Способ получения аттенуированного штамма вируса

 

ООО69

ОПИСА

ИЗОБРЕТ

К ПАТЕН

Сеюз Советских

Социапистнчаских республик (61) Дополнительный к пате (22) Заявлено 2004.77(24)

{23) Приоритет — (32) (33 ) 672-840 (33) С

Опубликовано 25.11.79.Б

Дата опубликования оп

Кл.

2 К 5/00

2 К 7/00

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий 616.988 (088.8) (72) Автор изобретения

Иностранец

Чарльз Уильям Перди (СЕЮ) Иностранная фирма Н.В.Филипс Глоэлампенфабрикен (Нидерланды) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АТТЕНУИРОВАННОГО НТАИИА

ВИРУСА Equ1ne т ПтПОРПЕО ПОП1МЗ

Изобретение относится к способу получения вируса для защиты лошадей от конской ринопневмонии, Ринопневмония представляет собой острую вирусную инфекцию, которая,как. предполагается, вызывается нирусом Equine He pcs тип 1, и отличается лихорадкой, агрунлоцитозом и катаральным воспалением органов дыхания. Вирусная болезнь предрасполагает ко вторичной бактериальной инфекции, которая воздействует на различные части органов дыхания, При заражении жеребой кобылы, как правило, происходит аборт.

Ринопневмония обычно наблюдается на фермах, расположенных в районах, где сконцентрировано коневодство. Относительно равномерная картина наблюдается в центральном

Кентуки, где изучались болезни органов дыхания и причины абортов.

Заболевания органон дыхания наблюдались исключительно у молодых лошадей, либо на фермах, либо когда лошадей собирали для тренировки, В этом районе на большинстве ферм были отмечены вспышки ринопневмонии в конце или в начале- зимы, особенно в октябре, ноябре и декабре. У молодых лошадей вспышки болезни часто были связаны с отъемом и сбором в зимних помещениях. В это время кобылы не имели очевидных признаков болезни, но инфекцию можно было обнаружить с помощью серо логической реакции. Болезнь быстро распространяется в конюшне или районе тренировки и через несколько дней или недель все лошади в этой зоне заражаются.

Аборты наблюдаются в каждом месяце, кроме июля и августа. Наибольшее число абортов приходится на середину зимы и раннюю весну. Из 700 абортов, зарегистрированных в Кентуки, 15% произошло в январе, 24% — в феврале, 293 в марте и

18Ъ вЂ” в апреле. Аборт может произой» ти начиная с 5-го месяца беременности до окончания срока беременности.

Некоторые жеребята, зараженные внутриутробно, остаются живыми до конца беременности. Данные по 623 абортам показывают, что 113 абортов произошло на 8-ом месяце, 30% — на

9-ом месяце, 36% — на 10-ом месяце и 19% — на 11-ом месяце. Эти данные показывают зависимость между возрастом зародыша и временем

40

60 аборта, но период осеменения кобыл и Энэоотическая картина у молодых лошадей имеют значительное влияние на сезонное число заболеваний и возраст зародыша во время аборта °

Период инкуб ации между носовой инокуляцией и абортом составляет от трех недель до четырех месяцев, что указывает на то, что инфекция, которая приводит к аборту, совпадает с более ранним энзоотическим заражением молодых лошадей на фермах.

Вирус легко распространяется при непосредственном контакте через различные посторонние предметы и через аэролизованные выделения.

Вирус может передаваться от одной кобылы, у которой был аборт, к другой кобыле, но в большинстве эпидемий (как показывают данные) до полного аборта в течение 1 — 4 месяцев заражаются почти все кобылы.

Болезнь случается ежегодно у молодых лошадей на многих фермах, на которых не было новых лошадей, что позволяет сделать предположение

У о наличии переносчиков среди взрослых лошадей. Регулярность вспышек при сборе восприимчивых молодых лвшадей также свидетельствует о наличии носителя. Вспышки часто происходят тогда, когда восприимчивые лошади собираются для продажи во дворах, на тренировочных площадках„ скачках и в военных организациях.

Инкубационный период ERP длится от 2 до 10 суток. Первичная инфекция полностью восприимчивых лошадей проявляется в виде лихорадки и сильного выделения из ноздрей.

Температура может составить 4 1 C и лихорадка в несложных случ аях продолжается от 1 до 7 суток. Температура после полудня, как правило, выше, чем утром. Агранулоцитоз происходит параллельно с лихорадкой.

В течение первых двух суток лихорадки нейтрофилы и лейкоциты угнетаются. Лимфоциты возвращаются к нормальному уровню через 2-4 суток, а нейтрофилы — через 5-9 суток.

Потребление кормов и воды падает.

Наблюдается средняя гиперемия носовой слизистой оболочки и прощупывается Ьтек нижнечелюстных лимфатических узлов. В несложных случаях часто наблюдаются энтерит и диарея, отек ног и тендовагинит. Общая депрессия у лошадей, которые содержатся в покое, незначительная.

Все признаки обостряются при выполнении упражнений или при работе.

Полное выздоровление наступает через 1-2 недели, если не развиваются осложнения, Повторное заражение происходит через 4-5 месяцев и более. Это последующее заражение, как правь ло, бессимптомно, безлихорадочно и не дает осложнений, в частности, у взрослых лошадей на племенных фермах. Влияние повторного заражения на лошадей, участвующих в скачках или занятых на тяжелой работе, неизвестно.

Известен способ получения аттенуированного штамма вируса Equine

Ф1порпецвоп11я при проведении 3-10 пассажей в культуре клеток печени мартышки, а затем в первичных культурах клеток, полученных от овец, свиней, поросят и в перевиваемых линиях клеток, выделенных из первичных культур клеток (1), Недостатком известного способа является потеря иммуногенности вирусом.

Целью изобретения является сохранение иммуногенной активности вируса.

Это достигается тем, что вирус культивируют в перевиваемой линии клеток Веро (печень зеленой мартышки) в течение 30-60 пассажей при

23-33 С.

Модификация или ослабление морфологии или патогенности вируса осуществляется многочисленными способами. Иногда неоднократный серийных перенос в ткань хозяина ослабляет организм, серийный перенос в ткань, которая отличается от ткани хозяина, иногда приводит к ослаблению; химический шок организма, облучение, низкотемпературный перенос и цругие способы широко испольэуют"я бактериологами и вирусологами цля получения патогенно инертных организмов, который сохраняет свою способность заставлять своего хозяина образовывать антитела или клеточный промежуточный иммунитет, способный эффективно нейтрализовать болвзнетворный организм. Ослабление без потери иммуногенности живого организма совершенно непредсказуемо и действенность любого способа определяется только опытным путем.

Например, способ, пригодный для одного типа вируса, может оказаться непригодным для другого типа.

В известном способе ослабления вирулентного штамма ЕкР производится путем выращивания и размножения ринопневмонических вирусов, выделенных иэ плода зараженных лошадей, зараженных жеребят и выкидышей в, чувствительной ткани, полученной из чувствительных органов (например, печень мартышки), восприимчивых опытных животных и восприимчивых перввиваемых линий клеток, пригодных для выращивания и размножения укаэанных вирусов, при этом размножение включает от трех до десяти

700069 переносов, полное ослабление вирусов до тех пор, пока они не потеряют патогенность для лошади путем серийного переноса через первичные культуры клеток, полученных от овец, свиней и поросят и из постоянных стабильных линий клеток, .выделенных иэ первичных культур клеток.

Предполагается, что иммуногенная защита от повторного заражения вирулентным вирусом ERP не происходит, если авирулентный вирус не воспроизведет себя в животном-хозяине. Авирулентный вирус может быть извлечен и опознан после вакцинации.

Установлено, что если стабильную линию клеток из Африканской зеленой

MapTblltlKH Cenocopithecus ае1Ыорз, линия клеток Веро, инокулировать вирулентным вирусом KPB и серийно переносить в такой линии клеток при пониженной температуре, например 23-33 С, вирус становится ослабленным и невирулентным, но в то же время остается иммуногенным, т.е. при введении в лошадь-хозяина он приведет в действие свой иммунологический механизм для производства вирусных антител и получения клеточного промежуточного иммунитета. После этого животное становится стойким к последующей инфекции и иэ вакцинированного животного может быть получен вирулентный вирус, который опознается.

При использовании обычных методов серийного переноса, которые являются стандартными в данной области, было установлено, что необходимый авирулентный характер развивается беэ потери иммуногенности после примерно 30 — 60 переносов при температуре в диапазоне примерно 23 — 33ОС. Однако может быть использовано примерно 250 — 300 переносов и более.

Вакцина KRP может назначаться любому виду иэ семьи либо внепарентерально, либо внутрипарентерально.

Вакцина в жидком виде может вводиться в ноздри, внутриглазно, внутримышечно, внутривенно, внутрибрюшинно и т.д. В виде сухого порошка вакцина может назначаться внепарентврально. Как правило, вакцины такого типа в количестве 3000 — 100000 единиц ТС106 назначаются в одной дозе.

Воспроизведение вируса.

Тканевые культуры клеток готовят с использованием стабильной линии клетоК Веро, полученной из Африкан» ской зеленой мартышки при количестве переносов 129. Стандартный стеклянный сосуд для культуры эасеивают трипсинизированной суспензией клеток Веро, содержащей -достаточное количество среды для закрытия клеток на глубину 13 мм. Используется, среда Eag C-es Юит лим Ез=е.п лМ, Иед-ы п (РЕИ, которая содержит 10Ъ сыворотку эмбрионального теленка лая питательной среды (5 Ъ в под.держивающей среде}. Однако может быть использована любая питательная среда, например, Лактальбуминая гидролизатная среда в сбалансированном соляном растворе ланкса, Среда 199 и т.д. Сосуды с культурой инкубируют при 37ОС в течение

1"3 суток, после чего образуется монослой клеток Веро.

Затем сосуд заражают Equine "е"Реs

I, {культура А183, полученная из калифорнийского университета) с использованием стандартных асептичес ких способов и после 24-72 час инкубации при 37ОС цитопатология клеток показывает, что вирус воспроизвел себя. Число переносов вируса в клетки Беро при 37 С составляет 13 раз, как н ранее. Затем вирус подвергается ослаблению, Ослабление.

Используя стандартные колбы с культурой клеток ткани и питательной средой, указанной выше, готовят монослой клеток Веро. Примерно 100

3О TC105î/мл вируса .13-ro переноса вво.дят в колбы и инокулированные колбы инкубируют при 26 С. Через 8-10 суток отмечают небольшие зоны перерождени я клеток, и второй серийный

35 перенос делают с некоторым количеСтвом жидкой среды. Инкубация при 26 С продолжается и клеточная цитопатология увеличивается. После каждого серийного переноса цитопатология

Щ ввозрастает и после примерно 30-60 серийных переносов устанавливают, что цитопатология завершается через 3-5 суток инкубации при 26 С.

Этот ослабленный вирус обозначен как вакцина А283 У26 P50 ERP.

Последующие эксперименты в opi аннзме проводят с 50-ым или 55-ым переносом холодного адаптированногo вируса. Все кОличество вируса вакцины ERP вводят глубоко внутриыяшечно.

Заражение вирулентным ERP производят путем серийного переноса неослабленного вируса А183 в носовые выделения и во всю кровь через четырех лошадей. Перенесенный конский вирус вызывает классические симптомы ринопневмонии, а также аборты беременных животных. Пул, зараженный вирусами ЕРР, используется не60 однократно для заражения экспериментальных лошадей с отличными результатами и неиммунных животных.

Все вирусы вводят в ноздри.

Для определения всех серологи65 ческих реакций на вакцину ВРР

700069 или заражение вирусом используют серологичвскую реакцию нейтрализации.

Чистота вируса вакцины ЕРР, полученного укаэанным способом, определяется путем нейтрализации цитопатогенного действия„ получаемого в культуре ткани с помощью изнестнай сыворотки типа Ес),vine Herpes

Вирус вакцины дает большое колиЧестно синцития в клетках РК1э и 1 клетках Веро при 37 С. Синцитий, мажет быть использован в. качестне маркера для вируса вакцины, так как нирулентный вирус ЕРР производит индивидуальное цитопатолагическое д йст1 вие округляющего типа на клетку в укаэанной линии клеток при 37 С, Вирус вакцины убивает новорожденных хомяков и вирус выделяется иэ метровых хомяков для получения маркера того же типа для синцития, Клинические симптомы конских вирусных болезней не наблюдаются в вакциH»I рованных лошадях или жеребятах в различных. возрастных группах.

Вирус вакцины может быть выделен иэ конских периферийных лейкоцитов через 2-11 суток после вакцинации

ERP. Другие вирусные агенты не выделяются после вакцинации, за иск.1ючением местной группы Негреэ(11 ви—

РУсов), Кроме этого, вирус накцины, полученной из лошадей, содержит вакцинный маркер (синцитий).

Экспериментальный нирус вакцины

А183 У26 Р50 проверялся на следующие вирусные агенты с помощью известных способов и ни один из агентов ке =ыл обнаружен Equine tnfectл1опэ Алеппо ч,i-vs

Fquine HerPes II vir us,Equine aderno v/re!s, Ес оюе ЕосерЬс ботпзеРЖсх virus, Ес)и (пе, 1 льюuenza (,К )еды (1, A1Equi! 2 I, Приготойление вакцины.

Ослабленный вирус, приготовленный описанным вьпае способом, выращивают в больших количествах с использованием той же питательной 4 среды, которую примен яют н ст андартных колбах для получения монослая

Ф клеток Веро. Колбы инкубируют да завершения цитопатологии, как правило, в течение 3-4 суток. Затем питатель— ную среду собирают и перемешивают со стабилизирующим раствором и разделяют на дозы примерно 1000-10000000 единиц ТС10 н обычные ампулы для вакцины. Затем материал подвергался замораживанию, высушинанию в ампулах и эапвчатывался.

Пример 1. Проверка сохранности вакцины ERP и передачи вируса вакцины контактным лошадям. Кроме этого, проверяют действие вакцины в организме по сравнению " неослабленным вирусом.

Группу иэ шести разных племенных лошадей обоих полов содержат в групповом загоне. В пищу добавляют тра няное сено и ячмень, устанавливают автопоилки. Группа получает ослабленную вакцину ЕРР, которую вводят всем глубоко внутримышечно. После первой через 28 дней делают аналогичную вакцинацию. Через 56 дней 1ocJIB rIeppoA вакцинации все лошади были заражены нирулентным вирусом

EiIP. Определяют следующие параметры: всех лошадей ежедневно праверяог IIa клинические признаки ERP, измеряют температуру и проверяют сералогическую реакцию. Три лошади выбирают для выделения вируса иэ ,носовых тампонов и клеток кожи.

Выделение вируса началось на двух контактных тачках н момент заражения. Полный подсчет кровяных тепец проводят на лошадях, предн азначекных для выделения вируса (м.табл, 1.. ) .

Выделение вирусов и идентификацию осуществл яют H cl лошадях, у которых наблюдались выделения иэ носовых раковин, Принципалам присваивают номера;- 104 77, 52, 5 Г и 54, а контактному контрольному экземпляру — ноглер 79. Результаты экспериментов привецечы н табл,2, Данные таблиц сь:идетельствуют а ом, стс вакцина 1с вызывает симптомов болезни после любой вакцинации; вирус вакцины ке передается KCH

:.акrкым катрольным животным в течение более 56 суток пребывания вместе перец заражением, Во время эксперимента производят многочисленные выделения вируса 11 Ea„urine, НЕгрЫ.

Хотя контроль (К 19) дает нормальь1е клинические сиг птог1ы конской рикапневмании „т,е. воспаление дыхательных органон, отсутствие апг(етита и недомогание, повышение температурsi на несколько градусан выше нормаль.-;ой н течение двух дней после заражения нируленткым вирусом и сильное понижение счета белых кровяных телец, накцинированные принципалы были защищены от вируленткога вируса- отсутствие симптомов, нормальная температура тела и нормальный счет белых кровяных телец.

Пример 2. Определение сохpnHHocти ослабленной вакцины ERP y жеребых кобыл (отсутствие клинических симптаман или абортов), а также определение действенности вакцины

У беременных животных против вирулентного вируса FRP с целью получения и"".формации по пассивному антителу ERP, переданному жеребятам„ безопасности вакцины на различных ста днях беременности и определение передачи нируса накцины контактным конт-. рольным животным, которыми были ненакцинированные беременные животные.

Опыт проводят на жеребых кобылах че700069

10. тырех групп (см. табл. 3) . Жеребых кобыл пятой группы используют в ка— честве контрольной, Две группы вакцинируют сразу, их заражают в нос вирулентным вирусом ЕЯР спустя 40 дней. Одна из этих групп получает 5 холодный адаптированный вирус накцины 50-го переноса. Оставшиеся две группы жеребых кобыл вакцинируют днажды через промежуток в 20 дней указанным выше образом холод.ным адаптированным вирусом того же уровня переноса. Две последние группы заражают в нос через 50 дней после первой вакцинации.

Исследуют следующие параметры:

15 температуру, выделение вируса и идентификацию, цитопатогенное воздействие, титры нейтрализации сыворотки и клинические симптомы, Эти параметры определяли у кобыл и жеребят, Жеребят исследуют на вирус из лейкоцитов крови и носовых раковин непосредственно сразу после обнаружения и через два или три дня после рождения, КРоме этого, собирают сыворотку в момент выжереб- 25 ки новорожденного жеребенка и через неделю после этого. В некоторых случаях на молочную железу надевают чехлы иэ холста для предотвращения подсоса после родов для получения ЗО нескольких образцов предмолозивной сыворотки. Молозиво ЕРР, нейтрализующее антитело, замеряют у некоторых кобыл. Парные образцы сыворотки собирают у некоторых жеребчиков и кобыл в момент рождения и после.

Пример 3. Получение данных о сохранности вакцины н жеребятах (определяется по томам и исследованиям клинической патологии) . Опреде- 4О ление времени вакцинации жеребцов при наличии материнского антитела: выделению типа вируса у двухнедельного вакцинатного жеребенка и действенность пассивного антитела ERP (табл.4)4-„

По группам 1-4 определяют следующие параметры: температуру тела, цитопатогенное действие, выделение вируса из носовых раковин и лейкоцитов крови, нейтралиэующие серологии EQP и ежедневное наблюдение эа клиническими признаками болезни.Группа 1. Реакция жеребчика на вакцинацию ERP.

Эта группа иэ восьми жеребчиков получена от кобыл хорошо продокументированной родословной относительно их статуса ERP. Вакцину вводят жеребцам внутримышечно в количестве одной сублимированной 1 мл дозы вакцины А183-у26-ERP содержащей

106. 8 логов вируса/2 мл, который восстанавливает 2 мл стерильной воды перед использованием.

Группа 2. Реакция жеребчика на вакцинацию ЕЯР 65

Жеребчик Ь без матери. История матери по ЕкР неизвестна.

Жеребчик Р 74 от зараженной контрольной кобылы, которая родила жеребенка через пять дней после заражения рулентным вирусом ЕРР, через носовую раковину. Этот вирус выделен у кобылы, однако у жеребенка после родов выделен не был. Следовательно, увеличение не наблюдается в молозивном антителе ERP эа короткий период времени до рождения после заражения.

Группа 3. Жеребчики, зараженные вирулентным нирусом ERP.

Эта группа состоит из четырех жеребцов, которых заражают через носовые раковины с помощью катетера с 10 мл вируса, содержащего

20 логов вируса/? мл. История кобылы EPP хорошо документирована.

Группа 4. Состоит из двух жеребчиков от матерей с неизвестными историями по ERP. Жеребчиков заражают аналогичным образом, так же как и в группе 3.

Ни один иэ вакциниронанных жеребцов не показал серьезных клинических симптомов. Иногда выделялись .. б ак терии 51гер1ососс0 s zoo epide cus из носовых каналов во время нечастых выделений иэ носовых раковин, которые не имели отношения к ЕЙР.

Ни один иэ четырех зараженных жеребцов (группа 3), содержащих молозивное антитело ERP, не был болен или подавлен, как зараженные жеребцы, у которых не хватало молоэивного антитела ERP..

Таким образом, нормальная температура тела х<еребцдв выше чем у взрослых. Кроме этого, стресс от воздействия окружающей среды, например, тренировка жеребцон или лежание на солнце, по-видимому, оказывают большее влияние на колебания температуры, Тенденция к лейкопения чаШе проявляется у вакцннированных жеребцов в период между 3-7 днями. Лейкопения проявляется сильнее у зараженных контрольных жеребцов.

После заражения сильная лихорадочная реакция наблюдается у зараженных жеребцов без пассивного антитела в период между 2-6 днями.

Очевидно,нет постоянного понышения температуры после вакцины ERP или заражения ERP высокими уровнями пассивных àí — èòåë ERP. Один жеребец 155, показавший самое низкое нейтрализующее антитело ERP, имеет такое же повышение температуры, как и контрольные зараженные жеребчики, однако, не была замечена депрессия или анорексия.

Из полученных экспериментальных данных можно сделать следующие выводы.

700069

Приспособленный к холоду (26 С) вирус клетки Веро воспроизводится в организме при внутримышечном вве дении, образуя защитный иммунитет от вирулентного вируса ERP, введенного н носовую раковину.

Вирус вакцины не является патогенным при введении жеребым кобылам и жеребятам иэ различных иммунологических сред ERP, Вирус вакцины может быть выделен иэ лошадей, которые до этого были подвержены ERP (измерение проводилось с помощью нейтралиэующего антитела ERP) или от животных, не имеющих нейтрализующего антитела.

Иногда вирус может быть выделен из промытых лейкоцитов крови или редко из носовых раковин.

Вирус вакцины ERP не передается контактным контрольным лошадям при отсутствии сероконверсии контактных контрольных животных или при выделении негативного вируса иэ контрольных животных, Нейтралиэующие серологии из накциниронанных животных успешно сравнивают с серологиями, вызванными вирулентным вирусом ERP, который используется для заражения.

Молоэивное антитело EQP c высоким титром пассивно переходившее к жеребцам, по-видимому, защищает (отсутствие видимых симптомов) же ребцов От вирулентного вируса ERP.

Клеточный промежуточный иммунитет, играет важную роль в защите лошадей от абортов ERP и клинических симптомов ERP, однако, до сих. пор не представляется возможным измерить клеточный иммунитет ЕЙР это делается только путем заражения.

Чи сло выделений вируса, сделанных после вакцинаций с помощью воспроизведенной вакцины ЕКР или воздействия вирулентным вирусом .ERP,, во многом зависит от типа и степени иммунитета, которым обладает хозяин

Предпочтительно выделять вирусы иэ жеребцов с высокими уровнями молоэивного нейтрализующего антитела

ERP. Считается, что эти жеребцы имеют гуморальный иммунитет, который в зависимости от силы представляет улучшенную симптоматологию при заражении вирулентным вирусом. Однако гуМоральный иммунитет играет незначительную роль в изоляции состояния носителя вируса. В противоположность этому активный иммунитет, вызываемый вирусной инфекцией образует клеточный промежуточный и гуморальный иммунитет. Отсюда после повторного воздействия воспроизведенным вирусом вакцины или вирулентным вирусом состояние переносчика вируса практически устраняется. ПоНаблюдаются три явных клинических случая мыта и были выделены

ВЪгер1ососсиэ zooepidem ous, Бт,v ер. ес щ50 стреп-группаг. Stops.аогеоэ и у одного жеребенка был обнаружен StvepMcoccue ecru . Эти бактерии периоди— чески выделяли у испытываемых животных. Все бактерии могут давать

55 клиническче симптомы лихорадки или выделений иэ носовой раковины или то и другое вместе, поэтому их наличие часто исследуют для определения причины любого клинического отклонения, которое могло понлиять

60 на результаты исследований опытных животных. В большинстне случаев бактериальные вспышки были довольно ясны, когда температура лошади и общие карты лейкоцитон просматри65 вались.

45 видимому, существуют животные, невосприимчивые к ERP у которых наблюдается такое состояние, и животные, перенесшие до этого щР у которых тоже наблюдается такое же состояние по серологиям. Клеточный иммунитет, как гормональный иммунитет, теряется со временем. В настоящее время неизвестны сроки истощения клеточного иммунитета ЕКР, Вирус вакцины ERP не переходит плацентальный барьер, судя по негативным нейтрализующим премолоэивным образом сыворотки от восьми новорожденных жеребят. Кроме этого, у 18 новорожденных жеребят от накциниронанных и зараженных кобыл не был выделен положительный вирус вакцины &guin He q S 1,Можно предположить, что кривые истощения пассивно приобретенного нейтралиэующего антитела ERP, полученного от 5 жеребят путем выделения, неуклонно снижаются, не показывая внутриутробного воздействия вируса Нбгреэ 1, так как, очевидно, не происходит активная индукция антитела.

Выделения вируса вакцины ЕДР чаще всего делаются из лейкоцитов крови, а не иэ носовых раковин.

Эти данные также относятся к введению вируса вакцины через нос.

Хотя только четыре; принципа иэ четырех дали выделения, все выделения были сделаны иэ лейкоцитов крови. Многие носовые выделения вируса, полученные во время экспериментон, могут быть получены иэ незначительных количеств крови, выделенной из капиллярон, поврежденных при взятии образцов длинными носовыми тампонами размером 150 мм, когда животные двигались ° Образцы некоторых носовых тампонов были потеряны из-за бактерий и загрязнения, 13

700069

Проверка сохранности вакцины ЕЯР и передачи вируса вакцины

512 256 128 512 256 512 512 1024

П52 16 128

П53 8 256 512

1024 128 512 128 256 128 256

512 256 256 256

П54 4 64

П77 0 — 2048 512 256 256 128 1024 256 256

64 8 64 128 128 256 256 128

П104 0 0

К79 0 0 0 0 0 0 512 2048 2048

П р и м е ч а н и е. Ни одна из подопытных лошадей не имела клинических признаков ERP, streptococcus ooe pi demicus является частным сопутствующим агентом вируса Equine Rbinopneurnoniti присутствие которого не вызывает удивления, если принять во внимание повсеместный характер этой популяции. Следовательно. любой серьезный стресс лошади может обусловить вспышку М .ер. юовр депмс к.

Изобретение относится к вакциу,ý и к способу ее приготовления.

Рчрулентный изобят А183 вируса

Equine I Herpes вводится в монослой постоянной линии клеток Веро, который инкубируется в течение 3-5 дней при 37 С и цитопатология хлеб ток з авершаетс я. СвежеприготовленнЫй стабильный клеточный монослой клеток Веро инокулируется с частью приготовленного собранного вируса.

Культура вновь инкубируется для получения цитопатологии по меньшей мере части клеток ткани. После этого часть полученного вируса серийно переносится по меньшей мере 30 раз при инкубационной температуре 26 С и .получается иьмуногенно активный авирулентный вирус.

Таблица 1

«««

i 1

I I х о

Я Я

««« а ф

1 " а «««

1О 5

< а

I 1

1 . 1 (i« х

I -1л л л

1 1

I I Ф

Ю л х! -1

Ф л 1 л

1 л -1!

1 r1

««

I 1

I 1 1 I

1 1 !

1 1 1

1 1 л л л«

+ л I л« л л

1 1 rl л 1 I 1

1 I 1

Д о о

« («I ! е ц

700069 х и ««« ох

» <«! о ц о

«1-1 «

o o

»» а а х х

Ф III щ (1 л л

« л« л Л1

Я о о и о х х

Q х

О5 х о х «« х х

««« х

1«« х о

И о

««« х

700069 м 3 с

1

m I

9 9

Б йах (с(Щ

Р( (1

l at

l сЧ з

1 л (( а о (0 х х

43 ю

«(( с

«Ф

Е о о Ъ а х!

1

«Ф !

I м

1 гI м

c4. с с«

l с(cf

1 I м (ч л (Ч

1i м

C) м

Ц m о «х

С4 М сУ (Ч

° Ф (Ч

Ю л а9

9 р. х ((!

0) х

A (р х

9 9 р, Ц

K о

9 9 5 х. р, 9 (б

Я

Rg х о

9 Х ац

К сЧ

2 х х ((! о а х х х

«Г

М ((! ь х к

9 Х. ц х

K 9 а ((! р

t6

9 аo

9О

K x сЧ (О ч (с( ((1 (Ч

CO СО

СЧ (Ч

aO cO й) (Ч сЧ (Ч о л г- 1

° 9 о5 (ч

° р,9м сч Фх+

o(n x х

1„ о

Ц

1 о ."! .K m

9 р (6

CO

CO сю рв

И

fd (m

Щ о

СЧ CO л (ч (с(л

«(CO сч сч о л

+ сч л аА

I х с° х х л( м ((1Хсч о ((! Ц+

° ф (с( (Ч (О (О д л л

«Ф

Г

° Ц фЯ с 4 К 9 охХХ

° g Ц ол хо

I х 1 аФ91 и2 (х ах 9 о

99Ц Х

Z o o Z I.

o moo o

ЖO«CXm

aA (Ю (A aA «:й

H 2 о

Ы f« л о<

Е

e-e o со

6-((р

9 Р, 2 9 х 2 -х

Х ((!

М Р! х о р о х х х х

Щ оо о> х 9

9 2 ° а р х 9 о 9а

О 9

1 х

5 с

Ц И

9 И р( и р, or

1 1 1 аА «Ф 9 о л ((!

СЧ (Ч И (° (Ч «3 (Ч л е о аА л

Ф

E с«((1 «й (О л,с! Е (A л л(л л« (, ° (-«И

700069 л

ГЧ

+ х

rd !!! о а

j а

Ф

1

Г«Ъ

Ю

А

ГЧ ! м, о

Е о > а х

Ю

Ю

М ж

Ф

Г

ГЧ ф

Ю и

° Ц

Ю

СЧ Ю

«:Г с3 «:3 (Г Г! I ! с3 (Ч «Ф 1О! I I

01 Р ) (Ч «Ф

ГЧ Г 1 <Ч

00 LO СО с3

C4 lA ГЧ (Ч

ГЧ л

<:0 Ю Ю ГЧ

ГЧ д я л

ГЧ (Ч О ) LO СЧ ГЧ Ф

О) Л ЛЧ ГЧ

ГЧ а а О LO сй ГЧ «Ф

if) Г 1 ГЧ

Ю а Ю л3 « (Ч «3 ГЧ 3« р л ГЧ а Ю а Ю л« л

Ю Л ГЧ Г

1О LD 1О О л л«л

Г1 И И 1:!

700069

° Ф

I

° Ф

1 о л!

I Р

СЧ

01 л

В (ъе ж х в о

Х а

4Ч. И л щ ю а аА

О4

>3

CO л 4

° ф У

1 t

I 1 у

1 1

10 Ch

4 Ф

1 »

1 аА

1 аА 3 Ф

Г

1 1 э а

I 1

Р ) (Ч 4Ч

Е о и а х

ct CO 4Ч

\О (Ч Л4 л4 аА (Ч ГЧ

CV Ф л (ч а о

СО 10 0

СЧ aA aA

° - СЧ (Ч

4Ч СЧ л 10

4А iA (Ч и л

СЧ Ф л (Ч аА Ю л чф СЧ

Я) РЪ л

Х а

1»

ОЭ

СЧ СЧ

4 Ю 4

4Ч О .Ф, Р1 аА

СЧ

ОО CO СЧ

4Ч

<Ч Ф JI л4 СЧ О о о

СО О

<Ч и л сЧ

aD Ф

Л СЧ

СЧ л о

Р1 ° 4

1 аде О

Ф Ф

Z o o Z I

omuoo .МОХЙР4 д е Ъ CO р О аА

4 л Л

К !4 х

C( о о а

6 тР 4Ч

10 Л4 М

ОО П3 (Ч л4 аА

ОО 4Ч

4Ч Л4 л и

0 t» В О

М 0 О 4 С

4 4 Л

И И и И Ы 3

CV

C)

<Ч

РЪ

° Ф

° !е

R о

4О 3

Г

4у ч аА

t л

М, 4 и) ltt Ч л <б л ох

Ц и ф ф

Ф

С4

CO К.

700069

Таблиц а 4

Результаты исследований по выделению вируса у новорожденных жеребят е в ей

256

1024

32

128

512

101

58

128

94

16

128

26

44

128

21

123

44

512

NA

Составитель A-Макаров

ТехРед И,Вабурка КоРРектоР Н.ЭадеРновскаЯ

Редактор Д.Пинчук

Тираж 526 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035» Москва, Ж-35, Раушская наб,, д.4/5

Заказ, 7262/62

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4

Фоомула изобретения

Способ получения аттенуированного штамма вируса Брипе 1ипортеотоп Цэ путем ослабления его вирулентнэсти при культивировании в культуре клеток отличающийся тем, что, с целью сохранения иммуногенной активндсти его, вирус ослабляют куль55 тивируя в перевиваемой линии клеток

Веро (печень зеленой мартьп ки) в течение 30-60 пассажей при температуре

23-33 Св

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Патент CIGA Р 3725542, кл. 424-89, 1973а