течение 30 час. Осадок отфильтровывают, промывают водой и хранят в виде влажной массы до использования. Иммобилизованные клетки содержат 65% активности нативных клеток, что оценивалось по скорости конверсии пенициллина Я в 6-аминопеницилиновую 25 кислоту.

Пример 5. К суспензии 20 r (5,0 r сухого веса) иммобилизованных клеток Proteus геttдеr» примера 4 в 500 мл воды при рН 8,0 и температуре 37 С добавляют 5 г калиевой соли пенициллина, рН суспензии поддерживают на уровне 8,0 при помощи доэированного введения 1 н. МаОН, реакция гидролиза заканчивалась по истечении 3 час.

Иммобилиэованные клетки отфильтровывали, промывали водой и хранили вплоть до их дальнейшего использования в виде сырой лепешки, рН фильтрата доводят до

2 при помощи 2 н. НСВ, экстрагируют 40 этилацетатом, рН полученного водного слоя доводят до 4,3 при помощи 2 н.

Na0H, упаривают и- охлаждают, в результате чего получают белое кристаллическое вещество. Кристаллы отфильт- 45 ровывают, промывают водой и высушивают на воздухе, в результате чего получают

2,17 г (выход 75%) чистой 6-аминопеници иновой кислоты. Иммобилиэованные клетки характеризуются 50Ъ активностью60 ацилазы пенициллина исходных иммобилиэованных клеток через .20 циклов.

Пример 6. К перемешиваемой смеси, находящейся под атмосферой азота, 3,6 r бромацетилгидроксиэтилметакрилата в 15 мл воды добавляют 375 мг .N,(Ч -метиленбисакриламида. Смесь охлаждают до 50С и обрабатывают 0,25 мл диметиламинопропионитрила и 38 r персульфата аммония. Смесь медленно перемешивали при комнатной температуре до начала реакции полимеризации. Затем мешалку останавливают, реакцион у ную смесь выстаивают при комнатной температуре в течение 2 час. Образовав|шуюся суспензию разбавляют 25 мл воды 65 и фильтруют. Осадок промывают водой и сушат на воздухе в результате чего получают 3,7 макрочастиц полимера.

Сырые клетки P r ot e us е11 де v 1, выращенные и выделенные как и в примере 4 (10 r 2 г сухого веса) поместили в раствор, содержащий 0,8 г

25%-ного водного глутаральдегида в

50.мл воды, рН суспензии доводят до

7,0 перемешивают 3 час при комнатной температуре и центрифугируют. Обработанные клетки смешивают с 50 мл воды до получения консистенции полусухой пасты.

Суспензию 10 r обработанных клеток и 20 г бромацетилгидроксиэтилметакри латного полимера в 120 мл воды перемешивают 30 час при комнатной температуре и рН 7,0. Смесь отфильтровывают, и осадок промывают водой, получают 36,8 г сырых иммобилизованных клеток, характеризующихся 75% активностью ацилазы пенициллина исходных необработанных клеток.

Пример 7. К суспенэии 46 г сырых нммобилиэованных клеток примера 6 в 500 мл воды, рН вЂ” 8,0 при температуре 37 С добавляют 5 r калиевой соли пенициллина Ц, рН суспензии 8,0 при помощи дозированного введения

1 н. NOOH . Иммобилизованные клетки отфильтровывают, промывают водой и хранят до их использования в виде сырого куска. рН фнльтрата доводят до

2 при помощи 2 н. НС6 и экстрагируют этилацетатом. Полученный водный слой доводят до рН 4,3 при помощи 2 í Na0H„ упаривают и охлаждают, получают кристаллическую 6-аминопенициллиновую кислоту.

Пример 8. Суспензию 25 г сырых обработанных клеток А. h g el из примера 1, и 2 г глицидилметакрилата в 60 мл воды перемешивают при температуре 7 С в течение 17 час. Затем эту суспензию добавляют к смеси 2;2г

И, М -метиленбисакриламида, 2 мл стирола, 450 мл метилметакрилата, 0,5 мл диметиламинопропионитрила и 1,5 r

j 2-гидрокси-3- jl- (4-метилпиперазинил))-пропил1-метакрилата в 40 мл воды при рН 6,8. Смесь в атмосфере азота, обрабатывают 200 мг персульфата аммония и перемешивают 3 час при комнатной температуре. Осадок, отфильтровывают и промывают водой, в результате чего получают 43,6 r сырых иммобилизованных клеток, характеризующихся 75Ъ-ной активностью оксидаэы глю i козы исходных необработанных клеток.

Пример 9. 28,3 г сырых иммобилизованных клеток из примера 8 помещают в 200 мл водного раствора, содержащего 20 г глюкозы, и смесь перемешивают в течение 21 час при комнатной температуре с аэрацией. Выход смеси глюконовой кислоты и Ю -глюко608479 нолактона 80Ъ„ Реакционную суспензию отфильтровывают, осадок промывают водой,,получают 28 г сырых иммобилизованных клеток, характеризующихся 82Ъной активностью от исходной активности фермента.

Пример 10. Суспензию 5 r сырых клеток Pr oteus ге гт д е I 1, выращенных и выделенных как и в примере 4, 10 и 10 г глицидилметакрилатного полимера примера 1 и 65 мл воды перемешивают 24 час при комнатной температуре.

Смесь отфильтровывают, и фильтрат промывают водой, в результате чего полу- )5 чают 26,9 г сырых иммобилизованных клеток, характеризующихся 62Ъ-ной активностью от начальной активности ацелазы пенициллина.

25 r иммобилизованных клеток (1 г 20 сухих клеток) помещают в раствор, содержащий 0,4 г 25Ъ-ного водного глутаральдегида в 50 мл воды. рН суспензии довели до 7,0 и суспензию перемешивают 3 час.при комнатной температуре. Суспензию отфильтровывают, и осадок промывают водой, в результате чего получают 23,2 г сырых обработанных иммобилизов нных клеток, характеризующихся 79Ъ-ной активно тью ацилазы пенициллина от активности необработанных иммобилизованных клеток.

Пример 11. К суспензии 12 г сырых обработанных иммобилизованных клеток, полученных в примере 10, в

100 мл воды гри рН 8,0 и температуре

37 С добавляют: 1 r калиевой соли и нициллина Я. рН реакционной смеси поддерживают 8,0 добавлением 1 н. })а ОН

Материал иммобилизованных клеток фильтруют, промывают водой и хранят в виде сырого куска вплоть до дальнейшего использования. рН фильтрата доводится до 2 2 н. HCK, фильтрат экстрагируется зтилацетатом. Образующийся водный слой доводят до рН 4,3 45

2 н.}(с}DH, упаривают и охлаждают я результате чего получают кристаллическую 6-АПК.

Пример 12. рН суспензии клеток

A. }I jf с г, выращенных и выделенных как 50 и в примере 1 (20 г, 4 г сухого веса), и 8 r глицидилметакрилата в 100 мл воды доводят до 7,5 и суспензию встряхивают при комнатной температуре 18час.

Добавляют 1,5 г )(, N -метиленбисакриламид и полученную суспензию в атмосфере азота перемешивают 15 мин, затем охлаждают до 5 С, обрабатывают

150 мг персульфата аммония и 1 мл диметиламинопропионитрила, перемешивают при температуре окружающей среды Зчас

Продукт реакции отфильтровывают и промывают водой, получают 71 r сырых иммобилизованных клеток, характеризующейся 62Ъ-ной активностью от началь(ной активности оксидазы глюк,>зы.

18 r иммобили зов аннь.х клеток (1 г сухого веса) помещают в раствор, со— держащий 0,4 г 25Ъ-ного водного глутаральдегида в 100 мл воды. рН суспензии доводят до 7,0 и суспензию перемешивают в течение 3 час при комнатной температуре. Осадок отфильтровывают и промывают водой, получают 17,3г сырых обработанных иммобилизованных клеток, содержащих 75Ъ активности оксидазы глюкозы, присутствующей в иммобилизованных клетках перед обработкой глутаральдегидом.

Пример 13. 1.4 г сырых обработанных иммобилиэованных клеток, полученных в примере 12, помещают в 15 мл водного раствора, содержащего 1,5 r глюкозы, и смесь в условиях аэрации перемешивают 21 час при комнатной температуре, в результате чего достигают конверсии в глюконовую кислоту.

Пример 14. Клетки ЯЬойоСого1а

g ac (is (NRR А 4109Ä,Ð1i1.åã Cu(,t.

1 1} (6521) выделили из бульонной культуры, выращенной в аэробных условиях при 28 С и рН 6,8-7,0 на глюкозе о путем центрифугирования. 50 r промытых клеток в 250 мл воды обрабатывают

5 г глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1. Смесь перемешивают при комнатной температуре

20 час. Суспензию отфильтровывают, осадок промываю-. водой, получают 63г сырых иммобилизованных клеток, содержащих 49Ъ исходной фенилаланин аммоний — лиазной активности.

Пример 15. Суспензия 14,74 г сырых иммобилизованных клеток, полученных в примере 14,в 30 мл воды, 2,25 г транс-коричной кислоты, 652 г хлористого аммония и 3,3 мл концентрированной гидроокиси аммония, рН суспензии 9,5. Смесь встряхивают 18час при 37 С, получают (-фенилаланина, о выход 90Ъ в расчете на свободную коричную кислоту, Продукты реакции отфильтровывают и промывают водой, в результате чего получают 14 г сырых иммобилизованных клеток, содержащих 77Ъ исходной фенилаланин. аммоний лиазной активности. L -фенилаланин выделяют из фильтрата стандартными методами.

Пример 16. Суспензия 40 r промытых клеток )Zhodoto} u(.oI g I.ocI f.1 ь выращенных и выделенных как описано в примере 14, 8 r глицидилметакрилата в 80 мл воды, рН суспензии доводят до

7,2, смесь перемешивают при комнатной температуре 1,5 час. Добавляют 1,5 г ! г},)Ч -метиленбисакриламида, перемешивают в атмосфере азота. 10 мин, затем охлаждают до 5 С, обрабатывают 150 мл персульфата аммония, 1 мл диметиламинопропионитрила, перемешивают при комнатной температуре три часа.Суспензию разбавляют водой и отфильтровывают.

Полимерный осадок промывают водой и

608479

14

13 получают 62,3 г сырых иммобилизованных клеток, содержащих 44% исходной фенилаланин аммоний — лиаэной активности.

Пример 17. Суспензию 15 г сы-рых иммобилизованных клеток полученных в примере 16 и 30 мл воды, 1,12 г транс-коричной кислоты, 320 мг хлористого аммония и 1,6 мл концентрированной гидроокиси аммония, РН суспензии 9,5. Смесь встряхивают при 37.С 10

Р

18 час, получают Ь -фенилаланин, вы- ход которого сравним с выходом L -Фенилаланина в примере 15.

П р и м е Р 18. Суспензию 15 г сырых клеток Pr ot eus гettg ег1 выра15 щенных и выделенных как описано в примеГе 4, и 30 r глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1 вво" дят в 100 мл воды, перемешивают при комнатной температуре 18 час, РН 7.

Затем суспензию центрифугируют, оса20 док промывают водой, в результате чего получают 100 г сырых иммобилизованных клеток, содержащих 100Ъ ацилазы пенициллина исходной активности.

К суспензии 25 г сырых иммобилиэованных клеток в 70 мл воды при РН 8,0 и 37 С добавляют 1 г калиевой соли пенициллина . Реакция гидролиза, про текает 3 час при РН 8,0 введением 1н, 30

МОН .,Суспензию отфильтровывают, им.-. мобилизованные клетки промывают водой и .хранят в виде сырого куска вплоть до дальнейшего использования. Однако эффективность этих клеток с точки зре-, ния получения 6-аминопенициллиновой кислоты была ниже, чем в примере 4, так как активность ацилазы пеницилли" на составила только 15Ъ активности исходных клеток уже через 2 цикла.

Пример 19. К 25 r 2-гидрокси- 40 этилметакрилата в 100 мл воды добавляют 12,5 г бромистого дициана, растворенного в 100 мл воды. РН смеси немедленно доводят до 11 при помощи 5 н

ga0H в результате чего температура 45 поднялась до 45оС, реакцию поддерживали при этом .значении рН до окончания реакции.. Затем смесь охлаждают до комнатной температуры, доводят РН до

6,5 и обрабатывают суспенэией 50 r 50 высушенных замораживанием клеток Prote u s г e tt g e г 1, предварительно выра щенных и выделенных как и в примере 4, в 500 мл воды. Образовавшуюся суспензию перемешивают в течение 45 мин. За-55 тем добавляют 25 г акриламида и 2,5 г

-метиленбисакриламида, и суспензию перемешивают 15 мин, охлаждают до

4 С и обрабатывают 4 мл диметиламинопропионитрила и 425 мг персульфата аммония. Смеси дают нагреться до комнатной температуры и вызреть в течение часа. Затем смесь гомогенизируют, используя смеситель уоринга, и центрифугируют. Гелеподобный центрифугат суспендируют в воде, снова центрифу65 гируют, промывают водой и высушивают замораживанием, получают 112 r cyxux иммобилиэованньм клеток, содержащих

193 ацилазы пенициллина начальной активности °

Пример 20. К суспензии 20 r сырых клеток Рt Î t 8 u s г е t t g e t 1, выращенных и выделенных как описано в примере 4, s 80 мл воды добавляют 1 r

25%-ного водного глутаральдегида и

10 r глицидилметакрилата. РН суспенэии доводят до 6,8, и суспензию перемешивают при комнатной температуре .2 час. Затем смесь в .атмосфере азота обрабатывают 1,9 r Й, 8 -метиленбисакриламида и 2 мл диметиламинопропионитрила, РН доводят до 7 и обрабатывают 20 мг персульфата аммония. Образовавшуюся суспеизию перемешивают

1/2 час, а затем дают ей вызреть при комнатной температуре в течение 11/2 час. Осадок отфильтровывают и промывают водой, получают 81,3 г сырых иммобилизованных клеток, содержащих

54% исходной активности ацилазы пенициллина необработанных клеток.

Сырые иммобилизованные клетки используют для превращения калиевой соли пенициллина-Ц в 6-аминопенициллиновую. кислоту, как описано в примере 7.

П р и м е Р 21. ЬасФ.ег1от сайачегus (ATCC 97ЬО, Pf)zev Culture,FD 24016) бульонная культура, выращенная в аэробных условиях при 28» С и рН 6-8 на субстрате из гидролиэованного протеина, центрифугируют,и клетки смешивают с водой для получения полусухой пасты. К суспензии сырых клеток (7,5 r сухого .веса} в 100 мл воды добавляют 4 г 25%-ного водного глутаральдегида. Смесь пер.iJe&iивaют в течение 2 час при РН 7, а атем цей трифугируют. Обработанные клетки вновь суспендируют в 100 мл воды, при перемешивании добавляют 7,5 г.глицидилметакрилатного полимера полученного в примере 1. Смесь перемешивают при РН 7 и комнатной температуре в течение

30 час. Осадок фильтруют, промывают водой и до дальнейшего использования хранят в виде сырого куска.

Пример 22. 120 г Фумаровой кислоты добавляют к 140 мл концентрированной гидроокиси аммония. РН смеси доводят до 8,5 при помощи гидроокиси аммония, и объем реакционной смеси доводят до 600 мл. Добавляют иммобилизованные клетки, полученные в примере 21, содержащие 7000 единиц активности аспартат аммоний — лиаэы, и смесь перемешивают при 37еО 4 час.

Суспензию отфильтровывают, рН фильтрата доводят до 2,8 при помощи серной кислоты, в результате выпадает аспара гиновая кислота.

608479

16

Формула изобретения

Составитель A.Áî÷àðîâ

Редакто P.Антонова Тех е Э.Ч ик Ко екто A. Лакида

Заказ 2675/21 Тираж 559 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Ра сная наб.

4 5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Способ иммобилизации микробных

Клеток, о т.л и ч а ю шийся тем, что, с целью обеспечения стабильности системы и предотвращения потери ак, тивности микробные клетки подвергают взаимодействию с полимером, содержащим реакционноспособные группы или с . полимеризуеьым этиленненасыщенным мо-: номером, содержащим реакционноспособиые группы для образования ковалентных связей между микробными клетками и водонерастворимыми частицами полимерной матрицы.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что применяют исходные соединения, содержащие заместители, такие как эпоксидные группы, галоид-карбонильные группы и галоидметилкарбонильные группы. 20

3. Способ по п.1 или 2, о т л и— ч а ю шийся тем, что применяют микробные клетки, содержащие один иэ ферментов, включая оксидаэу глюкозы, ацилаэу пенициллина, фенилаланин ам- ß6 монийлиазу, аспартат аммонийлиазу.

4 ° Способ по пп.1-3, о т л и ч а юшийся тем, что,микробные клетки подвергают обработке полифункциональным реагентом, образующим поперечные связи.

5. Способ по п.4, о т л и ч а ю— шийся тем, что обработку реагентом, образующим поперечные связи проводят до реакции образования ковалентных связей с полимером или мономером, 6. Способ по п,5, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве реагента для образования поперечных связей берут глутаровый альдегид.

7. Способ по п;6,, о т л и ч а юшийся тем, что микробные клетки подвергают взаимодействию в водной среде с глутаровым альдегидом, затем в водной среде с глицидилметакрилатом для образования ковалентных связей и затем мономер полимеризуют в присутствии М, Н -метилен-бисакриламида и диметиламинопропионитрил персульфата аммония.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

j.riot e c h n of. S i o e n g т. 15, 565, 1973.