Способ получения иммобилизованных ферментов

 

1i ii 644760

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Саюа Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 18.10.76 (21) 2414105/23-04 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 30.01.79. Бюллетень № 4 (45) Дата опубликования описания 30.01.79 (51) M:Кл.

С 07G 7/02//

А 61К 37/48

Государственный комитет (53) УДК 577.15.07 (088.8) по делам изобретений и открытий

ФЕРМЕНТОВ

У ЫК „, I, Настоящее изобретение относится к способу получения иммобилизованных ферментов, в частности к способу получения иммобилизованных ферментов углеводного обмена, которые могут найти применение при промышленном получении глюкозы из крахмала и инвертного сиропа.

В литературе описано большое число способов получения им мобилизованных ферментов (1). Несмотря на это обстоятельство поиски оптимальных в промышленном отношении носителей и способов иммобилизации продолжаются. С технологической точки зрения наиболее оптимальными являются неорганические носители. Разработаны различные способы активации этих носителей для последующей иммобилизации на них белков-ферментов (1). Однако эти способы обычно трудоемки и часто активность иммобилизованных ферментов невысока.

Известен, например, способ получения иммобилизованных ферментов (2) путем ковалентного связывания ферментов с неорганическим носителем, активированным кремнийорганическими соединениями общей формулы: где У вЂ” радикал, содержащий амина-, карбонильную, карбоксильную, оксифенильную или сульфгидрильную группы; R — алкоксиили фенокси-радикал, галоген; п= 1 — 3, В этом способе активированный носитель не имеет функциональных групп, способных

5 непосредственно взаимодействовать с функциональными группами белка с образованием устойчивой ковалентной связи. Для образования такой связи требуется или дополнительная активация функциональных

10 групп носителя перед иммобилизацией, или иммобилизацию проводят в присутствии сшивающих агентов.

Целью описываемого способа является устранение недостатков известного способа, 15 т. е. упрощение процесса иммобилизации и повышение активности иммобилизованных ферментов. Указанная цель достигается за счет того, что иммобилизацию ферментов проводят на неорга|ническом носителе, акти20 вированном 7-глицедоксипропилтриэтоксисиланом (с н o) s (cH ) осн ..н сн

253252 2

< 0

Силанизированный носитель содержит активные эпоксидные группы, способные непосредственно взаимодействовать с функциональными группами белка. Иммобили30 зацию белка обычно осуществляют при зна644760

3 чениях рН, близких к рН-оптимуму действия ферментов; это способствует сохранению активности ферментов и при температуре 20 — 40 С,, что значительно сокращает время иммобилизации. 5

Согласно изобретению, описывается упрощенный способ получения иммобилизованных ферментов, обладающих высо îé активностью, Способ заключается в том, что ферменты иммобилизуют на неорганических носителях, активированных предварительно у-глицедоксипропилтриэтоксисил аном.

Предпочтительно процесс проводят следующим образом, 15

1 стадия — активация носителя. Неорганический носитель обрабатывают 2,5—

10 -ным . раствором у-глицедоксипропилтриэтоксисилана в апротонном растворителе. Активированный носитель промывают 20 апротонным растворителем и сушат. Лктивированный носитель суспендируют в растворе фермента при значениях рН, близких к рН-оптимуму действия иммобилизуемого фермента, и проводят иммобилизацию при 25

20 — 40 С. После промывки буфером и водой определяют активность иммобилизованного фермента. За единицу активности глюкоамилазы принято количество фермента, производящего 1 мкмоль глюкозы за 1 мин 30 при гидролизе 1 /о-ного раствора крахмала (0,1 М ацетатный буфер, рН 4,7, 30 С). За единицу активности глюкозооксидазы принято количество фермента, производящего

1 мкмоль Н О за 1 мин при инкубации в 35

Зо/о-ном растворе глюкозы (0,1 М ацетатный буфер, рН 5,6, 30 С). Активность определяли титрометрическим методом или по убыли глюкозы. За единицу активности инвертазы принимают количество фермента, 40 которое превращает 1 мкмоль сахарозы в глюкозу и фруктозу за 1 мин при ипкубации в 7 /О -ном растворе сахарозы (01 М ацетатный буфер, рН 4,7, 30 С).

Пример 1. К 10 г силохрома С-80 при- 45 бавляли 30 мл 2,5 /о (об.) раствора у-глицедоксипропилтриэтоксисилана в ацетоне и оставляли в контакте на 15 мин; затем избыток жидкости сливали, а силохром высушивали при 100 С в течние 5 ч. К 0,5 г 50 модифицированного силохрома прибавляли р аствор глюкозооксидазы с активностью

25 ед. в 5 мл ацетатного буфера (рН 5,6) и перемешивали на качалке при 30"С в течение 2 ч. Активность иммобилизованпой 55 глюкозооксидазы составляла 30 ед./г носителя, т. е. 60 от исходной активности.

Пример 2. Б качестве известного способа для сравнения активности иммобилизованных ферментов был взят способ им- г0 мобилизации, описанный в прототипе (2).

Смесь 2 г силохрома и 10 мл 10О/о-ного (об.) раствора у-аминопропилтриэтоксисилана в толуоле кипятили 10 ч, затем силохром отфильтровывали, промывали ацето- 65

4. ном и высушивали на воздухе. К 2 г полученного силохрома прибавляли 1 г и-нитробензойной кислоты и 10 мл 10О/о-ного дициклогексилкарбодиимида в тетрагидрофуране и перемешивали в течение 2 суток при комнатной тсмпературе. Силохром отфильтроьывали, примывалн горячим метанолом (200 мл) и водой, а затем прибавляли 5 г дитиопита натрия в 500 мл воды. Смесь кипятили 0,5 ч, затем силохром промывали водой, ацетопом и высушивали.

К 1 г полученного силохрома прибавляли

10 мл 0,1 н. раствора iC1 и после охлаждения до 6 С порциями прибавляли 50 мг нитрита натрия. Затем силохром промывали холодной дистиллированной водой, прибавляли 10 мл охлажденного раствора глюкозооксидазы (50 ед.) и перемешивали при

6 С втечение ночи. Активность иммобилизованной глюкозооксидазы 24,6 ед., что составляет 50 /о от исходной активности. Таким образом, применение способа, согласно изобретению, позволяет получить иммобилизованную глюкозооксидазу с активностью па 10О/о больше, чем по способу, описанному в прототипс.

Пример 3. К 0,5 г силохрома, активированного у-глицедоксипропилтриэтоксисиланом, согласно примеру 1, прибавляли

5 мл раствора инвертазы с активностью

400 ед. в ацетатном буфере с рН 4,5 и перемешивали 2,5 ч при 30 С. Активность иммобилизованной инвертазы 656 ед/г носителя, что составляет 82 /о от исходнбй активности.

Для сравнения проводили иммобилизацию инвертазы по методике, описанной в прототипе. Активность полученного иммобилизованного препарата инвертазы 496 ед/г носителя, что составляет 62 от исходной активности. Таким образом, способ, соглас= по изобретению, позволяет получать препарат иммобилизованной инвертазы с активностью на 20 /о больше, чем по известному способу.

Пример 4. К 10 г силохрома, активированного у-глицедоксипропилтриэтиоксисиланом, согласно примеру 1, прибавляли

10 мл раствора глюкоамилазы с активностью 200 ед. в ацетатном буфере с рН 4,7 и перемешивали 2 ч при 40 С. Активность иммобилизованной глюкоамилазы 280 ед/г носителя, что составляет 70% от исходной активности.

Для сравнения проводили иммобилизацию глюкоамилазы по методике, описанной в прототипе. Активность иммобилизованной глюкоамилазы 60 ед/г носителя (активность нативного фермента 100 ед.), что составляет 60 /о от исходной активности. Таким образом, способ согласно изобретению позволяет получить им мобилизованную глюкоамилазу с активностью на 10 /о выше, чем по известному методу.

644760

Формула изобретения

Составитель А. Бочаров

Редактор В. Минасбекова Техред Н. Строганова Корректор Е. Хмелева

Заказ 2701/9 Изд. № 138 Тираж 520 Подписное

НПО Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

1!3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

1. Способ получения иммобилизованных ферментов путем ковалентного связывания ферментов с неорганическим носителем, активированным органосиланом, отл ич а ющи и с я тем, что, с целью упрощения процесса иммобилизации и повышения активности иммобилизованных ферментов, в качестве орта носил ана используют у-глицедоксипропилтриэтоксисилан.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для активации носителя используют 2,5 — 10% -ный раствор у-глицедоксипропилтриэтоксисилана.

3 Способ по п. 1, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят при значениях рН, близких к рН-оптимуму действия ферментов.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что иммобилизацию проводят при 20—

40 С.

5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют глюкоамилазу.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют инвертазу.

7. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве фермента используют гл юкозооксидазу.

10 8 Способ по п, 1, отличающийся тем, что в качестве неорганического носителя используют силохром.

9. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве неорганического носи15 теля используют силикагель.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Иммобилизованные ферменты, Т. 1, 2.

Ред. И. В. Березин, В. К. Антонов и

20 К. Мартинек. МГУ, 1976.

2. Патент США № 3519538, кл. 195-63, опубл, 1970 (прототип).