Способ получения вещества,стимулирующего созревание т- лимфоцитов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

И АатОРСКОму сВидийльСтву

Союз Советских

---Социалистических республик

ОБО89

I

Г е

,",. 1и, " II tq : (6l ) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 11.07,78(2 I ) 2643199/28-13 г . Кл.

61 К 37/24 с присоединением заявки М

3Ьеударствекхьй кеиитет

СССР вв Леваем взееретеннк н вткрытнк (23) Приоритет

Опубликовано 30.12.79. Бюллетень М 48

ДI(615.45:.5 (088.8 ) Дата опубликования описания 04 01 80 (72) Автор изобретения

И. А. Беэвершенко

Киевский научно-исследовательский институт эндокринологии и обмена веществ (71) Заявитель

l (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВЕЩЕСТВА, СТИМУЛИРУЮЩЕГО

СОЗРЕВАНИЕ. Т ЧИМФОЦИТОВ Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касает» ся получения биологически-активных препаратов для лечения и диагностики иммунодефицитных состояний.

Известен способ получения вещества, стимулирующего созревания Т пимфоцитов, путем дефибринирования плазиы сыворотки, диализа против солевого буферного раствора, хроматографии на сефадексе 6 - 25, затем на карбоксиметилцеллюлозе, обработки активиниро ванным углем„тонкослойной хромато графии в системе бутанол- пиридин и выделением целевого продукта электрофорезом (11.

Однако известный способ является трудоемким, требует большого количества сыворотки, что ограничивает его производительность и удорожает производство препарата.

Целью изобретения является упрощение технологического процесса. ! 2

Эта.цель достигается тем; что ткань тимуса крупного, рогатого скота измель.чают, диализуют против воды в течение

29-24 ч, диалиэат хроматографируют на иммобилизированном эуглобулине при

/ ионной силе 0,14 — 0,15 и элюируют целевой продукт водой.

Пример. 0,5 кг тимуса теленка гомогенизируют в 0,14 М NaCB (1:2 вес./объем) и,диализуют против

5,0 - 10, 0 объемов дистиллированной воды в течение 24 ч. В диализат добавляют расчитанное количество Na С6, чтобы его конечная молярная концентра1> ция достигла значения 0,14, рН диалиэата доводят до 7,2 — 7,5 добавлением бикарбоната натрия. Диализат пропускают через колонку, содержащую иммобилизированный эуглобулцн быка,. или инкубируют гО с сорбентом, суспендированным в диалио и эате в течение 5 - 8 ч при 4 С.л3,5 С, Затем сорбент отмывают в колонке (или на воронке Бюхнера) 0,14 N NaC6 эабуферненным бикарбонатом натрия, под —;0С 089

Число наблюдений

Число розеткообразующих клеток

Испытуемые сыворотки

550

Контроль

А нтилимфоцитарная сыворотка

551

50 мкг ФСД

50 мкг ФСД с антилимфоцитарной сывороткой

352

Та блица 2

14,5

30

16

41 контролем спектрофотометра (до экстинкции в промывных водах (при 260—

280 нм не более О, 001). Сорбировав- шийся фактор элюируют дистиллированной водой и лиофилизируют, В случае применения колоночного метода выход фактора контролируется с помошью спектрофотометра. Злюированную фракцию лифилизируют. В случае применения воронки сорбент выдерживают в течение

2 ч в двух обьемах дистиллированной воды, отделяют фильтрованием и лиофилизируют.

Приготовление сорбента.

Сыворотку быка диализуют против

10-кратного обьема дистиллированной воды в течение 48 ч. Выпавшие в осадок сывороточные эуглобулины отделяют фильтрованием. Осадок растворяют в минимальном, объеме 0,14 M Фдф;, забуференном 0,01 м концентрацией бикар-, бонатного буфера рН 7,5. 30 мл растВлияние фактора тимуса, выделенно-го методой аффинной хроматографии, на количество розеткообразуюших клеток в вора эуглобулииов с ко»»центр;»цие»» белка 80,0-20,0 мг/мл ин»;убиру»от с 5 мл набухшей целлюлозы, се,».- »лекса или сефарозы, активированиой Bi CN известным способом, Инкубацию проводят при рН 9,5.

Определение активности осушествляется известным способом по увеличению чувствительности розеткообразуюши: лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей к антилимфоцитарной сыворотке или азотиоприну.

10 лимфоцитов селезенки тимэктомированных мышей инкубируется с

50, 0 мкг лиофилизированного препарата (по сухому весу), после чего испытывается чувствительность розеток, образуемых этими клетками с эритроцитами барана, к антилимфоцитарной сыворотке.

В табл. 1 приведены результаты испытания фактора, стимулируюшего дифференцировку Т-лимфоцитов (ФСД).

Таблица1 составе лимфоцитов крови больных опухолями ЛОР органов показано в табл..2, 7,0608Э

Продолжение табл. 2

Количество розеткообразуюших l Количество розеткообразуюших лимфо цитов крови больных опухолями ЛОР органов, %, после инкубации с исследуемым фактором лимфоцитов крови больных опухолями ЛОР органов, %

Концентрация

1 мкг 10 мкг

100 мкг

20

21

22

17

Составитель С. Малютина

Редактор Г. Прусова Техред H. Ковалева Корректор О. Ковинс

Заказ 8110/3 Тираж 672 Подписное

Ш1ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., д. 4/

4/5

Филиал ППП "Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, Предлагаемый способ получения препрепарата тимуса, стимулируюшего созре- 2о ванне Т-лимфацитов, позволяет выделить фактор с помощью одной хроматографической процедуры, не требующей применения колонок, из любого количества исходного материала; предусматривает эпюцию конечного продукта водой,.что избавляет от необходимости очистки ко- нечного продукта от солей и тем самым удешевляет его наработку, зо

Для выделения фактора по методу

Баха требуется 10 препаративных приемов, а по предлагаемому способу - 3. и диагностики иммунодефицитных состояний.

Формула изобретения

Способ получения вещества, стимулирующего созревания. Т лимфоцитов, путем диализа животного сырья и хроматвграфии, о т л и ч а ю m и и с я тем, что,-с целью упрощения технологического процесса, ткань тимуса крупного рогатого . скота измельчают, диализуют против воды в течение 20 - 24 ч, диализат хроматографируют на иммобилизированном эуглобулине при иЬнной силе 0,14—

0,15 и элюируют целевой продукт водой.

Источнйки информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Франции М 2265404, А 61 К 37/24, опублик. 1977 (прототип).