Способ очистки антитоксической иммунной сыворотки

 

О П И С А Н И Е (11)703927

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 25.02.76 (21) 2327321/28-13 с присоединением заявки № (23) Приоритет (43) Опубликовано 23.06.82. Бюллетень № 23 (45) Дата опубликования описания 23.06.82 (51) М, Кл з

А 61К 35/16

Государственный комитет (53) УДК 615.373.3 (088.8) по делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения Н. Ю. Лукошявичене, А. И. Кестнер, М. И. Крезн, Х. Я. Киппер, И. И. Райхер и Л, И. Райхер (71) Заявители Институт биохимии АН Литовской ССР, Таллинский политехнический институт и Пермский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток (54) СПОСОБ ОЧИСТКИ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ ИММУННОЙ

СЪ|ВОРОТКИ

Изобретение относится к области биохимии, а именно к энзимологии, и может быть использовано для получения концентрированной антитоксической иммунной сыворотки высокой степени чистоты, свободной 5 от группоспецифического фактора «А» крови, Известен способ очистки антитоксической сыворотки путем ферментолиза иммунной сыворотки с помощью пепсина (1). 10

Недостатком известного способа является то, что получаемая при этом сыворотка содержит белки нативного пепсина, соответствующие группоспецифическому фактору «А» крови и приводящие к увеличе- 15 нию титра антител против фактора «А» крови у лиц, которым вводится указанная сыворотка. Кроме того, при использовании нативного фермента, пепсин может быть применен только однократно. 20

Целью изобретения является устранение указанных недостатков.

Поставленная цель достигается путем осуществления ферментолиза антитоксической сыворотки с помощью иммобилизован- 25 ного на модифицированном аминными группами силоХроме.

Пример 1. Получение иммобилизованного пепсина. 30

Используют силохром марки СХ1 или

СХ2 с диаметром пор 1200 — 700А и размером частиц 0,1 — 0,6 мм. Носитель обрабатывают 1 — 2% водных раствором у-аминопропилтриэтоксисилана в соотношении 1: 3 в течение 2 — 4 ч при комнатной температуре и высушивают при 120 С.

Получают силохром, содержащий 100—

200 мк.экв первичных аминогрупп на 1 г, который затем обрабатывают 2 — 3%-ным водным раствором глутарового альдегида из расчета 3,5 мл раствора на 1 r носителя в течение 2 — 4 ч при комнатной температуре и промывают дистиллированной водой до исчезновения следов глутарового альдегида в промывных водах. Активированный носитель высушивают в течение 24 ч при комнатной температуре. 1 г полученного носителя обрабатывают 3 — 3,5 мл пепсина марки «Для производства сыворочных препаратов» в 0,1Ì цитратном буфере с рН

4,0 — 4,6 с концентрацией 40 — 50 мг/мл в течение 2 — 4 ч при температуре 5 — 20 С. Иммобилизованный фермент промывают тем

„«e буферным раствором и 1М раствором

NBC1. Активность обработанного таким образом фермента составляет 40 — 50% от активности нативного пепсина.

Пример 2. Противостолбнячную лошадиную сыворотку с титром 700 МЕ/мл, со703927 форма с последующим подкислением до рН 5 — 5,3. Осадок, состоящий пз остаточных продуктов расщепления и липоидов, отделяют центрифугированием.

5 В нейтрализованной надосадочной жидкости (сыворотка «Диаферм-3») определяют содержание антитоксина, объем и белок. По полученным данным рассчитывают выход антитоксина и его удельную актив10 ность (в МЕ на 0,1 г белка) .

Отделенный иммобилизованный пепсин после суточного выдерживания при 4 С применяют для ферментирования следующих порций сыворотки (всего 8 раз).

15 В контрольном опыте в аналогичных условиях ту же исходную сыворотку ферментируют неиммобилизованным пепсином (той же серии, которая была использована для иммобилизации).

20 Для определения группоспецифического фактора «А» в опытных и контрольных сыворотках используют тест торможения гемагглютинации с применением стандартной сыворотки крови Ш группы и эритроцитов

25 П группы.

B каждом из 8 экспериментов реакцию осуществляют параллельно с опытной и контрольной сывороткой (разведенных до содержания белка 3 /в с последующими

30 разведениями до 512 раз (10 пробирок).

В таблице приведены характеристики ферментированных антитоксических сывороток, полученных с применением иммоби35 лизованного пепсина при восьмикратном его использовании.

Удельная активность (МЕ/0,1 м белка) Агглютииация (Ма пробирки)

Контроль

Опыт

11ативиая сыворотка до ферментации

Фермеитироваииая аититоксическая сыворотка с применением неиммобилизоваииого пепсииа по стандартным условиям „Диаферм — 3"

Ферментироваииые аититоксические сыворотки с применением препарата иммобилизованного пепсииа после многократного использования одной и той же порции препарата:

I-я сыворотка

Ц-я

III-я

2274

4127

2483

2889

3847

4302

То же

То же

8

IV-я

V-я

VII-я

VI II-я

Приведенные данные свидетельствуют о том, что при восьмикратном использовании иммобилизованного пепсина средний выход антитоксина составляет 53, а при приме- 40 держащую 8а/а белка, разводят до содержания 3 белка и подвергают ферментолизу в присутствии 0,25 -ного иммобилизованного пепсина (процентное содержание фермента указано без веса носителя) в течение 1 ч при рН 3,2 и температуре 22 С и еще 1 ч при той же температуре и рН вЂ” 4,2 при непрерывном шутелировании.

После ферментолиза иммобилизованный пепсин отделяют дека нтацией. Освобожденный от пепсина ферментат сыворотки прогревают при 56 С в течение 45 мин в присутствии 14 /в -ного сернокислого аммония.

Осажденные термолабильные неактивные белки отделяют центрифугированием. В нейтрализованную надосадочную жидкость добавляют 20 /в сухого сернокислого аммония и выпавший в осадок активный белок диализуют против воды для удаления сернокислого аммония. Отдиализованный раствор белка обрабатывают 30а/а-ным раствором хлороформа с последующим подкислением до рН 5 — 53. Осадок, состоящий из остаточных продуктов расщепления и липоидов, отделяют центрифугированием. Освобожденный от пепсина ферментат сыворотки прогревают при 56 С в течение

45 мин в присутствии 14 /в-ного серпокислого аммония. Осажденные термолабильные неактивные белки отделяют центрифугированием. В нейтрализованную надосадочную жидкость добавляют 20 /в сухого сернокислого аммония и выпавший в осадок активный белок диализуют против воды. Отдиализованный раствор белка обрабатывают 30в/а-ным раствором хлоронении неиммобилизованного пепсина 51в/о.

В первом случае получены препараты антитоксических сывороток с более высокой удельной активностью.

703927

Техред А. Камышникова

Редактор П. Горькова

Корректор Е. Михеева

Заказ 837/20 Изд. № 157 Тираж 758 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, 5К-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2

Данные реакции торможения гамагглютинации указывают на практическое отсутствие в ферментированных иммобилизованным пепсином сыворотках фактора «А» (агглютинация во всех опытах наблюдается с 1-й пробирки, в то время как контрольные тормозят ее до разведений в 128 — 512 раз).

Формула изобретения

1. Способ очистки антитоксической иммунной сыворотки путем ферментолиза, о тличающийся тем, что, с целью получения препарата, свободного от группоспецифического фактора «А» крови, ферментолиз проводят с помощью пепсина, иммобилизованного на модифицированном у-аминопропилтриэтоксисиланом силохроме через глутаровый альдегид при рН 4 — 4,6.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют силохром с размером

10 пор 1200 — 700 А и содержанием первичных аминогрупп 100 — 200 мк экв/г.