Способ очистки биологического материала

 

Союз Советскнк

Сецнаннстттчееитт к

Республик (6() Дополнительный и патенту (22) ЗаЯвлено 080776 (23) 2380201/28-13 (5l) N. Кл.

А 61 К 47/Оп (23) Приорнтет - (З2) 09.07.75

Государственный камитеI ссГР о делам нтнбретеиий н открытий (8() 7507854-3 (>3) Швеция (%) УДК 576, а...093.38 (688,8) I

Опубликовано 1501.8(1Бюллетень М 2

Дата онублнкованнй описания 1501.80 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Ларс-,Олов Андерссон, Хокан Гуннар Bopr н Гудрун Моника Эйнарссон (Швеция) Иностранная фирма Актиеболагет Каби (Швеция) (71) Заявитель (54) СПОСОВ .ОЧИСТКИ БИОЛОГИЧЕСКОГО MATEPHAJIA

ОТ ВИРУСА ГЕПАТИТА В

Изобретение относится к медицинской промышленности и касается очисткн биологического материала.

Известен способ очистки биологического материала от вируса гепатита В путем сорбции исходного материала, преимущественно крови, на сорбент (1) .

Однако известный способ является трудоемким и не обеспечивает высокой степени очистки.

Целью изобретения является повышение степени очистки и упрощение способа, Эта цель достигается тем, что в качестве сОрбеита используют водо" нерастворимую матрицут кавалентно связанную посредством таких групг как . @

О-С" НЙ1 -О-С- NH - ИЧ- к

NH . нн

-йй-(сн 1- щ2 g-ь " т -С "тсн-члч-NH-cQ- щ с гндрофОбным лнганлом, Кроме Того, в каче -!âе водонерастворимой матрицы используют сефарозу.

4f

B качестве сорбента использую; водонерастворнмую Матрицу в виде высокомолекулярного карбогидрата или пластичного вещества, ттесущеГо гидрофобный лиганд, состоящий нз углеродной цепи, содержащей более 7 атомов углерода,или иэ системы кондеи. сированных ядер.

В качестве матрицы в сериях нс" пользуют сефарозу 48„ e a качестве . ,лиганда следующие вещества: гексиламин, глицилнорлейцин,глицил»Ж-ФЬ нилаланин, циклопентиламин, цикло- гептиламин, фенилэтиламин, гексаметилендиамии, октиламин, дециламин, додециламин, октадециламин, гекса- метилендиамин,. цистеамин, октнлннтарную кислоту, гексаметилендиамннт цистеамин.

При использовании в качестве матрицы сшитой различным образом сефаро-, зы 4В, и:качестве лиганда. используют, следуйщне вещества: этилендиамин,- бутилендиамин, гексаметилендиамин, каприлгидразид, тетрадециламин, 2-.амннододекан, этилендиамин.

Прн.использовании в качестве матрицы полиакриламида,в качестве лиганда используют пропилея.

71050 4

П р и и е р 1. Удаление AUантигена из плазмы в результате абсорбцией коньюгатом.

В Качес.тве матрицы используют сефароэу> а в качестве лиганда этилендиамин-октилянтарную кислоту.

Получение гель-производного.

Активацию сефарозы осуществляют тщательным промыванием 100 мл седиментированной сефароэы 4В водой. Затем избыток жидкости удаляют фильтрацией на фильтре, работающем под разрежением перед тем, как гель переносят в раствор 4 r цианогенбромида в

100 мл дистиллированной воды.

После установления равновесия в течение 15 мин при перемешивании и охлаждении в бане со льдом суспензию геля активируют при рН 11 в течение 6-7 мин, Величину рН поддерживают постоянной добавлением 4 М раствора гидроокиси натрия. Щ

Для сочетания этилендиамина активированныР: гель промывают на стеклянном фильтре холодным 0,5 М раствором натрий бикарбоната-карбоната при рН 9,8, перед тем как его переносят в раствор 10 r этилендиамина в 100 мл дистиллированной воды, рН которой устанавливают равной 9, 8 с помощью концентрированной хлористоводородной кислоты. Реакционную смесь оставляют при перемешивании н течение 20 ч при комнатной температуре. Полученный .в результате гелевый продукт тщательно промывают.

25 мл водной суспензии полученного в результате вспомогательного геля суспендируют в 20 мл диоксана. По каплям добавляют свежий раствор б r октилянтарного ангидрида в 60 мл диоксана при перемешивании, при комнатной температуре, рН поддерживают 7, 5-8 добав-@О лением разбавленного раствора гидроокиси натрия. Адсорбент тщательно промывают диоксаном, смесью диоксана и воды (2:1), водой, 1 М раствором хлористого натрия и буфером, состоящим из 0,05 М трио-буфера, 0,02 М ци .рата натрия и 0,10 М хлористого натрия, при рН 7,5.

Выход реакции сочетания в расчете на октилянтарную кислоту опреде- 5О ляют методом ЯМР, он составляет

4,8Ъ.

Этилендиамин может быть заменен на 1,4-диамивобутан и 1,6-диаминогексан с получением эквивалентных результатов, Испытание на антиген. В качестве исходного материала используют плазму с положительной реакцией на антиreн с титром 1:64 и 1:32, 6Î

Значения титра приведены относительно стандарного антигена.

В каждую из 6 трубок добавляют 2мл антигена-положительной плазмы и 2 мл суспензии, состоящей из 3 ч. тщательно 6$ седиме нт иро ван ного адсорбен та, уравновешенного испытательным буфером и .1 ч. этого буфера. Образцы двигают в течение 1,2,5,10,20 и 30 мин соответственно и гели отделяют центрифугированием, Исследование верхних слоев на присутствие антигена дает отрицательную реакцию.

Пример 2. Удаление Ао-антигена из плазмы в результате адсорбции коньюгатом сефаооза- (гексаметилендиамин-додецилянтарная кислота) .

Получение гель-производного.

Для сшивания сефарозы 100 мл геля смешивают с 2 мл эпихлоргидрина и

0,5 r борогидрата натрия. Смесь перемешивают при 60 C в течение .1 ч.

Гель тщательно проьжвают теплой водой и смешивают с раствором 0,25 г натрий-борогидрида, растворенного в 50 мл 2 М гидроокиси натрия. Смесь помещают в автоклав при 120 С на

1 ч. Затем гель промывают щелочным раствором борогидрата натрия. Медленно добавляют концентрированную уксусную кислоту до рН 4. Затем гель промывают достаточным объемом воды.

Получение вспомогательного геля из сефарозы и гексаметилендиамина проводят по методике примера 1.

25 мл полученного вспомогательного геля переносят на стеклянный фильтр и проьывают смесью диоксана и воды (2:1) перед сушкой на фильтре с разрежением и переносом в свежий раствор 1 r додецилянтарной кислоты, 1,5 г водного растворимого карбодиимида, М -цикI логексил- N -(- (((-метилморфолиноэтил).

-карбодиимид-и-толуил сульфонат в

60 мл смеси диоксана и воды (2: 1), Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч перед перенесением на стеклянный фильтр и тщательной промывкой диоксаном, смесью диоксана и воды (2:1), 1М раствором хлористого натрия, водой и испытательным буфером.

Выход реакции сочетания в расчете на используемую жирную кислоту по методу ЯМР составляет 2,0%.

Испытание на Аи-антиген.

Плазму с положительной реакцией на AU -антиген, имеющую титр 1:128, используют в качестве исходного вещества. Колонку набивают гель-производным, уравновешенным испытательным буфером. 7 мл плазмы с положительной реакцией на À()-антиген с помощью насоса приводят в контакт с гелем (скорость подачи антигена 5 мл/ч).

Испытательный буфер добавляют до прекращения элюирования протеинового материала,что устанавливают УФ-сканированием.Собранный элюат имеет отрицательную реакцию, С помощью диалиэа под давлением элюат концентрируют в

10 раз и он сохраняет отрицательную реакцию на гепатит.

710504

60

Пример 3. Удаление АИ-антигена из плазмы адсорбцией на коньюгат сефароза-каприлгидразид.

Получение гель-производного .

Этилкаприлат переносят и соответствующий гидразид с помощью гидразинолиэа. 10 мл этилового эфира смешивают с 10 мл 98Ъ-ного гидразин гидрата. В качестве растворителя добавляют этанол (22 мл) до осветления реакционной смеси, после чего раствор оставляют при комнатной тем. пературе на 15 ч. Закристаллиэованный гидразид отфильтровывают и пролывают ледяной водой и водным раствором метанола (1:1) при комнатной температуре.

Сефарозу 4В активируют по приме1.

Гель проживают раствором агента сочетания и сушат в вакууме. Сочетание осуществляют н результате пере- Я носа активированного геля в 100 мл насыщенного раствора каприлгидразида, р аст нор ен но го н ди мет илформамиде (ДМФ) и О, 2 М бикарбоната натрия (1: 1) . Значение рН остается неизменным н ходе реакции сочетания, которую осуществляют при перемешивании при комн ат ной температуре в течение 15 ч. Полученный в результате продукт тщательно проплывают ДМФ, смесью ДМФ и воды (1:1), 1 М хлористым натрием, водой и испытательным буфером.

Выход реакции сочетания в расчете на гидразид по методу ЯМР составляет

2, ЗЪ.

Испыт ание íà Аи -анти ген.

B качестве исходного вещества используют плазму с положительной реакцией на AU àíòèãåí с титром 1:128. К

2 мл суспензии, состоящей из 3 ч. тщательно седиментированного адсор-. бента, уравновешенного испытательным буфером, и 1 ч. этого буФера, добавляют 2 мл AU-антиген-положительной плазжг. Смесь мягко перемешивают в 45 течение 30 мин и гель отделяют центрифугиронанием. Верхний слой имеет отрицательную реакцию на Аи -антиген.

Пример 4. Удаление Аи-антигена из раствора альбумина путем адсорбции на коньюгат сефароза-(этилендиамин-октилянтарная кислота).

Получение гель-производного.

Геленый коньюгат получают в сооТнетстнии с примером 1.

Испытание на Аи-антиген.

Раствор альбумина с положительной реакцией на Аи-антиген с титром

1:64 и полученный н ходе фракционирбвания антиген положительной плазмы используют в качестве исходного материала. Адсорбцию проводят периодически согласно примеру 3. Верхний слой испытывают на антиген, получают отрицательную реакцию;

Пример 5. Удаление АИ-антигена из концентрата с коэффициентом коагуляции в результате адсорбции на коньюгат сефарэза-(этилендиамин-октилянтарная кислота).

Получение гель-производного.

Гелевый коньюгат получают согласно примеру 1.

Испытание на Аи -антиген.

Антиген-положительную плазму используют для фракционирования концентрата, включающего коэффициенты коагуляции ° Готонят IЪ-ный протеиноный раствор, который имеет титр антигена 1:32. На стеклянный фильтр со слоем из 5 мп гель-производного, уравновешенного испытуемым буфером,. добавляют 10 мл протеинового испытательного раствора и гель промывают

3 х 5 мл испытательного буфера. Элюаты исследуют на Аи -антиген, получают отрицательную реакцию.

Пример б. Удаление антиге.на из плазмы адсорбцией на коньюгат сефароза-тетрадециламин.

Получение гель-производного.

Сефарозу активируют в соответствии с примером 1.

Для реакции сочетания 100 мп сефарозы, актиниронанной цианогенбромидом, которую уравновешивают 95Ъ-ным этанолом и сушат на фильтре под разрежением, добавляют к раствору 22 r тетрадециламина н 100 мл 95Ъ-ного этанола. Смесь оставляют при комнатной температуре при перемешивании на 48 ч. Гель тщательно..промывают теплым 95Ъ-ным этанолом, водным раствором этанола (1:l) IM раствором хлористого натрия, водой и испытательным буфером, Выход реакции сочетания по методому ЯМР составляет

4, 3Ъ.

Испытание на AU -антиген, В качестве исходного. вещества используют Аи-антигенположительную плазму с, титром 1:128. На стеклянный фильтр со слоем из 10 мл гель- . проиэводного, уравновешенного в испытательном буфере, добавляют 35 мл плазмы. Материал промывают 3 х 10 .мл испытательного буфера и элюаты исследуют на ДИ -антиген ° Элюаты дают отрицательную реакцию.

Пример 7. Удаление ДИ-антигена из плазмы адсорбцией на коньюгат сефароз а-2-аминододекан.

Получение гель-производного.

2-Додекан превращают в соответствующий амин реакцией с гидроксиламином с получением соответствующего оксима с последующим каталитическим гидрированием и элиминированием воды.

Сефарозу используют в соответстнии с примером 1.

Для сочетания 100 мл геля, акти- . нированного цианогенбромидом, промы вают 95Ъ-ным этанолом, подвергают сушRB на Фильтре под разрюкением я до бавляат к ра.створу 10 г 2-.ами:o-qo: декана в. 10С мл 95%-ного зтанола.

Смесь оставляют стоять при пере.мешиваиии при комнатной температуре в течение 46 ч, после чего гель тщательно промыВают теплым 95%-ным этаиолом, водными раствором этанола (111)< iN раствором хлористого натрия водой к. испытательным буфером, Выход реакции сОчетания по метОДУ, ЯИР составляет 1,0%.

Испытание на Ао-антигeн.

3 качества исходного материала ис: пользуют Аи-антиген-положительную плазму с титром 1:128.Опыт проводят согласно примеру 3,верхний спой дает отрицательную реакцию, П р H м е р 8. Уцаленне М -антигена иэ плазмы адсорбцией на коньюгат сефароза- (зтилендиамииундецен-10- 36

-кислота, .

ПОЛУЧЕНИЕ ГЕЛЬ-ПРОИЗ ВОДНО ГО.

Систему сефароз а-этиле иди амин получают coxvlacHO ПРимеру 1. K свежему раствору 1,85 г ундециленовой кислоты Я и 2,1 г дициклогексилкарбодиимнда, растворенному в 100 мл диоксана, добавляют 100-мл коньюгата сефароза-зтилеиднамин с последующим уравновешиванием диоксаном и фильтрацией в ;) .Вакууме. Гелевую суспеизию оставляют гри перемешивании на 15 ч при комнатной температуре, прем-знают диоксанОм, смесью диоксава и води (1:1), 1И раствором хлористого натрия и испытательным буфером.

Выход реакции сочетания в расчете на жирную кислоту по методу ямР составляет 2,3%.

Испытание на Аи-антиген.

- В качестве. исходного вещества ®О используют Ац-антиген;положительную плазму с титром 1:128. Опыт проводЯт согласно примеру 3, Было обнаружено, . чтО верхний слой имеет. отрицательную реакцию на антиген, Ц

Пример 9. Удаление Ау-антигеНа из плазминогенного концентрата адсорбцией на коньюгат сефароза. -каприлгидраэид.

Получение гель-производного. . я Релевый коиьюгат. получают согласно . щ,." ямеру 3, . испытание на Ац анти ген .

K 2 мл плаэминогенного раствора добавляют 0,5 мл плаэьи с высоким у ссщержанием антигена, и эта смесь дает положительную реакцию на антигей. Смесь пропускают через колонку высотой 4 см, загруженную 10 мп . гель-коньюгата, уравновешенного испытательным буфером. Фракции собирают и испытывают. Было обнаружено

: что элюат, содержащий ллазминоген,,цайт отрицательн ю реакцию .

- Пример 10. Удаление AU-ачтигена из плазмою адсорбцией на коньюгатполяакриламид- (пропилендециламин )

Получение гель-производного.

Попиакриламид S QgбГ Р 300 оставляют набухать в воде и тщательно промывают 0,05 М раствором натрий

Фосфатного буфбера с рн 7. для ррсТНвации процесса 20 мл гелевой суспеизии в буФере (0,5. сухого геля/25 мл буфера) смешивают с-5,0 мл глутарового альдегида и инкубируют при 3? C в течение 18 ч. После этого гель... тщательнО прОмы в ают дио кс аном у сме сью диоксана и воды (3:2),водой и ис.гаятательным буфером.

Испытание H B AQ — aHTH ген е

Антиген-положительную плазму о титром l."128 используют в качестве

Исходного вецества. Опыт проводят согласно примеру 3. При испытании верхнеГо слоя было обнаружено, что он отрицателен.

)1 р и и е р11,,Удаление Ап-антигена из плазмы адсорбцней на коньюгат сефароза- (цистеаминоктилянтарная кислота).

Получение гель-производного.

Систему сефароза-цистеамин получают восстановлением сефарозацистамина, который получают согласно примеру 1 в присутствии 0,05 М меркаптоэтанола в 0,1 N карбонатном буфере При рН 8,5 втечение 1 ч, Гель интенсивно про ивают карбанатным буфером, водой и наконец диоксаном. К раствору 1,2 г октипянтарной кислоты

-в 40 мл диоксана добавляют раствор

1, 84 г дициклогексилкарбодиимяда в 10 мп диоксана и 25 мл сеФароза-цистеамн на через 2 ч при.перемешиванни при комнатной температуре, Через

2 ч гель: промывают.диоксаном. Реакционную методику повторяют и затем тщательно промывают Лиоксаном,смесью диоксана и воды, водой и 0,1 И .Карбоната при рН 8,5, Оставшиеся тиольные группы блокируют в результате обработки геля,бо мг иодоацетамида в течение 45 мин.Наконец,гель .промывают испытательным бубером. .(спытание наМ-антиген.

Антиген-положительную плазму с титром 1:32 исполЬзуют в качестве исходного материала. Адсорбцию,осуществляют .периодически согласно примеру 3. Верхний слой испытывают на антиген и он дает.отрицатеМьную реакцйюз

Пример - 12. Удаление А -аНтигена из плазмы адсорбцией на .конъюгат сефароэа- (I åêñàìåòHëåíäêaèèHнафтил-1-уксусная кислота) °

Систему сефароза-гексаметилен диамии получают согласно примеру ).

25.мл полученного вспомогатепьнлго геля переносят на гтеилянн(й@ фидер и проживаю смес-.ью лц@кгайа и воль1 перед сушкей МЮ ЗРэм инаи

710504

Формула изобретения

Составитель С.Малютина

Редактор Н.Потапова Техред М.Келемеш Корректор И.Муска

Заказ 8785/53 Тираж 673 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Ра ская наб. д.4/5

Филиал ППП Патент, r.óæãîðoä, ул.Проектная,4 и переносом в свежий раствор 1,1 r нафтилуксусной кислоты, в 30 мл смеси диоксана и воды (3:2) . К гелевой суспензии добавляют 2,65 r воднорастворимого карбодиимида, N-циклогексил-Я-(-(й-метилморфолинэтил}3—

-карбодиимид-и-толуилсульфонат прн перемешивании и затем устанавливают рН 4,8 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты. Через 1 ч стояния при комнатной температуре

2,65 г водорастворимого карбодиимида добавляют во второй раз ° Смесь оставляют стоять еще на 1 ч при перемешивании .перед переносом на стеклянный фильтр и тщательно промывают диоксаном, смесью диоксана и воды (3:2), 1 M раствором хлористого натрия, водой и испытательным буфером.

Выход реакции сочетания в расчете на используемую нафтил-1-уксусную кислоту по методу HYP составляет 3,0%,20

Испытание íà Аи-антиген.

В качестве исходного вещества используют антиген-положительную плазму с титрами 1:32 и 1:64. Адсорбцию проводят периодически согласно 25 примеру 3. Верхний слой испытывают на AU -антиген, и он дает отрицательную реакцию.

Пример 13. Удаление Аи àíòèгена из плазмы адсорбцией на конью- ЗО гат сефароэа(гексаметилендиаминхолестерин кислый сукцинат).

Получение гель-производного.

Систему сефароза-гексаметилендиамин получают согласно примеру 1. 35

20 мл полученного в результате промежуточного геля переносят на стеклянный фильтр и промывают диоксаном, 10%-ным раствором триэтиламина в диоксане и снова диоксаном, перед сушкой на фильтре под разрежением и переносом в свежий раствор

О, 5 г кислого сукцината холестерина в 25 мл диоксана. Реакцию начинают в результате добавления 0 35 г дициклогексилкарбодиимида, растворенного в 1 мл диоксана. Сочетание осуществляют при перемешивании при комнатной температуре. Через

2 ч добавляют дополнительное количество карбодиимида и 2 ч спустя 50

råëü промывают диоксаном, смесью диоксана и воды, водой и испытательным буфером.

Испытание на AU -антиген.

Антиген-положительную плазму с у титрами 1:64 и 1:128 используют в качестве исходного вещества. Адсорбцию осуществляют периодически согласно ттримеру 3. Верхний слой испытывают на антиген и он дает отрицательную реакцию.

Пример 14. Удаление AU -антигена из плазмы адсорбцией на конъюгат сефароза- (гексаметилендиамин-холевая кислота).

Получение гель-производного.

Систему сефароза-гексаметилен диамин получают согласно примеру 1.

Сочетание холевой кислоты с полученным промежуточным гелем осуществляют согласно примеру 13, за исключением того, что 0,5 г холевой кислоты растворяют в 100 мл диоксана.

Выход реакции сочетания в расчете на холевую кислоту определяют методом

ЯМР, и он составляет 5,8Ъ.

Испытание на АИ -антиген.

В качестве исходного материала используют Аи -антиген-положительную плазму с титром 1:32, Адсорбцию проводят периодически согласно примеру

3. Верхний слой испытывают на антиген и он дает отрицательную реакцию.

Предлагаемюй способ обеспечивает высокую степень очистки биологического материала и упрощает технологию очистки.

1. Способ очистки биологического материала от вируса гепатита В путем сорбции исходного материала, преимущественно крови, на сорбент,о т л ич а ю шийся тем,что,с целью повышения степени очистки и упрощения способа, в качестве сорбента используют водонерастворимую матрицу, ковалентно связанную посредством таких групп, как — 0 — C — N jj — 0 — С вЂ” NR — МИ—

IE П

N3i ХН

И

-т Н- (СН вЂ” ХН- — С-NH.— unu — 3111- Co— г г-ь I 7 с гидрофобным лигандом.

2. Способ по п.l, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве водонерастворимой матрицы используют сефароэу 4В.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. 3,Вiotеchпic, Bioengineer, 16.1974, р.593.