Способ измерения содержания мертвых клеток в дрожжевой суспензии

 

СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МЕРТВЫХ КЛЕТОК В ДРОЖЖЕВОЙ .СУСПЕНЗИИ методом световой микроскопии , отличающийся тем, что, с целью повьппения точности и скорости измерения, в отдельности для каждой из клеток измеряют, распределение амплитуд оптической плотности, с последующим определением частоты встречаемости каждой из дих, и по ползченным частотам рассчитьшают дисперсию и асимметрию, при этом мертвые клетки идентифицируют по пороговым значениям диспер . сии и аси№ етрии, рассчитанным ; г 1(л заранее для каждой культуры микроорганизмов .

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИК

09) (И) y g С 12 N 1/16 опиолниа изоврят НИя к двтоРСному СВИДЕТЮЬСТВУ. ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ (21) 2638408/30-13 (22) 28,06.78 (46) 07. 11.84. ьюл. № 41 (7 2) К.M. Богданов, К.А. Яновский, В.И. Шихер, В.В. Сеничкин, И.И. Карташев, Л.М. Токмань, Г.В.. Ильин, Е.А. Казинцов, Б.П. Пантелеев, Ю.Г. Козлов и А.И. Заикина (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ (53) 576.8.093(088.8) (56) 1. Руководство по микробиологическому практикуму, МГУ, 1972,2. Отчет ¹ В 554865, ВНИИсинтезбелок, 1976 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ИЗМЕРЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ МЕРТВЫХ КЛЕТОК В ДРОЖЖЕВОЙ

СУСПЕНЗИИ методом световой микроско1 пии, отличающийся тем, что, с целью повышения точности и скорости измерения; в отдельности для каждой из клеток измеряют. распределение амплитуд оптической плотности с последующим определением частоты встречаемости каждой из них, и по полученным частотам рас- считывают дисперсию и асимметрию, при зтом мертвые клетки идентифицируют ао пороговым значениям диспер- сии и асимметрии, рассчитанным заранее для каждой культуры микроорганизмов.

73.989 жителььны е

Изобретение относится к микробиологйческой промьппленности.

При выращивании дрожжей.в промММенных условиях в раздел микробйоло/гического/ контроля входит определение процентного содержания мертвых клеток в дрожжевой суспензии через"каждые два часа йэ" каждого ферментера.

Иэв/е/стны способь1 опр/едепени/я нро- 10 ц/ентного/ содержаййй мертвых клеток путем,прокрашивания их метиленовой синью или синькой Лефллера и под счета отношений числа прокрашенных, клеток к общему числу просмотренных клеток (1) ."

Недостаток известных способов заключается в неустойчивости красителя., т.е. и менении его свойств.

Наиболее близким к изобретению 20

По технической сущности и достигаемому эффекту является способ измерения: со/дар/ж/ан/ия мер/твых клеток методом световой микроскопии (2j . Способ

; заключается в том, что в пробу дрож- g5 жевой суспензии, взятой из ферментера, добавляется метиленовая сИнь.

Препарат готовят таким образом, что« бы получилось монсслойное располо женйе дрожжевых клеток. Препарат айализируется в микроскопе в проходящем свете.

Процентное содержание мертвых клеток определяется визуально Путем подсчета числа мертвых клеток из рассмотренных ста дрожжевых клеток. Мертвые клетки имеют темносинюю окраску, а живые — слабо-се рую или се/р6-синюю окраску- в- зависимости от ослабленности клеток.

Недостаток такого способа заключает- 40 . ся в большой трудоемкости (время анализа 40-60 мин), малой статйс° тике (увеличение числа клеток больше 300 значительно увеличивает тру доемкость измерений) субъективнос- 4 тй в оценке степени прокрашенности и нестабильности красителя в зависимьсти от времени .его храйения.

Это приводит к тому, что коэффициент вариации, т.е. отношение средне "квадратического значения д к средне" му значению содержания мертвых клеток определенных из/веСтньм с/пособом но 20-30 полям зрения одной пробы составляет. 0,4-0,5, т.е. под- 55 счет недостаточно точен (груб).

Целью изобретениФ является уве= лйчейие-"точности и скорости измере-:

1 ния содержания мертвых клеток в дрожжевой суспензий.

Поставленная цель достигается . тем, что в отдельности для каждой из клеток измеряют распределение амплитуд оптической плотности с последующим определением частоты встречаемости каждой из них и по полученным частотам рассчитывают дисперсию и асимметрию. При этом мертвые клетки идентифицируют по пороговым значениям дисперсии и асимметрии, рассчитанным заранее для каждой культуры микроорганизмов.

Сущность способа заключается в том, что пробу дрожжевой суспензии, взятой из ферментера, помещают на предметное стекло и приготавливают препарат с монослойным расположением клеток. Препарат закрепляют на столике сканирующего микроскопа и путем аноптральной микроскопии с помощью фотоумножителя определяют амплитуды оптической плотности для каждой из клеток, По полученным амплитудам рассчитывают частоту встречаемости каждой из них и определяют функцию распределения амплитуд оптической плотности для каждой клетки. По функции распределения вычисляют дисперсию и асимметрию известt ным способом. По значениям диспер- . сии и асимметрии всех просмотрен ных клеток определяют процентное содержание мертвых клеток, которые характеризуются определенными значениями дисперсии и асимметрии. Эти значения рассчитывают следующим образом. В поле зрения сканирующего светового микроскопа помещают отдельно только мертвые, а потом живые клетки и вычисляют для них -значення асимметрии и дисперсии по частоте встречаемости амплитуд их оптической плотности. Таким путем доказано, что мертвые клетки имеют меньшие значения дисперсии по сравнению с живыми и отрицательные значения асимметрии в отличие от живых, для которых асимметрии полПример. Из ферментера берут пробу дрожжевой суспензин с ку тьтурой СапдЫа дидIIiermondy и приготавливают препарат, который закрепляют на столике сканирующего микроскопа, соединенного с вычислительной машиной, затем осуществляют поРедактор Л. Утехина Техред Л. Микеш

Корректор С. Шекмар

Подписное

Заказ 8907/1 Тираж 521

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Фили л ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 7 строчное сканирование пробы с шагом

0,5 мкм и зондом 1 мкм. Фотоумножитель фиксирует в каждой точке отсчета амплитуду оптической плотности изображения дрожжевой суспензии в аноптральном контрасте. Вычислитель-, ная машина рассчитывает асимметрию и дисперсию распределений амплитуд оптической плотности для каждой из

l клеток. Было принято, что если асаММеТраа отрицательна.и .значение дисперсии меньше 12, то клетка считается мертвой. После анализа 100 клеток определяют отношение числа мертвых клеток к живым. Из 100 клеток.5 идентифицированы как мертвые.

Ошибка измерения содержания мертвых клеток составляет 5-10Х с коэффициентом вариации 0,1-0,2, тогда как в прототипе он был равен 0,40,5.

В предлагаемом способе точность измерения повышается по сравнению

39898 4 с прототипом за счет исключения красителя в методике приготовления

:препарата, объективного и на большей

t ,статистике машинного определения, принадлежности дрожжевой клетки к мертвой или живой. Скорость измерения повышается за счет его полной автоматизации. Электромеханическое сканирование пробы занимает 5-10 мин.

Расчеты на 3ВМ "Днепр-1" занимают еще 5-10 мин, а на ЭВМ М-60001-2 мин.

Благодаря этому становится возможным использовать измеряемый параметр для экспресс-контроля состояния дрожжевой культуры и как один из параметров для управления процессом биосинтеза в АСУ TII, оснащенных современными УВМ, что позволит повысить производительность и качество биомассы.