Способ отсчета микродозы при прецизионной микроинъекции водного раствора в микрообъект пневматическим давлением и устройство для его осуществления
Союз. Советских
Социалистических
Республик (щ 721 1О7 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 270378 (21) 2594794/28-13 51 М л г
A 61 N 5/20 с присоединеиием заявки ¹
Государственный комитет
СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет
Опубликовано 150380. Бюллетень ¹ 10 (53) УДК 615. 473. 3 (088. 8) Дата опубликования описания .200380 (72) Авторы изобретения
Е. Г. Иванов, B.Т. Ларин и h3. A. Попов
Специальное конструкторское бюро биологического приборостроения AH СССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОТСЧЕТА МИКРОДОЗЫ ПРИ ПРЕЦИЗИОННОЙ
МИКРОИНЬЕКЦИИ ВОДНОГО РАСТВОРА В МИКРООБЪЕКТ
ПНЕВМАТИЧЕСКИМ ДАВЛЕНИЕМ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ
ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ, Йзобретение относится к медицинской технике, а именно к электрофизиологической аппаратуре для исследова ни я микрообъектов, н апример н ервных клеток и тканей.
Известен способ отсчета микродозы при прецизионной микроинъекции водного раствора в микрообъект (1) .
Заполнение кончика микропипетки при этом способе водным раствором производится эа счет капиллярных сил при опускании кончика микропипетки в,инъецируемый раствор. Выдавливание дозы в микрообъект (клетку) производится давлением воздуха, подаваемого в микропипетку. Величина инъекцируемой дозы определяется как объем конуса по формуле
9= — Fir h °
z. э
20 где r — радиус начального положения мениска;
h — высота инъецируемого столба жидкости в коническЬм кончике микропипетки.
Известный способ осуществляется с помощью устройства, которое имеет ,микропипетку, пневматический кран для подачи и снятия давления, манометр для замера внешнего давления, регулятор внешнего давлени я, ми крбскоп с окуляр-микрометром для отсчета дозы.
Однако по этому измерение диаметра кончика микропипетки, соответствующего начальному и конечному положению мениска, производится с большой погрешностью, равной половине цены деления шкалы отсчетного устройства окуляр-микрометра, что оказывается при отсчете инъецируемых доз малой величины порядка 10
10 мл, когда для отсчета используется зона кончика микропипетки с внутренним диаметром 1-2 мкм, а диаметр выходного отверстия составляет 0,1-0,5 мкм. Так как измеренные диаметры при расчете величины дозы учитываются в квадрате, а длина перемещения мениска в прямой зависимости, то диаметры конического кончика микропипетки, соответствующие началу и концу Перемещения мениска инъепируемого раствора, должны быть измерены с высокой точностью, но при измерении диаметров такого порядка оптическими средствами величина погрешности соизмерима с их величиной, а поэтому ошибка в измерении дозы может достигать 100-200%.
721107
2 ОС з г вводят водный раствор в микрообъект
Под давлением воздуха Рд .
Кроме того, устройство для осуществления способа отсчета микродозы йри прецизионной микроинъекции 60 водиого раствора в микрообъект снабжено редуктором давления, связанным с выходом регулятора внешнего давления, а кран для подачи и снятия давления выполнен трехпозиционным, причем 65
Целью изобретения является повы шение точности отсчета микродозы, а также снижение рабочих давлений : йри микроинъекции.
Цель достигается тем, что при осуществлении способа отсчета микро,доэы при прецизионной микроинъекции водного раствора в микрообъект после заполнения конической части кон ика микроципетки инъецируемйм раствором повышают давление воздуха до. величины, соответствующей началу перемещения мениска в направлении к кончику микропипет ки, рассчитывают конусность внутренней поверхности кончика микроципетки К по зависимости г 4А
P H где о — коэффициент поверхностного натяжения на границе инъецируеьый раствор - собственный пару 20
Р - давление, соответствующее на чалу перемещения мениска инъецируемого раствора в коническом острие микропипетки; 25
Н - высота от мениска до кончи. ка острия микропипетки; затем рассчитывают давление Р„, соответствующее останову мениска в моменr., когда в кончике микропипетки ЗО останется заданная величина микродоэы Чу после приложения этого давления, по формуле
2 ос
М К 35
Й,1-2,1К и, подав это давление внутрь микропипетки, вытесняют избыток инъецируемого раствора из микропипетки, после чего вводят ее в микрообъект 4() и подают внутрь микропипетки давле ние Р>, определяемое по зависимости где. r - радиус выходного отверстия конического острия микропипетки.
Кроме того, после определения конусноати К рассчитывают давление воз- () духа Р, подаваемого в микропипетку, соответствующее заданному объему микродозы V no формуле:
его дополнительный вход соединен посредством пневмопровода, снабженного манометром, с выходом редуктора давления.
На фиг. 1 изображено устройство для осуществления способа отсчета микродозы при преэиционной микроинъекции водного раствора; на фиг. 2 кончик микропипетки; на фиг. 3 положение кончика микропипетки, введенного в микрообъект; на фиг. 4 и, 5 - схемы, иллюстрирующие способ отсчета микродозы.
Широкая часть микропипетки 1 устройства (фиг. 2) должна иметь диаметр
1-3 мм и длину 10-60 мм. Первое сужение 2 микропипетки имеет угол нано лона 15-20, после этого следует постепенно сужающийся до нескольких микрон участок 3, имеющий длину 8-15мм.
Угол наклона этой части настолько мал, что можно считать этот участок цилиндрическим.
Участок 3 переходит в коническое острие 4 с конусностью порядка 1у8, 1:10. Внутренний диаметр выходного отверстия 5 кончика микропипеткинаходится в пределах 0,1-1 мкм. Чем тоньше кончик, тем меньше может быть травмирован микрообъект при введении в него микропипетки. Таким образом, внутренняя полость 6 кончика микропипетки имеет цилиндрическую переходящую в коническую форму, Иикройипетка (фиг.. 1) кончик ко/ торой опущен в сосуд 7 с инъецируемым раствором, установленным на сТо лике 8 с окуляром-микрометром микроскопа, широкой частью жестко и герметично закреплена в держателе 9, который жестко установлен, например, на трехкоординатном микроманипуляторе 10, позволяющем вводить кончик микропипетки в инъецируемый раствор или в микрообъект. Штуцер 11 держателя гибким трубопроводом 12 связан с выходом 13 трехпоэиционного крана 14 для подачи и снятия давления.
Отверстие 15 поворотной части трехпозиционного крана 14 попеременно связывает выход 13 (а, следовательно и внутреннюю полость микропипетки) либо с атмосферой (верхнее поло кение отверстия 15 — атмосфера ), либо через дополнительный вход 16 с выходом понижающего редуктора 17 давления через пневмопровод 18 и прецизионный манометр 19 (горизонтальное положение отверстия 15 отсчет ), либо с регулятором 20 внешнего давления посредством пневмопровода 21, тройника 22 и пневмопровода
23 (нижнее йоложение отверстия 15 инъекция ). Причем для установки дозы необходимо давление порядка
0,5-2 атм, устанавливаемое с высокой точностью, а для инъецирования иэ кончиков диаметров 0,2-0,5 мкм яа :а.x «Ееаюфф
721107 л л де .З П „ („ сом основания ; — flR
Ъ л 3 половина объема пара с .радиусом Rg.
p =—
Яа х преобразований.
4х гх
К= — = —, т.к. р = —,. н р,н порядка 15-5 атм, которое может быть установлено с меньшей точностью.
Способ осуществляется следующйм образом. Для определения конусности устанавливают кран в положейие атмосфера, опускают кончик микропипетки в инъецируемый раствор (фиг. 1), за счет капиллярных сил инъецируемый раствор заполняет внутреннюю полость коническо го острия и частично цилиндрическую часть кончика микропипетки (положеиие
1 мениска, фиг. 4) (наблюдение за заполнением можно производить под микроскопом). Положение крана 14 при этом — атмосфера, . Затем переводят кран 14 в положение . отсчет и, постепенно повышая давление воздуха, переводят мениск инъецируемой жидкости в положение I (фиг. 4) (мениск должен расположиться в коническом острие, вблизи его основания). Давление Р,, соответствующее этому положению, фиксируют,,Затем замеряют оптическими средствами, например, с помощью окуляр-микрометра YOB-15 высоту Н от мениска до острия.
По давлению Р1 и высоте Н определяют конусность где R — внутренний радиус кончика микропипетки в сечении по положению 1; а(— коэффициент поверхностного натяжения на границе инъецируемый parTвор — собственный пар.
Так как инъецируемый раствор и внутреннее содержимое большинства биообъектов представляют собой сильно разбавленные водные растворы, вследствие чего их граничное поверхностное н ат яжени е практически равно
:нулю, а вода практически полностью смачивает чистую поверхность стекла (т.е. угол смачивания равен нулю), то капиллярное давление, которое необходимо преодолеть для перемеще" ,ния мениска, зависит от радиуса капилляра и эта зависимость выражаетл R я формулой p- — в условиях полного смачивания.
В связи с малым углом конуса, внося незначительную погрешность в измерение: радиуса R, принимаем Вл = R где й„ = отрезку OA (фиг. 4), йричем отрезок ОА перпендикулярен образующей конуса (в действительности AÄ =
2 с . — а не R, но вследствие малого р У
1 угла конуса Можно для упрощения расчетов принять, что
После того, как определена конусность К = —, задаются объемом дозы сд. е
V, и находят давление p„, ему соответствующее по формуле
Эта формула выводится следующим образом (фиг. 4) .
Объем дозы V = — "Пр H - ° 4; ДЯ
3 х х 2. Х х — объем конуса с р адиуь
Ин уравнения нахеднн а х 2 <-2 3 К йользуясь зависимостью определяет Р и после получаем к
2 (V К
2,f-2,f К
Если повысить давление внутри микропипетки с Рл до Р, отсчитав его по образцовому манометру с ценой де ления О, 025 атм (кран в положении отсчет ), кончик микропипетки опу. щен либо в инъецируемый раствор, либо в питательную среду, в котором находится биообъект, что удобнее, избыток инъецируемого раствора выда4$Q ется из микропипетки через выходное отверстие в кончике, а в кончике микропипетки останется заданная доза Ч1 инъецируемого раствора. Теперь, что- бы выдавить заданную дозу, например в цитоплаэму, микрообъекта, следует ввести кончик микропипетки в цитоплазму, кран поставить в положение инъекция и подать давление
Рз(— где y — радиус выходного
2w
50 отверстия микропипетки. Для выдавливания всей дозы требуется. давление
Бх P и — „, однако это давление подавать не следует в связи с возможносI .
55 тью попадания вохдуха в цитоплазму вслед за дозой инъецируемого раствора. Целесообразно внести незначительную псгрешность в величину дозы, уменьшив Рз на величину порядка 5Ъ, но искхпсчить воэмсжность попадания воздуха в цитоплазму.
Радиус выходного кончика микропипетки может быть определен одним из известных методов.
После проведения инъекции кончик м кропипетки выводят из мркрообъек721107
Ш,72
1,70
1,70
1,02
li02
1.02
15 0,18
14,9 0,18
14,9 0,18
1,04
1,06
10
1,70
1,05
2,73 — -0,05м
0,25 мкм.
Р = — -0,05. з,, дин ю - - а 7 аам.
0,25а- =-:. та, выключают цо воздуха, а кран ставят в положение атмссфера (фиг; 1) .
Пример . Проводилась инъекция дозы V< = 10 мкм в воду из мика ропипетки с внутренним диаметром кончика 0,5 мкм (r = 0,25 мкм). Предварительно теоретически было доказано и практически проверено, что
Для установки дозы на манометре устанавливалось давление 1,70 кг/см, при этом кснчиК микропипетки был опущен в воду, это давление подавалось в широкую часть микропипетки, в результате чего устанавливалась доза 10 мкм -. При подаче дав3 ления порядка б атм вся вода из кончика выходила в воду в сосуде, за исключением небольшого количества, оставшегося в самом кончике острия для r = О, 25 мкм.
Устройство обеспечивает установку задаНной величины давлений Р, Р„ по образцовому манометру при;кране, установленном в положение отсчет, и следовательно, точное определение конусности и точную установку заданной дозы V, соответствующей давлению Р„; а при положении крана инъекция обеспечивает подачу высокого давления для прохождения мениска инъецируемого раствора к самому кончику острия и
его остановку.
После определения конусности К вышеописанным методом определяют давление воздуха Р, соответствующее объему микродозы Ч, вводят кончик микропипетки в цитоплазму и, установив это давление на манометре 19 (положение крана - отсчет ), выинъекция в воду и в цитоплазму гигантского нейрсна L1mnaea stagnaI1s прсисходит при одинаковых давлениях. Результаты опыта представлены в табл. 1 (в формулы подставлены значения коэффициента поверхностного натяжения А. для воды = 73 дин/см.
Высота Н отсчитывалась по окуляр-микрометру,ОВ-15, установленному на микроскоп БИОЛАМ 70 Р6.
Т а б л и ц а 1 давливают микродозу V> в цитоплазму, после чего вынимают кончик микропипетки из объекта, а кран ставят в
2$ положение атмосфера
Р, 467 5d. где р — давление, соответствующее остановке мениска при определении конусности. (Эта формула выводится из формулы объема усеченного конуса) .
