Способ определения общего содержания холестерина в биологическом материале

 

О Il И С А Н И Е 1„,-7З7З59

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союэ Советских

Социалистических

Республик

Ф

< (6l ) Дополнительное к авт. свил-ву (22) За""лено 16.05.78 (2() 2617133/30-15 (5I )М. Кд, б 01N 33/16 с присоединением заявки,%

Гвсударстввнный комитет (23) Нриоригет

Опубликовано 30,05.80. Ьк«ллетень № 20

sa делам изобретений н аткрмтнй (53 ) Уд К5 77.1 61. .2.011 (088. 8) Дата опубликования описания 02 06 80

Л. B. Орлов " "-" (, f «« :., 1 ." :1«, Всесоюзный научно-исследовательский институ иологир, биохимии и,питания сельскохозяйственных жтйбтных -, (72) Автор изобретения (7! ) Заявитель (54) СГ(ОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОБЩЕГО СОДЕР> :АНИЯ

ХОЛЕСТЕРИНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к биологической химии, в частности к физико-химическим способам определения общего содержания холестерина, применяемым в научно-исследовательских и зооветеринар5 ных лабораториях.

Известен способ определения общего содержания холестерина в биологическом материале, в котором для предотвращения влияния липидных компонентов на инте«сивность окрашивания и точность анализов об.цие липиды, предварительно выделенные с помощью органических растворителей, омыляют, и цветную реакцию проводят с неомыляемой фракцией 0,05%-ным раствором хлорного железа в уксусной кислоте.

Недостатком указанного способа яв- эо ляется его трудоемкость, так как он включает предварительную экстракцию общих липидов органическими раствори» телями.

Наиболее близким к предлагаемому способу является способ, при котором проводят омыление липидов в биологическом материале с помощью спиртового раствора щелочи, экстрагирование холестерина петролейным эфиром, промыва;ние экстракта дистиллированной водой, упаривание растворителя и цветную реакцию с хлорным железом и уксусной кислотой: .,. .Известйййь способ обеспбч11вает о«ре»" делен ие обще ro содержания холес терйна в таком биоло, ическом материале, как

Сйво«р«ото-кро«ви, плазма, «о он не приМоННМ для ткйней животных.

Недостатком его является также сравнительно низкая чувствительность цветной реакции roëåcòåðèíà с хлорным железом.

""-"!Лель изобретения — повышение чувствительности способа при определении холестерина в тканях животных.

"««UBJIb достигается тем, что омыление лиййдов проводят 25-30;о-«ым спиртоГ вым раствором КОН в ге к«1ие 12-1,з ч н ов

0

8 92 ° . 8 99

6 161 +11 155

7 208 + 8

100

150

200

6 242 + 12

250

400

7 386 — 14

3 7373 ш1я осуществления одновременно и гидролиза биологического материала, экстрагируют неомыляемую фракцию липидов цетролейным эфиром, промывают экстракт дистиллированной водой, упаривают раст5 воритель и добавляют сульфофосфованилиновый реагент для осуществления цветной реакции.

Пример, Среднкио пробу органов и тканей животных в количестве 10

0,2,— 0,3 г помещают в пробирку с

2 мл 25-30%ного раствора КОН в воде с метанолом (1:1) и проводят одновременный гидролиз биологического материала в течение 12-15 ч при 55 С в 15 термостате. Объем содержимого пробирки доводят дистиллированной водой до

5 мл, прибавляют 4 мл петролейного эфира, энергично встряхивают и после разделения фаз верхний слой отсасывают 20 в другую пробирку. Затем дважды проводят экстрагирование 3 мл петролейного эфира. Объединенные экстракты сначала промывают 6 мл 1н раствора КОН, а потом 2 раза 6 мл дистиллированной во- 25 ды и 0,1 объема экстракта упаривают в вакуумном шкафу при 40-45 С или на водяной бане при температуре 55о

60 С. K сухому остатку добавляют 1 мл химически чистой концентрированной 30 серной кислоты, выдерживают 10 мин в кипящей водяной бане или 20 мин при 105оC в термостате. В охлажден59 ф ную пробирку приливают 2 мл фосфованилинового реактива, состоящего из 1 части 0,6%-ного водного раствора ванилина и 4 частей ортофосфорной кислоты, энергично встряхивают, выдерживают в течение 45 мин при комнатной температуре для развития стабильного малинового окрашивания в течение 24 ч и колориметрируют при длине волны 560 мм в кювете с толщиной слоя 5 мм против слепой пробы с 1 мл концентрированной серной кислоты и 2 мл фосфованилинового реактива.

Положительный эффект предлагаемого способа по сравнению с известными состоит в том, что достигается стабильное цветное окрашивание в течение 24 ч, высокая чувствительность и, кроме того, повышается производительность на 1020%. Наряду с этим, исключив предварительное экстрагирование обших липидов, на 1 анализ экономится 25 мл смеси диатилового эфира и этанола в объемном соотношении 3:1 или 50 мл смеси хло« роформа и метанола в объемном соотношении 2:1. Кроме этого все анализы можно проводить в мерных пробирках без использования мерных колб и делительных воронок.

Сравнение предлагаемого способа с известным способом определения общего содержания хопестерина приведено в таблице.

Ъ

737359

-; at ъ-.» м;гав:ю -аа»-. Ф

Составитель Ж. Еременко

Редактор Л. Павлова Техред H. Бабурка Корректор,С„ Шекмар

Заказ 2591/4 Тираж 1019 Подписное

БИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Мое«ва, Ж 5, Раушская" наб., д. 4/5

Фил и ал П П Л Патент" у г. «Лкгород, чл, Проектная > 4

Формула изобретения

Способ определения общего содержания колестерина в биологическом материале, включающий омыление липидов спиртовым раствором щелочи, экстрагирование неомыляемой фракции липидов петролейным эфиром, промывание экстракта дистиллированной водой, упаривание растворителя и добавление реактива для осуществления цветной реакции, 6 о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности способа при определении холестерина в тканях животных, омыление липидов проводят

25-307 -ным спиртовым раствором КОН в течение 12-15 ч для осуществления одновременно и гидролиза биопогического материала, причем в качестве реактива для цветной реакции используют сульфо1Î фосфованилиновый реагент.