Способ получения фракций нуклеиновых кислот

 

Союз Советскик,Социалистических

Респубпик о|1638599

К АВтОРСКОМ СВИДКтГЛЬСтМ (63) Дополнительное к авт. саид-ву(22) Заявлено 110877 (2l) 2506145/23-04 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (43) Опубликовано 25.1278. Бюллетень ¹ 47 (45) Дата опубликования описания 28.12,78 (51} М. Кл.

С 07 Н 21/00

ГосударСтвенный комитет

Совета Мнннстров СССР ао делам нзобретеннн н открытий (53) УДЫ 547 963.3 (088. 8) Л.С,Попов (72} Автор изобретения

Московский ордена Ленина и ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет им. М.B.Ëoìoíîñoâà (73} Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИЙ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЛОТ

Изобретение относится к усовершенствованному способу получения Фракций нуклеиновых кислот — нативных биохимических препаратов, которые могут быть использованы в биохимии, вирусологии, биофизике и медицине.

Известен способ получения дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) и рибонуклеиновых кислот (РНК) путем пропускания смеси нуклеиновых кислот 10 через колонку с бензоилированной диэтиламиноэтилцеллюлозой (ДЭАЭ- целлюлозой) с последующей элюцией линейным градиентом NaC(, от 0,3 до 0,65 И в смеси с градиентом диметилсульфоокси- >5 да от 0,1 до 25 об.Ъ fl) . Недостат-. каь.и этого способа являются плохое деление ДНК на Фракции и использование дефицитного реактива — диметилсульфооксида.

Известен также способ получения фракций ДНК путем пропускания раствора ДНК через колонку с бензоилированной ДЭАЭ-целлюлозой (БД-целлюлозой) и

25 последующей элюцией Фракций в линейном градиенте NaC(. до концентрации

1 М с использованием 1,8 кофеина(2) .

Однако при этом способе невозможно получение нативных, неденатурированных фракций ДНК, поскольку кофеин

30 дестабилизирует вторичные структуры нуклеиновых кислот, к тому же здесь используется дефицитный реагент— кофеин.

Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение качества

Фракций ДНК вЂ” получение нативных, неденатурированных фракций ДНК, Это достигается путем пропускания раствора ДНК через колонку с БД-целлюлозой и последующей элюцией смесью линейного градиента йаС с 0,1-1,5 М в боратном буфере и линейного градиента этанола в концентрации 0,1

48 об.В с дополнительной элюцией смесью раствора ИаСс в концентрации

1-1,5 И в боратном буфере с диоксаном в концентрации 28-30 об.t.

Пример. Фракционнрование ведут на колонке 0,8х1,5 см с БД-целлюлозой (ВоеЬг1пдв ). целлюлозу предварительно промывают раствором ИаСс в концентрации 1 И 8 боратном буфере, содержащем 30 об.Ъ диоксана, а затем боратньж буфером рН 7-7,5. Эта смесь элю« ирует полностью как нативную, так и денатурированную ДНК. На колонку наносят 5 оптических ед. ДНК, выделенной, например, из крови курицы, в боратном буфере. Элюцию фракцнй

638599

Нуклеотидный состав ДНК, фракционируемых на

БД-целлюлозе (молярные проценты) идный состав, мол.Ъ

4а Ыоэ бо>пеМ1са

Г Ц (А

21,8 21 4 28,1 28,7 43,2 19,4 18,9 30,6 31,1 38 3

23,0 23,8 26,3 26,9 46,8 21,9 22,8 27,3 28,0 44,7

22,1 45,0 20,8 21,0 29,9 28,1 41,8

1 Фракция

2 Фракция

Исходная

Формула изобретения

Составитель Л.Никулина

Редактор Т.Клюкина Техред К.Гаврон Корректор Л.Веселовская

- Заказ 7222/17 Тираж 517 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров- СССРпо делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул. Проектная, 4 проводят линейным градиентом ИаСР от, 0,1 до 1,5 М с одновременным наложением линейного градиента перегнанного этанола от 0,1 до 48 об.Ъ.

Объем градиента составляет 100 мл.

Скорость элюции 1 мл/мин. Профили ,элюции регистрируют с помощью проточного УФ-денситометра (Уч со и 2 ЬКЦ ).

Для полного выделения второй фракции проводят дополнительную элюцию 5 мл смеси 1 М КаСР в боратном буфере, содержащем 30 об.Ъ диоксана. Далее проводят освобождение фракций от 10

Согласно таблице, равенства А=Т и Г=Ц указывают на нативность выделен-

30 них фракций. Для Фракционирования используют препараты ДНК с высоким гиперхромизмом 35-39%, т.е. нативную.

Способ получения фракций нуклеиновых кислот путем пропускания раствора дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК) через колонку с бензоилированной диэтиламиноэтилцеллюлозой с последующей элюцией фракций в линейном градиенте йаСР,О т л и ч а ю шийся тем,что,с целью упрощения процесса и улучшения качества фракций ДНК, элюорганических растворителей путем выпаривания на ротационном испарителе.

Для освобождения от солей проводят диализ против дистиллированной воды и необходимого буфера или осаждают

Д1Щ этанолом.

Нуклеотидный состав ДНК определяют хроматографией гидролизатов (86% НСООН, 175 С, 30 мин) на бумаге ватман 9 1 и в тонком слое целлюлозы (FЙЭ). Получают две фракции нативной ДНК, отличных по нуклеотидному составу. цию проводят смесью линейного градиента концейтраций NaCE 0,1-1,5 N a бо ратном буфере и линейного градиента этанола в концентрации 0,1-48 об.% с дополнительной элюцией смесью раствора ИаСР с концентрацией 1-1,5 М в боратном буфере с диоксаном с концентрацией 28-30 об.В.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1.У.Ф.Seclat, R.В.КеИ, Р.Ь.Ь1пз) еНпе, "FãàñÎîïÌ îâ of пс>сРе с ас1d onЪепLO toted — naphthohtated ЗЕАЕ-сеИоРозв "7. МоР.

ВюЮ. 26, р. 537-540, 1967 °

2 N.A. СоИЫ, А.С, Мас1йпРсп "Fractiona 1с>п of ЭИА on ЪЕп7О РЫЕ4 DAE-сеИоРозе

МаГ,.Biochem.,63, р 442-464 (19 i5 ).