Способ получени -лейцин-13-мотилина

Авторы патента:

A61K38/22 - гормоны (производные про-опиомеланокортина, про-энкефалина или про-динорфина A61K 38/33, например кортикотропин A61K 38/35)

" «жв@ -р жзлво т«ъ«т фе » л

А Н йЕ

ОП ИС

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено01,10.76(21) 2408609/23-04 (23) Приоритет вЂ” (32) 03.10.75 (31) P 2544348. 5 (33) ФРГ (43) Опубликовано 15 02 78Бюллетень 14 6 (45) Дата опубликования описания 27.01.7

2 (л, 07 С 103/52

61 К 31/ О5

Государственный «омитет

Совета Мин«строе СССР оо делам иеооретений н открь1тий ÍK 547.66 <.. 07 (088. 8) Иностранцы

Эрих Вюнш, Герхард Вендпьбергер и Эрнст Егер (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма (71) Заявитель «Макс-Планк-Гезепьшафт цур Фердерунг дер Виссешафтен, е. Ф.» (ФРГ) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ -ЛЕЙЦИН-1.3-МОТИЛИНЛ

Изобретение относится к способу попучения нового, ранее неизвестного попипептида- Ь -EEeAHHH-.13-мотипина, который может найти применение в медицине .

Известен способ получения li -норпейцин-1 3-MoTHëHíà (11 путем конденсации QT депьных пептидных фрагментов модифицированным карбодиимидным методом (2) на основе дицикпогексипкарбодиимид- 11-оксисукцинимида и удалением защитных групп три- (0 фторуксусной кисцотой. Дпя синтеза L

-норпейцин-13-метипина были испопьзованы следующие защищенные фрагменты:

T. Аргинип(бромгидрат) аспарагинип- 1>(вЂ”

-трет.-бутипоксикарбонип-пизип-гпицип-гпу- l5 тамии-трет.-бутиповый эфир (аминокиспоты

18-22);

: П. N - Гпутамип-(О -трет,-бутиповый эфир)-гпутамип-(х -трет.-бутиповый эфир)-(>(-трет,-бутипоксикарбонип-пизип-гпутами- 20

Ю новая киспота- о-.трет-.бутиповый эфир (аминокиспоты 14-17);.

1Н. N, N а, 11 -Три(бензипоксикарбонип)-аргииип-норпейцип (аминокиспоты 12-1 3);

Ц -Бензипоксикарбонип-гпутамип 25

d (f трет,.-бутиповый эфир)-пейцип-гпутамии (аминокислоты 9-1 1 );

О-трет-, Бутип-треонип-0-трет -бутип-ти)зозип-гпицин (амииокиспоты 6-8)

11.

YI. )(-трет.-Бутипоксикарбош1п-фенипапанип-валил-пролил-изопейцип-феьч1папанин (аминокислоты 1-5) .

Цепь изобретения вЂ” синтез новых биологически активных производных мотипина.

Поставленная цель достигается предпагаемым способом попучения L -пейции-1 3-мотипина формулы Х

3 1> S. e т е 9 ю

Н-Pbe- тстС-Рго -3te-Р6е-Th 7 -Т» E -C16»- CEu- Ьец11 12 13 14 15 16 17 18 19 2О

-Ып - Ar q - Ь eu -0> tu-45è - Ü»á- ОСи-,4го--A 7>-L»s21 22

- С,e»-C,Еп-он закпючающимся в том, что подвергают конденсации защищенные фрагменты: трет.-бутиповый эфир аргинип(гидроброЕ мид)-аспарагинип->4 -трет.-бутиноксикарбониппизип-гпицип-гпутамина (18-22);

9г -трет.-бутиповый эфир И -бензилоксиCi. карбонип-гпутамип(C| -òpå T.-бутиповый эфир) 593659

3 гпутамил(Я -трет.-бутиловый эфир)-М

-трет.-бутилоксикарбониппизил-глутаминовой кислоты (14-17);. !!,: и, К -трис.-бензилоксикербонилс(. о щ вЂ” L -аргинил- .1 -цейцина (1 2-1 3);

N -бенэипоксикарбонилгпутамип (т!

-rper.-бутиловый эфир)-пейцилуглутамина .(9-11); О-трет.-бутилтреонил-О»трет,бутип тирозил-глицинв (6-8) и ! -трет.-бутил(А оксикарбонидфеницалвнил-валил-пролил-иэо- !и лейцит -фенилапанина (1-5) с помощью N

Н -дицикпогексилкарбодиимид- N -оксисукцинимида, удаляют защитные группы трифторуксусной кислотой.

На фиг..1 приведена схема получения фрагмента Т; на фиг. 2 вЂ” то же, фрагмен-. та II* на фиг.:3 вЂ” то же, фрагмента 3Д;на фиг. 4 - схема получения фрагмента !и, объе. динение фрагментов T-.Ø; на фиг, 5 - схе..ма получения фрагмента ХЪ, объединение 20 фрагментов ХУ и (T-.II!)., VI и У, Х-IV H

Y-V1, На схеме и в примерах применены следующие обычные в химии пептидов сокрашения и символы

" вЂ” указатель конфигурации, Z вЂ” бенэипоксикарбонильный остаток, ВОС вЂ” трет.-бутилоксикарбонипьный остаток !

- ЭССЭ- М, М -дициклогексчлкарбодиимидный способ, 1

ЭССЭ /НОЖ .вЂ” N, 8 -дицикпогексилкар.бодиимид- N-оксисукцинимидный способ. ЭССЭ /HOBT- N, }1 -дициклогексилкарбодиимид- N-оксибенэотриазольный способ.

РАМ вЂ” фосфорвэо-метод, 5Ч вЂ” оксисукцинимидный остаток, МР вЂ”. и-нитрофениповый остаток, tBU. вЂ” трет.-бутильный остаток, >I5, - дибенэосульфимид в качестве со- пеообразователя, МЕ вЂ” метильный остаток, TF Е вЂ” трифторуксусная кислота, П р.и м е р 1. Получение фрагмента T (часть последовательности 18-22)

Н- CEn -01 Ви (22 Ь ), получают иэ

2;-Cf n -ОН (22 ol ). этерификацией трет,вЂ”

-бутиловь|м эфиром уксусной кислоты при применении серной кислоты в качестве катализатора и йоспедующего удаления бензилоксиквр-. .бонильной защитной группы гидрогенолизом.

НМп -OCBu объединяют с Х -Cj8v -OSV . (21), в результате чего получают эфир бен, эилоксикарбонил-дипептидв (21-22a).

-Защитные группы снимают гидрогенолизом, полученный продукт Н- Гу -G! n -ОФВо (21-22Ь) конденсируют с Z -Asn - Ьуэ (ВОС)-ОН (1 9-2 0) К, N -карбодиимид- ЙвЂ”

-оксисукцпнимидным способом в результа-,6О те чего образуется трет.-бутиловый эфир бен-

4 зилоксикарбонилтетрвпептида (19-22а). Дипептид (19-20) получают посредством амино вцилир ов ения Н- L s (ВОС ) -ОН (20) с помощью Z -Asn -0 НР (19).

От соединения Z -Asn вЂ” Lws (ВОС)-С 1ч -GLn -Ot Bu (19-22a) бензилоксикарбонильную защитную группу удаляли каталитическим гидрировайием, образующееся при этом сложноэфирное производное тетрвпеп-тида (19-22 ) конденсируют с g- А!д (8, ю-Е )-ON Р (18), получают,- Х- А гц . (g,à-Z )-Asn вЂ” Иб (ВОС)-ЯЬ.-cen -03Bo (18-22а).

А. Дибензолсульфимидная соль трет.-бутилового эфира Ь .-глутамина.

103 r трет.-бутилового эфира бензипоксикарбонилглутамина в 2 л метилового спирта подвергают катапитическому гидрированию (папладиевая чернь) при прибввпении по кквплям 91 r дибензолсульфимида в 500 мп метилового спирта при,.рН 3,5.. Осадок отфилы ровыввют, Фильтр ат упар ив вют в вакууме,з евер. шая упвривание азеотропной отгонкой с бенэопом,Раствор маспообраэного остатка в этиповом эфире уксусной кислоты смешивают с ди- . этиловым эфиром,продукт кристаллизуется.

Для более полной очистки продукт перекристап-. лизовывают из метилов ваго спирта и диэтилового эфира, т. пл. 135-136 С,Щ вЂ” -+10,78 (с - 1,0; в метиловом спирте). Выход 146 г (97% or теоретически рассчитанного значения}.

Б. трет.-Бутиловый эфир бензилоксикарбонил-глицил-1 -гпутамина, Суспензию 115 г дибензолсупьфимиьной соли трет,бутилового эфира L -глутвмина в 800 мл дихлорметана смешивают с 32,2 мп триэтиламинв и затем с 70,5 г бензипоксикарбонилглицин- !!-оксисукцинимидоэфира. Переме пиввние продолжают в течение 24 час при комнатной температуре, затем упвривают в вакууме, маслообразный остаток -расг-. воряют в этиловом эфире уксусной кислоты, раствор промывают водными растворами лимонной кислоты, бикарбонвта келия и водой; сушат нвд сернокислым натрием и упаривают в вакууме, Получают маслообразный про- дукт выход 87 г (93% от теоретически рассчитанного значения).

В. Дибензолсульфимидная соль трет.-бутилового эфира гпицип- " -гпутвмина.

Раствор 80 r трет.-бутипового эфира бен» зилоксикарбонилглицил-Ь -глутамина в 900.мп метилового спирта по аналогии со способом, описанным в пункте А, подвергают гидрогенопитическому деацилированию (60 r дибензопсульфимида} и переработке, Получают мвс лообразный остаток, который кристаллизутот при растирании с петролейным эфиром, 593659

Выход по всем стадиям 55% в расчете ,на исходный H-6Сп вЂ” Ot Bu (22 ), 2о (Й ) = -7,6 i соответственно Ь

-9,4 (с = 1р в уксусной кислоте).

55 Чис.Ьта продукта проверена хро. грфически в системах: и-бутаноп-педяпая уксусная кислота-Ьода 3;1;1 и и-гептан-трвтичный бутиловый спирт-педлная уксусная кислота 5:1:1, 60

Рассчитано /найдено,7: С 57/98/57,70

5 т,пл, 92"С (с разл.),Щ =8,5 (с вЂ” 1,0

Р в метиловом спирте).

Выход 110 г (98% от теоретически рассчитанного значения).

Г. Бензипоксикарбонип-" -аспарагинип-Н -трет.-бутипоксикарбонип- " -лизин.

Раствор бензилтриэтипаммонийной соли, полученной из 51 r П -трет.-бутипоксикар6 бонип-4-пизина в 700 мп диметилформамио да перемешивают в течение 48 час при 20 Сщ с 81 r 4-нитрофенилового эфира бензипоксикарбонил-. L -аспарагина и 1,эквивапентом пиридина. Реакционную смесь упаривают в вакууме, остаток обрабатывают этиповым эфиром уксусной кислоты и раствором кисло- 5

ro сернокислого калия. Образовавшийся рыхлый осадок отфильтровывают и затем перекристалпизовывают из смеси этилового спирта и ",петропейного эфира, т. пп. продукта

174-175 С (с разп.), А) = +13,8 (с =. 20

1,0, в: пиридине). Выход 70 r (71% от теоретически рассчитаннбго значения). .;.Д. трет.-Бутиповый эфир бензипоксикармC бонил- Ь -аспарагинил- -трет.-бутипоксикарбонип-4 -лизипглицип- L -гпутамина. 25

Раствор 61,5 г дибензопсупьфимидной соли трет.-бутилового эфира глицип- 4 -гпутамина и 54,5 г бензипоксикарбонил- 4 -аспара-.

6 гинил- Й -T per.-бутипоксикарбонил-L вЂ”.лизина в 700 и диметилформамида смешивают о. при 0 С .вначапе с 15,5 мп триэтиламина и затем спустя 15 мин с 13 r 14 -оксисукцинмида, а также 23. г N, N -дициклогек- . сипкарбодиимида. Реакционную массу перемео шивают при 0 .С в течение 3 час, .затем тем- З5 пературу поднимают до комнатной в течение последующих 24 час,перемешивание продоп1 жают при комнатной температуре, N, 8 -дицикпогексипмочевину отфильтровывают, фипьтpaT ynapaBKoT в вакууме. Полученный остаток кристаппизуют из этилового эфира уксусной кислоты, Продукт чистят перекристаллизацией из смеси метилового спирта, воды и изопропипового спирта и этилового эфира уксусной киспоты, т.. пп, продукта 155-156 С, о (1

12О» oî

А1> =. -20,8 (с - 1,0, в этиповом спирте). Выход 63 r (78% от теоретически рассчитанного значения).

Е. Гидрохлорид трет.-бутипового эфира

L -аспарагинил-М -трет.-бутилоксикарбонипЕ 50 вЂ” Ь -пизипгпицип- ) -гпутамина.

47 5 г трет.-бутипового эфира бензипоксиЭ с карбонил- L -аспарагинип- 14 -трет.-бутипоксикарбонил- Ь --пизилгпицип-4 --гпутамина (получен в соответствии с пунктом Д) в 800 мл метипового спирта гидрируют в описанных выше усповиях. Значение рН поддерживают постоянным (5,5) с помощью 25,2мп 2,5 н, раствора хлористого водорода в метиповом спирте, Осадок отфильтровывают, фипьтрат упаривают,образующийся при этом маспообрпаный продукт Ilpa растирании с диэтипопым эфиром кристаллизуется, давал бесцветное порн::вЂ” о вЂ” . о кообразное вешество, т. пп. 98, fg ) = +9„"1" (с вЂ” 1,0,. в метиловом спирте). Выход 1() г (97% от теоретически рассчитаннси-о „;, 1е ния).

Ж. трет.-Бутиповый эфир, N -трисвЂ”

-бензипоксикарбонип- L вЂ” аргинип- 4 вЂ” аспарагимЕ нил-М -трет.-бутипоксикарбонип- " -пизипгппцип- 4 -гпутамина, 3l,9 r гидрохпорида трет.-бутипового

Е эфира L -аспарагинип-Й -трет.- бутипоксикарбонил- L â€ .пизилгпицил- " -гпутамина (подученного в соответствии с пунктом Е) и

33,68 г N -оксисукцинимпдного эфира N, ((-трис-бензипоксикароопип- Ь -аргинина

Д * ю в 1 л диметилформамида смешивают при О"С с 7 мп триэтипамина. Поспе 24 час перемешивания при комнатной температуре реакционную смесь упаривают в вакууме, остаток переосаждают из метипового спирта и воды и затем перекристаппизовывают из метипового спирта, получают бесцветный пороц2о,о кообразный продукт, (А) которого -7,6 (c =- 1,0, в ледяной уксусной кислоте). Выход 46,5 г (80% от теоретически рассчитанного значения).

3. Гидробромид дигидрат трет.-бутипового эфира Ь -аргиннп-(гидробромид)- 4 -аспарагинип-Й -трет.-бутилоксикарбонип-(iвЂ” е

-naaanrnauari- Ь -гпутамина.

ck Д.

45,5 г трет.-бутипового эфира N, )(Ю

Й -трис-бензипоксикарбонип- L -аргинип-и

-аспарагинип-Й -трет.-бутипоксикарбонипE вЂ” L -пизилгпицил- L -гпутамина (попучен р соответствии с пунктом Ж) в 1,5 и смеси диметипформамида и метилового слирта (2: 1) подвергают гидрогенолитическому деаципированию при поддерживании постоянного зна ения рН (4, 5) с помошью 80 мл 1 н, pac гвора бромистоводородной кислоты. Осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме, остаток переосаждают из смеси этилового спирта и диэтипового эфира, попучают аморфное порошкообразное вещество с (А) = -4,8 (с = 1,0, в 80%-ной уксусной кислоте). Выход продукта 37 г (98% от теоретически рассчитанного значенил).

Н 6,69/6,5Ц И 13,29/13,29; 0 22,02/

/22,"45.

Бензипоксикарбонильные защитные груп.пы удаляют посредством каталитического гидрогенолиза при добавлении двух эквива лентов бромистого водорода. Получают фрагмент I, a именно H-Arg (НВ1")-Asn -livs(BOC)-5ev- Вп -01 Bu HBl (18-22 Ъ ).

Выход 98%, j6.) =, -4,8+ 1, соответстго о венно fries =. вЂ”..6 05 .(с 1 в 80%-ной ук- lg

20»

5ф, сусной кислоте). Чистота проверена хроматографически в системах: н-бутиловый спирт ледяная уксусная кислота-вода 3!1:1 и третичный амиповый спирт-пиримидин-вода 35:

:-35: 30.

Рассчитано/найдено, %: С 40,21/40,46;

Н 6,85/6,93; Н 16,12/15,89; Br 16,72

/16,51.

Пример 2. Получение фрагмента Й (частичная последовательность 14-17). 26

Эфир бензилоксикарбонилдипептида (1617а) получают конденсацией - -"ve (BOC}

-0$Ч (16) и Н-Яи(01 Bu)-ONe (17).

Последующее шепочное омыление эфира и следующее за ним каталитическое диацилиро- 25 вание через дипептидное производное (1617 ti ) приводит к получению Н- (чь (ВОС). -+au (0 t Bu ) ОН (16-1 7 c).Ïðoäóêò êoí денсируют дважды последовательно с 4 вЂ”.Яеч-(01:Bu )-08Ч (15,соответственно,36

14), причем каждый раз в качестве главно го компонента применяют производное глу.таминовой кислоты. Таким способом получа- ют фрага ент 2Й, а именно Z -Qeu-(OXBU)-Cjeu (0 Bu )-Ьч (BOG) цЕи.-(0 Bu }- 35

-OH (14-17а). Названные продукты получают способом, описанным в примере 1.

Выход 48% в расчете на исходный Н-ахеи (Ot Bu )-ОИе (17)р т, пл. продукта 147- 40

149 С.

Z0 АЗ.р = -9,8.вЂ” 1, соответственно А) 4. .= -12,3 (с - "1, в диметилформамиде);чистоту проверяют хроматографически в системе. циклогексан-хлороформ-ледяная уксусная кис- 45 лота 45:45:10.

Рассчитано/найдено, %: C 59,02/58,70;

Н 7186/8в04; И 7е48/7ь72, Пример 3. Получение фрагмента ill (частичная последовательность 12-1 3).

5О

Для получения й, H, N -трис-бензилокА д 09 сикарбонил- Ь-аргинил- Ь-лейцина 30 г 7„ .-Al g (Ю,Ю= }-ОьМ (12) и 11,6 r лейцина (13) вводят во взаимодействие при

55 перемешивании в течение. 18 час в смеси диоксана и воды (1000:500 мп) после добавления 89 мл 1 н. раствора гидроокиси натрия, Подкислив 89 мл 1 н. соляной кислотЬ реакционную смесь обрабатывают эти

60 ловым эфиром уксусной кислоты, раствор промывают разбавленной соляной кислотой и водой, сушат над сернокислым натрием, растворитепь отгоняют в вакууме. Остаток переосаждают из смеси вода-метанол и этйловый эфир уксусной кислоты-диэтиловый эфир-петролейный эфир, Выход 26,6 г (86,6% от теоретически о рассчитанного значения); т. пл. 126-128 С; р = -5, 8 + 1, соответственно (А) д4 =

2о

= -7,1 (с = 1, в уксусной кислоте). о

Чистоту продукта проверяют с помощью хроматографии в системе: н-гептан-третичный бутиловый спиртуксусная кислота (5:

:1;1).

Рассчитано/найдено, %: С 62,6/62.59:

Н 6,28/6,41; И 10,15/9,94.

Аминокислотный анализ: Ar g 1,00; 4еи

1,00, Пример 4. Получение фрагмента.Q

{частичная последовательность 9-11). Дипептид Н-Ы -Мп -ОН, вводят во взаимодействие с > - Еи(0 Bv )-0$" (9)в . в результате получают с выходом 74% фраг мент R, а именно Z -Ceu(04 Bu )- ЬЕи-5ell -ОН (9-11).

Условия проведения эксперимента, как о, в примере. 1„т, пл, продукта 146-148 С, го

f À) = 31,6, + 1, соответственно (Щ46 =

38,1 (с : 1 в метиповом спирте).

Чистоту продукта проверяют хроматографически в системах: н-гептан-третичный бутиловый спирт-ледяная уксусная кислота (5:1:1) и н-бутиловый спирчледяная уксусная кислота-вода (3 1 1).

Рассчитано/найдено, %; С 58,12/58 05;

Н 7,32/7,24; М 9,68,/9,48.

П р и м. е р 5, Пбпучение фрагмента (частичная последовательность 6-8)..

Соединение Н-Tvt (4Bu )-МЦ-OH (7»

-8) конденсируют с Z -TN> (Ф Bu )-ОЬМ (6 }, получают бензилоксикарбонилтрипептид (6-8а), который в результате каталитического гидрогенолиза давал желаемый фрагмент, а именно Н-ТЬ (tBu )-Тч) (4Bu )-Юч-ОН (6-8 Ъ ), Эксперимент. проводят в условиях, описанных в примере 1.

Выход продукта 81% по двум стадиям.в расчете на. примененный дипептид (7-8) у т,пл. 126-127 С, (<1+ = +7,9 +1, соответственно (ck)+<<= +8,9 (с = 1; в метиловом спи рте).

Хром атографический контроль чистоты про, дукта осуществляют в смеси третичного амипового спирта, пиридина и воды, взятых в соотношении 35:35:30.;

Рассчитано/найдено,%: С 60,88/60,69;

Н 8,30/8,31; М 8,88/8,91., в расчете на дипептид q 1/4 моля кристаллизационного этилового эфира уксусной кислоты, 59 3659

Пример 6. Получение фрагментами (частичная последовательность. 1-5), Карбодиимидным способом Х - Е-OH (4) объединяют с Н- Ðée-.Ot BU (5). В результате последующего каталитического гидрогенолиэа промежуточного эфира бенэилоксикарбонилдипептида (4-5a) выделяют. Н-ЗЬ-Т»Е-От, Вц (4-5 ц) с выходом вьпце

90%, Одновременно фосфораэо-способом конденсируют BOC-ЧаВ -ОН (2а) и H-Р»0-ОМ44 (За), в реэульrare чего получают эфир трет.вЂ” бутилоксикарбонилдипептида (2-3a). Последующее щелочное омыленйе сложного эфира приводит к получению с выходом более 70

ВОС-Yale;-Ðro-OH (2-3 Ь). Волее просто и с более высоким выходом (83 ) дипептид (2-3 Ъ ) получают конденсацией BOC-Ча3 -OS× (2 Ъ) с двумя эквивалентами пролина (ЗЪ).

Оба дипептидных производных объединяют с помощью карбодиимидного способа с образованием ВОС-ЧаК -Pro -ЛЕРЬе-Qtr33u (2-5а) . Воэдействие, трифторуксусйой кислоты на (2-5a). приводит к получению свободного тетрапептида Н-ЧОВ-рго ЗРЮ-РМ-OH) 2 5Ь ),к которому обычным и известным способом присоединяют ВОС-Р ие - 05> - (1 ) с образованием ВОС-РИе-ЧаР Pro ЭРЕ-РЬе-ОН (1-5а) (фрагмент VJ )., Условия эксперимента описаны в примере 1.

Выход продукта 63% по трем последним стадйям в расчете на (4-5), т. пл, 218 С:, fg)> = 64,2 = 1, соответственно ц) ) ., 20 + о . 20 о

-75,82 (с = 1,, в уксусной. кислоте)„

Хроматографическая чистота продукта цроверена в смеси н-бутилового спирта, ледяной уксусной кислоты и воды, взятых в соот. ношении 3 1 1 и в смеси третичного амилового спирта, пиридина и воды, взятых в соотношении 35:35:ЗО.

P aññ÷èraíî/Hàéäåíî,%: С 64,88/64,72;

Н 7,64/7,70; М 9,70/9,6 1, П р "и м е р 7. Конденсация фрагментов .1 вЂ” ф (полная последовательность 1-22), Фрагмент 1 (18-223 ), содержащий концевую карбоксильную группу, объединяют с фрагментом )l (14-17 а) карбодиимидным способом и полученный трет,-бутиловый эфир .И-бензилоксикарбонилнонапептида (14-224 ) посредством каталитического гидрогенолиза переводят в Н-JCU(01 BU )-4

-4ye (ВОС)-.6И- В»-01 Би . (14-22. Ь ).

Соединение с фрагментом И! с помощью укаэанного способа приводит к образованию

7.-Arg-(Ю -09 Z2)-Leu-Мц (01 ВU )-GPп (ОФ, Bu )-Ьчв(ВОС)-бали (0 BU )10

",-А»Я (HBr )-As» -"ч5(ВОС)-c,gq вЂ” C g» O 4 В u (12-22a) .

Каталитическим гидрированием из ундкапептида (12-22a) удаляют три бейзилоксикарбонильные защитные группы и в результате явйтрализации появившихся свободных гуанидиновых функциональных групп бромистоводородной кислотой в процессе гилрировония получают Н-А1 ф НВ ) ) Leu -56u (О 1 В о )>о -66о(01 Bu )- )чв(ВОС)-Ыц (01 Bv )-Arg(HBr. )-A5n -Ыэ(ВОС)-ЬЬ-Gtv-Ot В0 (12-22 Ъ ) в форме гидробромида.

Ундекапептид концентрируют с фрагментом 1V (9-11) указанным дициклогексил15 карбодиимид-N -оксибензотриазольным способом и из полученноготетрадекапептидного про- -. изводного (9-22 а) посредством гицрогенолитического отшепления бензилоксикарбонильных защитных групп получают H-ЬВи -(UXBO )26 - Leu -4Eu-Arg (НВ» )- Leu-G6u (О Bu )(;eu(O+ Bu ) Ьчв (ВОС)-C. (Ot. Bu )-Arg (НВ ь )-As» -)чв (ВОС)-Из-Ии-OtBu (9-.-22 Ъ ).

В процессе указанной реакции объединя25 лись фрагменты Ч (6 8а ) и ф (1 5a), последний. после переведения его в И -окси вЂ” сукцинимидный фир (1-5 Ъ). Однако чистый BOC-РЪ@-Ча1 Рго ЛВе РЬо Tht (Е Bu ) °

-Tsv (%au)-6 У -OH (1-8), получить не удалось, аминокислотный анализ показал наличие примесей в количестве примерно 10% (1-5а) или (1-5Ъ). Попытки разделения этой смеси остались безуспешными.

Полученный неочищенный участок (1-8) объединяют дициклогексилкарбодиимиц- МвЂ”

-оксисукцинимидным способом с указанным выше участком (9-22 Ь), в результате получают БОС-РИе -VaE-Рго -Э Ре -РИе Thv-(433u) -Туг (48 u) - QPy-Я! и (Q

После отщепления всех защитных групп с помощью безводной трифторуксусной кислоты

45. и последующей замены трифторацетатных ионов брома посредством ионообменной хроматографии на слабоосновной. ионообменной смоле "Дауэкс 44" (ацетатная форма) получают неочищенный лейцин-1 3-мотилин (1-22 Ь ), 50 который вследствие наличия неочищенного участка (1-8) имел ошибочную последовательность, что также подтвердилось при операции очистки.

Конденсацию фрагментов проводили в сле55 дующих условиях, А. Конденсация 1 co g

9,2 г фрагмента Х (в соответствии с примером 1 3), 9,36 г фрагмента g (полу« чен в соответствии с примером 2) и 1,4 мл триэтиламина в 200 мл диметилформамида

59 о смешивают при 0 С с 2,3 r И -оксисукцинимида и непосредственно после этого с

Зр 1 г Й ° М -дицикпоГексилкарбодиимидаа

Реакционную смесь перемешивают в течение о

24 час при 5 С и затем в течение 4 дней при комнатной температуре, после чего осадок отфильтровывают, а фильтрат упаривают в вакууме. Полученный остаток несклько раэ обрабатывают водой и наконец два раза переосаждают иэ метилового и этилового"о эфира уксусной кислоты.

Цолучают в форме аморфного порошкообразного вещества трет.-бутиповый эфир бензилоксикарбонип- L- -глутамип(f-трет,-бутиловый эфир)- -глутамил(g - грет.-бутиловый эфир-Я .грет.бутилоксикарбонил- I пизип- l, -Флутамил(g тр ет,-бутиловый эфир)- L. аргинил(гидробромид)- . »аспарагинил- M. - грет.-бутилоксикарбонил-..L

-лиаилглидилглГгамииа, а(1 = -14,В ж (а 1, а диметилфармамиде аа и

Выход 14,8 г (84% от теоретически рао. считанного значения).

Раствор 12,3 г полученного соединения в 800 мл метипового спирта при поддержании постоянного эначенйя рН подвергают каталитическому гидрированию обычным образом (рН 5,5, 7 мп 1н, бромистоводородной кислоты). Фильтратлупаривают в вакууме и полученный остаток дважды переосаждают из этилового спирта и этилового эфира уксусной кислоты., В результате в виде желаемого. продукта конденсации (14-22 b ) получают гидробромид, трет.вЂ”,бутилового эфира " -гпута ип()".-трет,-бутиловый эфир)- 4 -глутамил(- трет, -бутиловый эфир)-М -трет;бутилоксикарбо 6. нил- -лизил-" -глутамил(f -epee.-"áóòèttî-.

40 вый эфир)- Ь - аргинил(гидробромид)-:4 -аспарагинип- Й -трет.-бутилоксикарбонил-4 -ли6 ао о зипглицилглутамина jck3 =- 21,5 (с у 1,0,, в метиповом сцирте). !

ДЯ

Выход 11,4 г (96% от теоретическИ рассчитанного значения) ° а

Б. Конденсация (I - 6 ) с Е

Раствор 1,7 г пептида (14-22 ц ) 1,4 г

Дгр {8, Z,) Ьец-OÍ (12-13), 0,3 r

К-.оксисукцинимида и 0,14 мл триэтиламина в 100 мп диметипформамида смешивают при

-10.С с 0,412 r М, И -дициклогексилкаро 1 бодиимида и реакцоионную смесь перемешивают 24 час при 4 С, затем еще 24 час при комнатной температуре. Выделившуюся в оса док дициклогексилмочевину отфильтровывают, фипьтрат упаривают в вакууме и полученный после упаривания остаток переосаждают из . о метипового спирта и этилового эфира уксусг

9 12 ной кислоты. Полученный продукт тщательно обрабатывают водой, фильтруют и сушат.

В результате получают трет.-бутиловый эфир :Й, и, И -трис-(бензилоксикарбоА 6 нип- 4 -аргинип-4 -пейцип-L -глутамип-{Я -трет,бутиповый эфи )- L -глутамил(f-трет.-бутиловый эфир)- М -трет.бутилоксикарбонил-4 -пизил- 4 -гпу там ил(ф -тре т.-бу тиловый эфир)-4 -аргинил(гидробромид)-4-асЕ. парагинип-Ю -трет.-бутилоксикарбонип-,4.-лизипглицил- Ь -глутамина (12-22а).

Выход 1,94 г (85% от теоретически рассчитанного значения).

Хроматографическую чистоту продукта проверяют путем хроматографирования в смеси н-гептана,. третичного бутилового спир та и уксусной кислоты, взятых в соотношении 3:2:1,. и в смеси н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды, взятых в соотношении 3:1:1.

Душные аминокислотного анализа: ,Lw5 2.,02, Агц 2,01, Asp. 1,00, Â Û.

3,98, +83 1,01, 1 60:. 1,00, (1,8 г пептида в 500 мл метилового спир

-та подвергают деацилированию посредством каталитического гидрироваиия при добавлении по каплям 15,70 мп 0,1 н. бромистоводородной кислоты, при значении рН 4,5, Катализатор отфильтровывают. Фильтрат упаривают в вакууме, полученный остаток переосам дают из метипового спирта и этилового эфи ра уксусной кислоты, : Получают.дигидрат гидробромида трет; бутипового эфира ч -аргинип(гидробромид)- 4--пейцил-4 -глутамил-() -трет.-бутиповый эф )-Ъ -глутамил(-трет,-бутиловый эфир)«й -трет.-бутилоксикарбонип 4 -.лизил4 - 1

-гпутамил g-трет.-бутиловый эфир)-4 -aprttj нил(гидробромид)-4 -аспарагинил-И -трет.-бутипоксик арбо пил-.4.-лизипглицил-;Ь -глутамина (12-22Ъ ), Выход 1,61 г (98% от теоретически pad» считанного значения), Рассчитано/найдено,%; С 47, 12/47,20;

Н 7,43/7,50; .Й 14,07/14,00и .

В. Конденсация { 7 вЂ”-,,8-2) с L> -.

1,5 г пептида (12-22 ц ). и 0,87 r пептида (9-11) в 100 мл диметилформамида конденсируют в условиях, описанных в пункте Б способом, при добавлении 0,105 мл триэтипамина с 0,210 г Н -оксибензотри» азола и 0,320 г дициклогексилкарбодиимидаа

Получают дигидрат трет.-бутилового эфира Й -бенэилокси-карбонил- Й-глутамип(у-трет.-бутиповый эфир)-. 4 -лейцип- 4-глута/ минил-.L -аргинил(гидробромид)- L-лейцип- Й »глутамип(f -трет.бутиловый эфир)- Й,Ф

-трет.бутипоксикарбонил- Ь -лизил-, -глутамил(, ф -трет.-бутиловый эфир)-.) -aprnnttn(rttn»

593659 робромид)- L -аспарагинил- М -трет.-бутилокЮ сикарбонил- 1 -лизилглицил- (-глутамина (9-22а).

Выход 1,6 г (83% от теоретически рассчитанного значения) .

Рассчитано/найдено, %: С 51,41/51,28;

H 7у 57/7у 55ý 8 1 Зу63/1 Зу 57е В1 а 6е22/

/6,15, 1,6 r пептида (9-22а) в 600 мл метился ваго спирта деацилируют посредством каталитического гидрирования,поддерживая посто-янным значение рН,по аналогии с описанным в пункте Б. Катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме и полученный остаток переосаждают. из метилового спирта и этилового эфира уксусной кислоты. . Получают тетрагидрат гидробромида трет.-бутипового эфира Ь -глутамил(Я »трет.-бутиловый эфир)- ь -лейцил-" -гпутаминип- ь-аргинил(гидробромид)- 14-лейцил-" -глута- 2е мил(Я -трет.-бутиловый эфир)- L -глутамил

Ч6 (f-трет.-бутиловый эфир)- -трет.-бутилоксикарбонил-..Ь -лизил- Ь -гпутамип(-трет.вЂ”

-бутиловый эфир)- L -аргинил(гидробромид)вЂ .L -аспарагинил- 8 -трет,-бутилоксикарбо- 25

Я нил-.1 лизилглицил-L -гпутамина (9-22 Ъ ), Выход 1,5 г (96% от теоретически растRo . о считанного. значения), (dL) > = -5,3 - 1 и

Ж@ <,= -7,2 (с = 0,7,. в метиповом спирте);

Хроматографическая однородность продук- 56 та показана в смеси н-бутилового спирта, уксусной кислоты и воды (3:1:1). бранные аминокислотного анализа:," 5

2,04, Агф 2,01, А5 р 0,98, Qgv 6,05, 6 М 1, 10,,4 60 2,00. 35

Г. Конденсация. с Ю, 2.1,6 г фрагмента ф и 6,9 г:И -оксисукцинимида в 400 мл диметилформамида о смешивают при температуре -5 С с 6,3 г И 8 -дициклогексипкарбодиимида. РеакциВ о онную смесь перемешивают 2 час при 0 С и затем в течение ночи при комнатной температуре. После фильтрования фильтрат упаривают в. вакууме. Полученный маслообразный продукт кристалднэуют иа изопропилово- 45 го спирта.

Получ ают > -оксисукцинимидный эфир трет;бутилоксикарбонил- 4 -фенилаланил- 4УвЂ”

-валил-.L -пролил- (. -изолейцил- ь -фенилал анин. Выход 21,3 r (88% от теоретически о рассчитанного значения), т. пп„190-192 С, Ю "- + 59,28 (с -" 1,0, в диоксане).

12,2 г фрагмента Ч и 3,8 мл триэтиламина в 400 мл диметипформамида смеши- .

55 вают с. 14>8 г укаэанного выше еукпинимидного остатка, полученного из фрагмента Ч .

После перемешивания в течение 24 час при комнатной температуре реакционную смесь упаривают в вакууме и полученный маслооб60 разный остаток распределяют между этиловым эфиром уксусной. кислоты и раствором лимонной кислоты, Раствор продукта B этиповом эфире уксусной кислоты прочывают, сушат и упаривают в вакууме досуха. Из смеси этилового эфира уксусной кислоты и петролейного эфира получают в виде бесцвет ного кристаллического вещества трет,-бутилоксикарбонил- L -фенипапанил- Ь -валил- Ь

-пролил- 4 -изолейцил- Ь -фенипаланил-0-трет.-бутип-1 -треонип-О-трет.-бутип- " »тирозилглицин (1-8).

Выход 18,2 г (87% от теоретически рас-, считанного значения), f4) = -44,0 (с -"

12о о 1 О, в эти lOBoM спирте). ., Д. Конденсация (1 -и -6 вЂ” Л) с {W -. {1).

1,28 г пептида (9-22 ц), полученного в соответствии с пунктом В, 1,17 г пептпда (1-8), полученного в соответствии с пунктом Г, О,О7 мл триэтиламина и 0,13 5г

H-оксисукцинимида (или в другом опыте

0,20 г М -оксибензотриазола) в 100 мп диметилформамида смешивают при темперлf туре -10 с 0,206 г И, И -диииклогексипкарбодиимида. Реакционную смесь перемешио вают в течение 2 дней при О С и в течение

3 дней при комнатной температуре. Полученный после удаления растворителя в вакууме остаток тщательно обрабатывают нагретым этиловым .эфиром уксусной кислоты, смопообразный продукт переосаждают из метилового спирта и этилового эфира уксусной кислоты и после растирания с этиловым эфиром уксусной кислоты сушат. Затем в течение 5 час продукт тщательно обрабатывают водой и переосаждают из метилового спирта и воды.

Получают гексагидрат трет.-бутилового спирта и -трет,-бутипокспкарбонил- 4 - IKHBilаланил- "-валил- 4-пролил- ь -изолейцнл- h-фенилаланил-О-трет,-бутил- L-треонил- O вЂ”-трет,вЂ”.бутил- 4-тирозилглииил- L -глутамип (Я -трет.-бутиловый эфир)-„4 -лейцил- L -глутаминил- Ь -аргинил(гидробромид)- 4- лейлал- L-тлутамлл(-трет.буталееаа1 еаар - I

- глутамил(® -трет.- бутиповый эфир)- М

»трет,-бу тил окс ик арбо пил-,4 -лизи п- 4 - глут амил(-трет„-бутиповый эфир)- 4 -аргинил(гидробромид)- ) -аспарагинил-М- -трет.-byrnnф оксикарбонил- Ь-лизилглицил-(у --гпутамина (1-22а), Выход 1,65 г (91% от теоретически рассчитанного значения).

Рассчитано/найдено, %: С 54,03/54,13>

Н 7,82/7,80; Р 12,68/12,67 Вг 4,38/

/4,6.

1 г защищенного пептида (1-22а), полу ченного в соответствии с пунктом Д, смешивают с 40 мл охлажденной льдом трифторуксусной кислоты и смесь выдерживают в течение 2 час при комнатной температуре. Избыточное количество трифторуксусной кисло593659

l5 ты удаляют в вакууме при возможно более низкой температуре, полученны.й остаток раст воряют в разбавленной уксусной кислоте, раствор два раза обрабатывают 4 г слабо основного енионообменника в ацетвтной фор5 ме (например, "Йеуэкс 44"), после чего элюет, полученный после проведения ионного обмена, подвергают лиофилизации, Получают . 1 -фенилаленил-4 -валил-..4вЂ” .-пролил- L --изолейцил- 4 -фенилаланил-. 1 -тре- 10 онил- L -тирозилглицил-,Ь -глутемил- Ь -лейцил- "-глутаминил- Ь -аргинил-" -лейцил 4вЂ”

-глу тамил- 4 -глу там ил- .4 лизил-Ъ -my raMgn- Ь ергинил- L -еспарагинил-лизилглицил-. 4I

-" глутемин. Выход продукта 0,74 г.

Hp и м е р 8. Получение чистого продукта и аминокислотный анализ.

Очистку проводят с помощью ионообменной хроматографии при использовании сильно основной анионообменной смолы, напри- gQ мер, находящейся в ацетатной форме и известной поц" наименованием "ОАЕ-сефадекс .

А-25" смолы на.основе модифицированного декстрана с диэтил-(2-оксипропил)-аминоэтильными остатками в- качестве функциональ-25 ных групп, и затем при применении сильно . кислой катионообменной смолы, например, находящейся в аммонийной форме и известной под наименованием Ь Р-сефадекс С-25 смоi лы не основе модифицированного декстрана . 30 с сульфопропильными остатками в качестве функциональных групп.

Аминокислотнйй анализ проводят после кислого гидролиза (6 н. солянея кислота) пептида, причем оказалось, что практически 3 одинаковые значения достигаются при проведенйн гидролиза в ч ечение 20 и 72 час. Полученные результаты представлены ниже.

Найдено Рассчитано

4 s.2ОО 2 40

Ar g 1,93 г.

AsP 100

Т11 т 0,97 1

4Вц 6,18 6

Рго 098 1 45

ИЧ 1,99 2 <4 О 90 1 аде 090

1е 94 2

0,93 1

Р 6 1,82 2

Биологическая активность свежевысушев ного .Ь -лейцин- 13-мотилина практически равна активности -4 -норлейцин-13-мотилина, таким образом, почти не отличается

or активности природного мотилина.

Формула изобретения

Способ получения 4 -лейцин-1 3-мотилина формулы 1

2 3 1 к б Т 6 9

H--Рпе-Май-Рго-ÝÎå-Phe-Тпг-Тмг-Цч-660 о Л 12 43 44 45 6 4> f8

-Leu-.gin-Àãä - Ьви-й8о-Qpu-gys-(flu-Ar g 9 2О 24 Z2

-Jan-Ьу5 С„Е -гЕп-0H отличающийся тем, - что подвергают конденсации в любой цоследовательиос. ти защищенные фрагменты: трет.-бутиловыф эфир аргинил(гидробромид)-еспарагинил-р -трет.-бутилоксикарбониллизил-глицил-гнутамине (18-22).„, -трет.-бутиловый эфир Й

Ot, -бензилоксикарбонил-глутемил(ф-трет.-бутиловый эфир)-глутамил (Я -трет.-бутиловый эфир)- N -трет.-бутилоксикарбониллизил-.глу-

Е" таминовой кислоты (14-17), N, г(, N

al д .

-трис-бензилокс икарбонил-4- -ар гинил- .4 -лейцина (12-1 3), Й -бензилоксикарбонилглу.й тамил(f трет.-бутиловый эфир)-лейцилглутамина (9-.1 1) О-трет.-бутилтреонил О-.трет.

Ы;

-бутилтирозил-глицина (6-8) и Й -трет;бутилоксикарбонилфенил аланил-валил-.пролил-изо лейцил-фенилаленина (1-5) с помощью 9 Й -дициклогексилкарбодиимид-Я-оксисукциI нимида.и удалением защитных групп трифторуксусной кислотой.

Источники ифиормации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Авторское свидетельство по заявке

Хю 201392,8/23-04,. кл. С 07 С 103/52, 1974, 2, Шредер Э., Любке К. Пептиды, ч. I

Ч., "Мир, 1967, с. 116.

593659

Z-6ty -Î2Ój21) Н-6!о-ОФВи РВО! (22nj

ВОС

Z-Atttt-О2ЧР!22) 22-tytt-tt22tt2О г-6юУ-62л вЂ” Ot2tu (22-22а/

Рг/ВО

22-6!у-6!и-O2Btt ° РВО! (22-222) 1

3 Asm вЂ” yd вЂ” О

-20