Способ получения @ -лизина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА путем культивирования его продуцентов не питательной среде, содержащей источники углерода, азота и не- . обходимые питательные соли, при аэрации среды, перемешивании и поддержании заданного значения рН с последующим выделением L-лизина, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода L-лизина, в процессе ферментации, начиная с 16 по 30 час культуральной жидкости определяют концентрацию молочной кислоты или активность лактатдегидрогеназы, при этом при определении концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости и достижении ее 0,3 - 0,5 мас.% или при определении активности дактатдегидрогеназы и достижении ее 10-30 уд. ед. доводят рН культуральной жидкости до заданного значения путем регулирования количества подаваемого воздуха и перемешивания.S(Лff>&05 9Stэо*sj4^

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (I9) (Ill !

SU (1)4 С 12 Р 13/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2384315/28-13 (22) 05.07.76 (46) 23.10.85, Бюл. 39 (72) И.П.Руклиша, А.К.Саксе, У.Э.Виестур, P.À.Õåëìàíèñ, С.Э.Селга, Я.Я.Лаукевиц, А.К.Седвалдс, Я.Б,Лиепа, E.Ô.Ðåéèáàõà, Г.А.Удровский, В.M.Hîãäàíîíè÷, А.А.Лацарс и И.У,Датава (71) Институт микробиологии им. Августа Кирхинщтейна АН ЛатвССР (53) 668.394(088.8) (56) 1. Патент Англии У 1398337, кл. С 6 F опублик. 1975.

2. Авторское свидетельство СССР

У 413183, кл. С 12 В 1/08, 1971. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Ь-ЛИЗИНА путем культивирования его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые питательные соли, при аэрации среды, перемешивании и поддержании заданного значения рН с последующим выделением L-лизина, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода L-лизина, в процессе ферментации, начиная с 16 по

30 час культуральной жидкости определяют концентрацию молочной кислоты или активность лактатдегидрогеназы, при этом при определении концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости и достижении ее

0,3 — 0,5 мас.X или при определении активности,лактатдегидрогенаэы и достижении ее 10 — 30 уд. ед. доводят рН культуральной жидкости до заданного значения путем регулирования количества подаваемого воздуха и перемешивания.

666874

Изобретение относится к микробиологической промьппленности и может быть использовано для управления процессом получения лизина, Известен способ управления процес- 5 сом биосинтеэа Ь*лизина, при котором рН среды поддерживают в заданных пределах в зависимости от концентрации,анионо-органической кислоты, например уксусной. рН среды регулируют вводом в нее углекислого газа или бикарбоната натрия (1) .

Наиболее близким иэ известных способов к изобретению является способ получения лизина, заключающийся в том, что получают L-лизин путем культивирования его продуцентов на питательной средне, содержащей источники углерода, азота,и необходимые питательные соли при аэрации среды,:перемешиванйи и поддержании заданного значения рН с последующим выделением лизина (2) .

При регулировании процесса в ста- дии образования биомассы в фермента- 25 торе условия близки к полному перемешиванию и регулирование no pOg при концентрации кислорода 30 — 40< насыщения обеспечивает достаточно точное регулирование по всему an- ЗО парату, но в стадии биосинтеза при насыщении кислородом 5 — 1" в аппарате уже не обеспечиваются условия полного перемешивания и нельзя однозначно установить значения рО по всему объему, что является недостатком этого способа.

Недостаток кислорода в клетках переключают метатолизы углеводов от аэробного процесса на анаэробный ° В результате этого под действием лактатдегидрогеназы образуется молочная кислота, Таким образом метаболиты углеводов не включаются в цепь синтеза лизина, а используются на обра- 5 зование побочных метаболитов, например молочной кислоты.

Целью изобретения является повышение точности управления процессом получения лизина, а также увеличение выхода целевого продукта, Поставленная цель достигается тем, что по предложенному способу в процессе ферментации, начиная с 16 по

30 час в культуральной жидкости определяют концентрацию молочной кислоты или активность лактатдегидрогеназы, в клетках продуцента при этом

Кукурузный экстракт

1040 кг (при содержании 50Х сух.вв.) при определении концентрации молочной кислоты в культуральной жидкости и достижении ее 0,3 — 0 5 мас.Х или при определении активности лактатдегидрогеназы и достижении ее 10—

30 уд. ед. доводят рН культуральной жидкости до заданного значения путем регулирования количества подаваемого воздуха и перемешивания.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве продуцента L-лизина используют микроорганизмы Bzevabacterium или Micrococcus.

После выращивания культуры в посевном ферментаторе дальнейшее культивирование проводят в производственных ферментаторах на углеводной питательной среде, например мелассной.

При ферментации во время роста продуцента рО поддерживают на уровне

20 — 252 насыщения..Начиная с 16 ч определяют концентрацию молочной кислоты в культуральной жидкости или активность лактатдегидрогенаэы в клетках продуцента. При достижении концентрации молочной кислоты

0,3 — ".,5 мас.Х или активности лактатдегидрогенаэы 10 — 30 уд. ед., в результате чего снижается значение рН, повышают интенсивность аэрации и перемешивание до достижения рН

7,4 — 8,0.

На 3 ) — 36 часу при резком сниже нии рН его поддерживают добавлением аммиачной воды или мочевиной с таким расчетом, чтобы концентрация азота не превышала 0,2 — 0,4 мас,X.

После окончания культивирования из культуральной жидкости выделяют Lлизин известными методами или получают кормовой концентрат лизина.

Hp и м е р 1. Исходную культуру

Brevibacterium sp 22 ЛД размножают вначале на агаровых косяках, затем в колбах на качалке и в посевном ферментаторе. Затем посевной материал передавливают в производственный ферментатор емкостью 5000 л со стерильной средой 32000 л. Питательная среда имеет следующий состав:

Меласса 6500 кг (при содержании сахара

46 мас.7) 666874 4

7,0 увеличивают число оборотов мешал. ки нли расход аэрирующего воздуха до достижения рН 7,4 — 7,8 м парциального давления кислорода 25Х насыщения. После 30 — 36 часа ферментации рН поддерживают аммиачной водой.

На 54 часу ферментации культуральная жидкость содержит L-лизина 38 г/л, биомассы продуцента L""ëèçèíà 19 г/л,:

10 концентрация сухих веществ в культуральной жидкости 15 0 мас.Х, остаточные сахара 0,6 мас.Х, молочная кислота 0,3% °

Пример 3. В качестве продуцента используют культуру Brevibacterium 22. Ферментацию осуществляют в ферментаторе емкостью 15 л на среде следующего состава:

Меласса 1,52 кг (при со20 держании сахара 46 мас.Х), Кукурузный экстракт

0,25 кг (при сод. 50Х вес сух. в-в) 5 r

В начале ферментации аэрация 0,8

1 объем воздуха /объем культуральной жидкости, обороты мешалки

400 об/мин, расход воздуха и интен55 сивность перемешивания постепенно увеличивают до 1 : 1 и 800 об/мин к

8 часу ферментации, рОа поддерживают на уровне 20 — 257 насьпнения. РегуАммоний хлористый 700 кг

Аммоний фосфорнокислый двухэамещенный 30 кг

Вода До 32000 л

Ферментацию проводят при 31 +

+ 1 С, в стадии роста рН среды поддерживается в пределах 6,8 - 7,8 рΠ— на уровне 22% насыщения. На

16 часу культивирования определяют активность лактатдегидрогеназы в клетках продуцента. Активность

22 уд. единиц, рН снижалась до 7,0, Увеличивают расход воздуха на 5Х, рН устанавливается 7,6 и не меняется, через 3 часа культивирования опять определяют активность лактатдегидрогеназы — активность 6 уд. ед.

Объем воздуха остается прежним.

В дальнейшем активность лактатдегидрогеназы определяют через каждые 3 ч культивирования. При увеличении активности лактатдегидрогена- 25 зы увеличивают расход воздуха или интенсивность перемешивания, поддерживая рН на уровне 7,4 — 8,0 и рОу. на уровне 20 — 257. насыщения. Начиная с 36 часа культивирования рН

30 среды поддерживают добавлением аммиачной воды.

Во время ферментации при достижении величины PB 57 добавляют стерильную массу в расчете 2 мас.X по РВ

35 и продолжают ферментацию до полного использования редуцирующих веществ.

На 54 часу ферментации культуральная жидкость содержит L-лизина 39 г/л, биомассы продуцента L-лизина — 20 г/л концентрация сухих веществ в культуральной жидкости 14,6 мас.7, остаточные сахара — 3,75Х, молочная кислота — О,?X. После окончания ферментации культуральная жидкость обрабатывается одним из известных способов.

Пример 2, В качестве продуцента L-лизина используют микроорганизмы Nicrococcus glutamicus Т-З.

Культивирование ведут на среде, 5О аналогичной примеру 2. В качестве стимуляторов роста используют гидролизат белково-витаминного концентрата.

Активность лактатдегидрогенаэы определяют начиная с 16 часа культивирования. При превышении активности 10 уд. ед. и снижении рН до

Сульфат аммония 150 г

Фосфат аммония двузамещенный

Карбонат кальция 25 г

Подсолнечное масло 30 мл

На 4,6 л среды вносят 0,4 л посевного материала, т.е. BX объемных с содержанием биомассы 18 г/л. Содержание PB в начале ферментации 12 Mac.Х, рН вЂ” 6,8, температура + 31 «+ t С.

Во время роста продуцента роа поддерживают на уровне 20% насыщения. На

8 часу рН увеличивается до величины

7,8 и поддерживают на этом уровне до 20 час аэрацией и перемешиванием.

После достижения концентрации PB в культуральной жидкости 5% производят периодическое добавление источника углерода (мелассы, уксусной кислоты, сахарозы, спирта, двойной соли гл козы).

666874

Редактор Л.Утехина Техред 3.Палий Корректор И.Эрдейи

Заказ 7022/2 Тираж 524 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ПТШ "Патент" г.ужгород, ул.Проектная, 4 лярно каждые 3 ч определяют концентрацию молочной кислоты и по ней судят об активности лактатдегидрогеназы, При достижении концентрации молочной кислоты в среде 0 4 мас.7., что соответствует увеличению активности лактатдегидрогеназы в клетках

16 уд. ед, увеличивают интенсивность аэрации и перемешивания. При продолжении ферментации, в частности, после добавления источника углерода, р0 снижается до 3 — 5X насыщения, рН уменьшается до 7,0, активность лактатдегидрогеназы увеличивается

qo 50 уд. ед, и активность биосинтеза Ь-лизина падает от 0,09 г/л ч до 0,05 г/л/ч на 1 г биомассы. При этОм gвеличивают аэрацию до 1,2 в

1, активность лактатдегидрогеназы уменьшается до 6 уд, ед. и активность биосинтеза увеличивается до

0,09 г/л/ч на 1 г биомассы.

После 30 часа ферментации рН поддерживают 303-ным раствором мочевины, которая одновременно служит источником азота.

Во время ферментации определяют содержание азота, содержание которог6 не должно превышать 0,2—

0,4 мас.X.

1Î К 60 часу ферментации культуральная жидкость содержит I.-лизин 56 г/л, биомассы продуцента 24 г/л, концентрация сухих веществ 18 мас.Х, остаточные сахара — 0,9 мас.X молочная

15 кислота - 0 1Х.

Предлагаемый способ позволяет увеличить выход L-лизина на 307 за счет снижения количества побочных продук" тов метаболизма и сократить общее

20 время ферментации на 10 — 16 ч. При использовании способа повысился экономический коэффициент биосинтеза

1.-лизина.