Способ культивирования вирусов

 

О П И С"А Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советсиик

Социалистических

Реслублнк

< 1>764391

К АВТОРСКОМУ СВИ ЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 310179 (21) 2723822/28-13 (51) М. Kn.

С 12 N 7/00 с присоединением заявки ¹

Государствеииый комитет

СССР ио делам изобретеиий и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 2 30 7 81. Бюллетень № 2 7

Дата опубликования описания 2 30781 (53) УДК 576.8.093. . 1 (088. 8) Л.Л. Миронова, Н. E. Гольдрин, В. П. Грачев и Т.М.Орлова (72) Авторы изобретения

Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

АМН СССР (7! ) Заявитель (54.) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ВИРУСОВ

Изобретение относится к области медицины, а именно вирусологии, и может найти применение для культивирования вакпинных штаммов вируса.

Известен способ культивирования вирусов путем размножения на линии диплоидных клеток (1).

Однако этот способ является малодоступным, кроме того, линии клеток высоко чувствительны к определенным питательным средам и сывороткам.

Цель изобретения — упрощение способа.

Это достигается тем, что вирусы размножают на линии диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека M-7.

Полученная линия диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека М-7 имеет следующие биологические, генетические и морфологические характе— ристики.

Культура состоит из фибробластоподобных клеток. Морфология клеток остается стабильной в течение фазы активного роста. ,Клетки легко снимаются со стекла раствором трипсина, при субкультировании быстро прикрепляются к стеклу и на 3-4 сутки образуют монослой.

Клетки хорсшо растут на среде Игла и среде МЕМ с 10% сыворотки крупного рогатого скота, — коэффициент развивки составляет 1:2, 1: 3.

Клетки имеют ограниченное время жизни вне организма, до 66 пассажа, на протяжении фазы активного роста не теряют своих генетических свойств.

При кариологическом анализе установлено, что модальный класс на уровне десятого, двадцатого, тридцатого и сорокового пассажей составляли клетки с двойным набором хромосом (2п-46).

Число диплоидных клеток на протяжении фазы активного роста колебалось от

15 97% на ранних пассажах до 85,6% на

-поздних, гипоплоидных — 1,6-2,0, гиперплоидных — 1,0-12, 8. ОбследоваНо 1200 метафаз. Установлено, что кариотип диплоидных клеток не отли20 чается от кариотипа, характерного для мужского пола. При сравнении хромосомных наборов на разных уровнях пассажей различий не обнаружено, что свидетельствует об отсутствии контаминации линии другиМи клетками.

Различий также не выявлено в рисунке дифференцированности хромосом по длине при окраске по Гимза, что также указывает на генетическую стабильность

30 культуры.

764391

Клетки линии М-7 не контаминиронаны бактериями, грибами и микоплазмами.

Посторонние вирусы не выявлены ни в культурной жидкости, ни н клетках.

Тесты на онкогенность также были отрицательными.

По мере размножения клетки замора кивали на различных "уровнях пассажей для хранения в жидком азоте, таким образом создан йх банк. При восстановлении клетки сохраняли жизнеспособность. о на 70-80 Ъ .

Клетки линии чувствительны к различным вирусам группы ЕСНО, Коксаки, полиомиелита и .клещевого энцефалита.

В частности, характер цитопатических изменений под действием вируса полиомиелита штаммон Сэбина по морфологии и срокам развития не отличается от наблюдаемого в первичной культуре клеток почек обезьян, используемых для изготовления вакцины против поли - 20 омиелита и клещевого энцефалита. В частности, характер цитопатических изменений под действием вируса полиомиелита штаммон Сэбина по морфологии и срокам развития не отличается от у5 наблюдаемого в первичной культуре клеток почек обезьян, используемых для изготовления вакцины против полиоми ели та.

Вирус клещевого энцефалита в клетках линии М-7 размножается со стабильно высокими показателями титров, чего не наблюдается при заражении первич - ных культур клеток куриного эмбриона, используемых для изготовления вакцины против клещеного энцефалита.

Приводятся примеры культивирования вирусов на линии диплоидных кле. 1ок кожи и мышц эмбриона человека М-7.

Пример 1, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэби- 40 на 1 типа, В матрасную колбу с диплоидными клетками кожи и мышц эмбриона человека M-7 на уровне I пассажа вводят

0,25 Ъ-ный раствор трипаина, подог-. ретый до 37ОС, Через 10 с раствор удаляют, а сосуд с клетками помещают в термостат при температуре 37 С на

2 мин. После этого в него вносят небольшое количество питательной среды и энергичным встряхиванием э аканчивают процесс отделення клеток о т б текла. Затем в клеточную взвесь добавляют среду роста — среду МЕМ с 104 сыворотки крупного рогатого скота, и разливают на дне матрасные к б . 55

Эти культуры 19 пассажа инкубируют при 37 С н течение 4 суток до момента формирования плотного слоя.

При заражении вирусом среду из хультуральных сосудов сливают, клет- Щ ки трижды проыывают растнором Эрла и вводят нируссодержащую жидкость из расчета 3 БОЕ на клетку. Затем добавляют поддерживающую среду, н качестве кбторой используют среду МЕМ.

ИнФицированные культуры инкубируют при 34 С. Сбор нируса. производят на

4 день после заражения и определяют его титр по методу образования бляшек, Титр ранен 7, 7 t g БОЕ/мп, Параллельно аналогичным способом инфицируют первичную культуру клеток почек обезьян, и вирус н ней размно1кается до титра 7,5 Ед БОЕ/мп.

Пример 2, Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина И типа, I

Клетки линии М-7 на уровне 19 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1. При этом титр вируса как при размножении его в данной культуре, так и в первичной культуре клеток почек обезьян составляет 7,5 f g БОЕ/мл.

Пример 3. Способ культивирования вируса полиомиелита, штамм Сэбина 1I! типа.

Клетки линии М-7 на уровне 19 пассажа получают и заражают вирусом по способу, описанному в примере 1.

При этом титр вируса как при размножении его в данной культуре, так и н первичной культуре клеток почек обезьян составляет 7,5 Eg БОЕ/мл.

Пример 4 . Способ культивирования вируса ECHO 1.

Клетки линии М-7 получают и готовят к заражению по способу, описанному н примере 1. При заражении вносят вируссодержащую жидкость из расчета

1 БОЕ на клетку. Для адсорбции нируса культуры выдерживают при 37 Г в течение 1,5 ч, после чего добавляют поддерживающую среду. Культуры инкубируют при 370 С, сбор вируса проводят через 5 дней после заражения, затем определяют его титр, который равен

7, 3 39 БОЕ/мл.

Параллельно аналогичным способом заражают первичную культуру клеток почек обезьян и вирус н ней размножается до титра 6,5 Eg БОЕ/мл.

Пример 5. Способ культивирования вируса ECHO 12.

Клетки линии М-7 получают и готовят к заражению по описанному в примере 4 способу . При заражении вносят вируссодержащую жидкость из расчета

2 БОЕ на клетку. Вирус собирают на

5 день после заражения и его титр равен 7,6 fg БОЕ/мл. При параллельном заражении аналогичным способом пернич ных культур клеток почек обезьян титр вируса достигает лишь 5,7 fg БОЕ/мл.

Пример 6. Способ культивирования вируса Коксаки В 5.

Клетки линии М-7 получают и заражают по способу, укаэанному в примере

5.

Титр вируса при размножении в данной культуре составляет 7,4 9 EOE/мп. а н параллельно инфицированной анологичным способом культуре клеток почек обезьян - 6,45 д БОЕ/мл, 76 4391

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Т. Колодцева Техред М. Рейвес КорректорМ.Пожо

Э акаэ 5 769/40 Тираж 528 Подписное

ВИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Фили ал ППП "Патент ", г. Ужгород, ул, Проектная, 4

Пример 7. Способ культивирования вируса клещевого энцефалита, штамм Софьин.

Линию клеток на уровне XX пассажа готовят аналогичным способом, описанным в примере 1. Культуру трижды отмывают раствором Эрла и вводят вируссодержащую жидкость из расчета

0,0021Э о /клетку. Адсорбцию вируса проводят при 32ОС в течение 1,5 ч при постоянном покачивании, В качестве поддерживающей среды используют среду 199 на растворе Эрла с 5% аминопептида — 2, и по 0,1 % куриного эмбрионального экстракта, человеческого альбумина и гидролиэата лактальбумина. Культуры инкубируют при 37ОС в .течение 48 ч и производят сбор вируса.

Степень его размножения определяют в опытах биологического титрова-. ния путем интрацеребрального заражения мышей. При этом титр составляет

8,02 39 L D 5о.

Параллельно аналогичным способом инфицируют первичные культуры клеток 25 куриного эмбриона и титр вируса в этом случае равен 7 Xq L25o.

Предлагаемый способ позволяет испольэовать для культивирования вирусов нового субстрата, полученного из легко — gg доступного абортивного материала (кфжи и мышц эмбриона человека), легко культивируемого, обладающего диплоидным набором хромосом, свободного от посторонних агентов, чувствительного к различным вирусам, лишенного онкогенной активности.

Линия диплоидных клеток кожи и юашц эмбриона М-7 человека отличается легкостью получения и субкультивиров ани я при и спол ьзов анин ростовой среды Игла или среды МЕМ с добавлением 10% качественной сыворотки крупного рогатого скота, не требует особых видов питательных сред и дефицитной эмбриональной сыворотки телят, обладает устойчивыми морфологическими и генетическими особенностями. Линия чувствительна ко многим вирусам, что открывает перспективы широкого применения ее в вакцинном производстве.

Ее клетки хорошо сохраняются в жидком азоте и можно создаватЬ их запас.

- Использование линии в производстве вакцин позволит снизить импорт обезьян и готовить большие партии вакцин на заранее отконтролировайном клеточном субстрате. Применение его в качестве лабораторной модели вместо первичных культур клеток и животных позволит получать более достоверные данные с меньшими экономическими затратами.

Способ культивирования вирусов путем размножения на линии диплоидных клеток, от л и чающий с я тем, что, с целью упрощения способа, вирусы размножают на линии диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека

М-7.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Hayfiick and Noorhead, The

Serial Cultivation of 0iploid Cell

Strains. "Experimental Cellulior

Research", 25, 3, р. 585-621.