Способ получения иммобилизованных биокатализаторов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

С щиалистичесмих

Республик

<" 697521

Ф б

1 "- 14» Й ы Йй)"" . (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 120777 (2! ) 2505482/23-04 с присоединением заявки Ж— (23) Приоритет— (З1) М. Кл.

С 07 G 7/02//

A 61 К 37/48

Государствеииый комитет

СССР по делам изобретеиий и открытий (53) УДК 577.15.

° 07 (088. 8) Опубликовано 15.1179, Бюллетень Йо42

Дата опубликования описания 15,1179

A.И.Кестнер, М.О.Мандель, И.В.Березин, В.И.Яковлева, Н.Н.Зуева, И.А.Хинт и Л.С.Ванаселья

{72) Авторы изобретения

Таллинский политехнический институт, Московский ордена

Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им.M.B.Ëoìoíoñoâà и Специальное конструкторскотехнологическое бюро Деэинтегратор (71) Заявители (5 4 ) СПОСОБ ПОЛУЧЕН ИЯ ИММОБ ИЛИЗОВА ННЫХ

Б ИОКАТАЛИЗАТОРОВ

Изобретение относится к технологическим процессам биохимического превращения органических веществ и может найти применение в микробиологической, химической и медицинской промышленности.

Известно применение биоорганических катализаторов, в частности иммобилизованных ферментов или ферментных систем, для превращения органических веществ, необходимых для медицинской,химической и пищевой отраслей промышленности.В этих целях нередко используется иммобилизация не только отдельных ферментов,а также целых интактных клеток микроорганизмов

Иммобилизация клеток микроорганизмов дает возможность устранить сложные з дорогостоящие процессы выделения и очистки исходных ферментов, и проводить сложные ферментативные реакции одностадийным процессом.

Чаще всего иммобилизацию клеток осуществляют включением активной 25 клеточной культуры в полиакриламидный гель путем совместной полимеризации акрильных мономеров с клетками микроорганизмов. ДанньФ метод широко примене для иммобилизации клеток микроорганизмов с различной ферментативной активностью. Например, таким способом получены иммобилизированныд клетки, обладающие глюкоэооксидаз ной (1 ) или аспартаэ ной акт ивностью (2) .

ОДнако применение биокаталиэаторов такого типа в технологических установках в непрерывных процессах часто затруднено из-за недостаточных гидродинамических показателей биокатализаторов, полученных путем включения клеток микроорганизмов в мягкие гидрогели, в частности полиакриламидные. Применяемые гели, например полиакриламидный, во время длительной эксплуатации набухают, а под действием гидростатическогЬ давления слой катализатора уплотняется. Эти явления приводят к резкому увеличению гидравлического сопротивления массы катализатора в установке закупорки систем, что затрудняет поддержание требуемого режима в установке.

Известен способ получения иммобилиэованных биокатализаторов путем включения биокаталиэатора в армированный неорганическим скелетом гидрогель. Исходными компонентами реак697521

40 ционной смеси являются ферментный белок, 7-).2%-ный полиакриламидный гель с соотношением акриламида к метиленбис. криламиду 19: ). до 18: 2 и инициаторы, например тетраметилэтилендиамин, котор лли пропитывают пористый неорганический материал типа силохрома (3) . После осуществления полимеризацио нного процесса частицы с ферментативной активностью находят применение в технологических процессах в колонках различного типа. При этом неорганический скелет катализатора обеспечивает необходимую механическую прочность материала и тем самым долговечность применения.

Недостатком данного способа является черезвычайно низкая эффективность процесса иммобилизации ферментативно акт: в и-х клеток микроорганизмов или их фрагментов. Обычные пористые носители, применяемые для иммобилизации ферментов и могущие быть неорганической основой для получения армированных катализаторов, обладают мелкими порами, и впитывание микроорганизмов в эти поры невозможно, а увеличение размеров пор приводит к снижению прочности материалов и не позволяет получить армированные катализаторы с необходимыми эксплуатационными свойствами с помощью органических материалов.

Целью изобретения является упрощение процесса и улучшение эксплуатационных свойств получаемого биокатализатора.

Поставленная цель достигается применением такorо носителя, в котором крупные поры сочетаются с достаточной механической прочностью и устойчивостью в водной сРеде. При этом иммобилизованные биокатализаторы получают путем включения клеток Е.coIi в качестве биокатализатора в армированный неорганическим скелетом, в качестве которого применяют измельченный силикальцит с диаметром частиц 0,1-1,2 мм, обработанный раствором однозамещенного фосфата натрия с последующей термической обработкой при 110-150 C в течение 1-15 час, 7-12%-ный полиакриламидный гель с соотношением акриламида к метиленбисакриламиду

19:1 до 18:2.

Силикальцит, применяемый в качестве строительньх материалов, содержит довольно много свободной извести, которая в водной среде сдвигает РН среды в щелочную сторону и вымывание которой уменьшает прочность материала. При обработке ячеистого силикальцита и подобных материалов растворами фосфорнокислых солей при

110-150 С в течение 1-15 час на внутренней поверхности материала образуется слой фосфорнокислого каль5

25 ,0

65 ция. Это снижает вымываемость свободной извести без уменьшения разме ра пор, но закрепляет структуру исходного материала. Обработанный таким образом силикальцит может долгое время храниться перед применением его для получения биокатализаторов из ферментативно активных клеток, мономеров и инициаторов полимеризационного процесса.

Сравнение работы полученных армированных биокатализаторов с работой колонок с клетками, иммобилизированными в неармированном поли-акриламидном геле, показывает, что армированные гели обладают более высокой аспартазной активностью чем свободные клетки. Кроме того, колонка, заполненная биокаталиэатором, полученным на основе армированного силикальцитом полиакриламидного геля, работает непрерывно в течение двух недель без изменения гидродинамических свойств и скорости протекания субстрата, а также без снижения производительности.

Получение препаратов с иммобилизованными микробными клетками, обладакщих аспартазной активностью, а также применение полученных препаратов для превращения фумарата аммония

-в аспаргиновую кислоту поясняется следующими примерами.

Пример 1. В качестве ферментативно активного материала используют суспензию клеток Е.coIi с аспартазной активностью. Клетки Е.roIi выделяют из культурной среды и промывают водой с последующим центрифугированием в течение 10 мин при

9000 g» Суспензия клеток микроорганизма содержит 14,9 мг белка в 1 мл, имеет удельную аспартазную активность

211 ец. на 1 мг белка за 1 час. В качестве носителя используют пеносиликальцит с объемным весом 0,9 т/м, удельной поверхностью .140 м /г, удельным объемом пор до 0,27 смэ/г и размером частиц 0,1-1,2 мм. Исходный материал обрабатывают 20 о-ным водным раствором ИаН РО+ в течение 3 час, соблюдая соотйошение 2 мл/г, операцию обработки проводят еще 2 раза.

Образуемый осадок фосфатов кальция отделяют декантированием, а обработанный носитель промывают дистиллированной водой в соотношении 10:1 (носитель-вода) и высушивают при

110 С в течение 12 час, а затем о прогревают при 150 С в течение 2 час.

Реакционную смесь для иммобилизации клеток микроорганизма готовят из З,б мл описанной суспензии клеток

E.coli, 1,0 мл 50%-ного раствора мономеров (соотношение ак риламида к метиленбисакриламиду 19:1), 0,1 мм

20Ъ-ного раствора надсернокислого аммония, О, 1 мл 50Ъ-ного раствора

697521 тетраметилэтилендиамина и 300 мг кристаллической калиевой соли аспаргинойой кислоты. При помощи полученной реакционной смеси пропитывают.

5,5 г гранул обработанного сухого силикальцита. Пропитку проводят при

8-10 С. После выдержинания в течение 10-15 мин для завершения полимеризационного процесса полученный блок с гранулами силикальцита фрагментируют и промынают 100 мл дистиллированной воды. Готовый сырой катализатор (10 г) н виде армированного полиакриламидного геля с включенными клетками микроорганизма обладает удельной аспартазной активностью

289 ед. на 1 мг белка за 1 час, а обшей — 4400 ед., что составляет 53Ъ от исходной общей активности, внесенных при иммобилизации свободных клеток Е.coIi.

Пример 2. Используют суспен- 2О зию клеток и носитель, описанные в примере 1. Для иммобилизации клеток микроорганизма применяют следующий порядок операций:60 г силикальцита пропитывают 25 мл суспензии клеток с 25 добавкой 3,0 г кристаллической калиевой соли аспаргивной кислоты.Пропитанные суспензией клеток гранулы силикальцита охлаждают до 8-10 С и до- о бавляют 22 мл полимеризационной смеси )P полученной смешиванием 10 мл 50Ъ-ного раствора мономеров, содержащего акриламид и метиленбисакриламид в соотношении 19: 1 соответственно, 9, 0 мл и 0,1 М фосфатного буфера (рН 8,0) и 3,0 мл 10Ъ-ного тетраметилэтилендиамина.

Последний компонент н качестве инициатора полимеризации (надсернокислый аммоний -3,0 мл 10Ъ) добавляют непосредственно перед пропиткой силикальцита указанной смесью. Пропитанный раствором носитель обрабатынают, как описано в примере 1.

Получают 113,8 г катализатора, об- 45 щая аспартаэная активность которого

59.255 ед., что составляет 89Ъ от исходной общей аспартазной активности внесенных свободных клеток. Удельная аспартазная активность иммобилизованных н армированный силикальцитом полиакриламидный гель на 69Ъ выше, чем исходных свободных клеток.

Пример 3. Биокатализатор, полученный по примеру 2 и имекщий удельную аспартазную активность

55 ед. на 1 мг белка за 1 час сразу после получения, высушивают при 6 С до воздушно-сухого состояния. Из

40 r влажного катализатора получают 27,6 r сухого материала, его 60 хранят н сухом виде в закрытых скляно ках в холодильнике при 6 С в течение

60 дней. После выдерживания к 6,9 г материала добавляют 0,1 М фосфатный буфер до общего объема 15 мл и после 65 набухания гранул носителя в течение

20 мин определяют -аспартазную активность. Удельная аспартазная активность препарата 54 ед/мг белка, что "îñòàâляет 98Ъ от активности перед высушиванием.

П. р и м е р 4. 70 г катализатора, полученного по примеру 2, помещают в стеклянную колонку размерами

Зх10,5 cM, r.íàáæåííóþ водяной рубашкой. Колонку термостатируют при 37 С и пропускают через нее 1М раствор фумарата аммония (рН 8,5) со скоростью 30 мл/час. Элюат, вытекающий из колонки, по данным анализа содержит 90 мг/мл аспаргивной кислоты и 7,4 мг/мл фумаровой кислоты, что соответствует степени конверсии

82Ъ. К 1 л элюата добавляют 140 мл концентрированной серной кислоты.

Выделяющиеся кристаллы аспаргинной кислоты отделяют фильтрованием, промывают холодной дистиллированной водой и этиловым спиртом, а затем высушивают на воздухе. Получают 85 r аспаргивной кислоты, которая по полярографическому анализу имеет (0)

СФ+ 21,4, что соответствует 87Ъ содержанию аспаргивной кислоты н о(-форме. т.пл. 270 С и элементарный состав,Ъ: С 36,41, Н 5,28 и N 9,43, что близко к теоретическим значениям.

Колонку с гранулами биокатализатора используют для непрерывного протока 1 М фумарата аммония в течение

15 суток. При этом скорость протекания реакционной смеси через колонку уменьшается лишь на 10Ъ, а работоспособность колонки, определяемая по синтезу целевого продукта с .-аспаргиноной кислоты, не меняется.

Данный способ позволяет получить биокатализаторы более эффективным методом для осуществления процессов превращения химических веществ непрерывными методами. Включение клеток микроорганизмов при полимериэации акриламидного геля н порах макропористого неорганического носителя позволяет получать дешевый и технологически удобный биокатализатор.

Армированные неорганическими носителями гидрогели с иммобилиэованными клетками микроорганизмов могут быть длительно использованы без ухудшения гидродинамических показателей в непрерывных процессах получения различных природных соединений. Кроме того, полученный катализатор можно высушить и хранить в сухом виде длительное время, он обладает высокой гидродинамической и энзиматической стойкостью.

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованных биокатализаторон путем включения

697521

Составитель Г.Коннова

Редактор О.Колесникова Техред М,Келемеш KoppeKTopl0,Макареяк.

Заказ 6549/10 Тираж 513 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,д..4/5

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4 биокаталиэатора в армированный неорганическим скелетом 7-12%-ный полиакриламидный гель с соотношением акриламида к метиленбисакриламиду

19 1 до 18 2, отличающий с я тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения эксплуатационных свойств целевого продукта, в качестве биокаталиэатора используют клетки Е.coIi, а в качестве неорганического скелета — измельченный силикальцит с диаметром частиц 0,1-1,Л-мм, обработанный раствором однозамещенного фосфата натрия с последующей термичес кой обработкой йри 110-150 C в течение 1-18 час.

Источники информации, принятые во в нима ние при эксперт и зе

1. Патент ФРГ Р 2317680, кл. G А 22/04, опублик. 1973.

2. Патент ФРГ Р 2252815, кл. С 07 С 101/22, опублик. 1972.

3. Авторское свидетельство СССР

Р 530885, кл. С 07 G 7/02, 1974

1(прототип).