Способ хроматографического разделения смесей метиловых эфиров метилгликопиранозидов

 

О Il И С А Н И Е („,765278

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советсиик

Социалистических

Рвслублии (6! ) Дополнительное к авт. саид-ву— (22) Заявлено 10.04.78 (2!) 2602019/23-04 с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

Опубликовано 23.09.80. Бюллетень ¹ 35

Дата опубликования описания 25.09.80 (5()M. Кл.

С 07 Н 1/06

С 07 Н 3/02//

С 08 В 37/00

Государствеииыб комитет (53) УД К547.455. . 627. 07 (088.8) во делам изобретений а открытий

А. А. Акрем, Г. В. Аввакумов, О. В. Свиридов и О. А. Стрельченок (72) Авторы изобретения

Институт биоорганической химии АН Белорусской CCP (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ CNECEA

МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ МЕТИЛГЛИКОПИРАНОЗИЙОВ

Настояшее изобретение относится к усовершенствованному способу кроматографического разделения смесей метиловых эфиров метил гликопиранозидов, которые необходимы при структурных исследованиях полисахаридов и олигосахаридных

5 цепей, входящих в состав смешанных биополимеров в частности гликопоотеинов.

Известен способ разделения смесей метиловых эфиров (ди-, три-, и тетраме

10 тилового эфиров) метил гликопиранозидов > например .Ф -метил- ц -маннозидов путем препаративной газожидкостной хроматографии 1(с модификацией свободных гидроксильных групп.

Нецостатками этого метода являются необходимость дополнительной модификации свободных гидроксильных групп в триметиловык эфирах со снятием защитных группировок после разделения; низкая летучесть монометиловых эфиров и необходимость ик перевода в о-ацетильные производные с последуюшим снятием ацетильнык зашит после выделения индивицуальных компонентов.

1Яелью изобретения является упрощение процесса.

Это достигается использованием для разделения смесей метиловык эфиров ме тилгликопиранозидов колоночной жидкостно-адсорбционной хроматографии на силикагеле с градиентным элюированием системой метанол-хлороформ, что позволяет избежать дополнительных стадий модифи« кации свободнык гидроксильных групп триметиловых эфиров и ацетилирования монометиловык эфиров метилгликопиранозидов и последующего снятия защитных групг с индивидуальных соединений.

На фиг. 1-7 представлены графики, иллюстрирующие предлагаемый способ.

Способ хроматографического разделения смесей метиловых эфиров метилгликопиранозидов заключаетс я в колоночной жидкостно адсорбционной хроматографии на силикагеле с градиентным элюированием со скоростью 1,8-2,0 o6.% в чаг

Иля контроля за ходом разделения и определения момента окончания опыта (выхода последнего вещества) каждую

50 пятую фракцию анализируют методом

ГЖХ; после завершения колоночной хроматографии проводят анализ всех осталь ных фракций и строят кривую деления (фиг.1). Как вилно из фиг. 1, на этой

55 стадии достигалось выделение чистого тетраметилового эфира и четкое групповое разделение три-, ди- и монометиЙовых эфиров.

3 7 системой метанол-хлороформ при увеличе нии концентрации метанола от 0 до

4-6 об.% для тетраметиловых эфиров„ от 5-6 до 7 8 об.% для суммарной фрак ции триметиловых эфиров, от 7-8 до

10-12 об.7 для суммарной фракции диметиловых эфиров, от 10-12 до 1315 об,Я для суммарной фракции монометиловых эфиров с последующим разделением суммарных фракций на индивидуальные компоненты путем 2-3-кратной рехроматографии на силикагеле при увеличении концентрации метанола от 0 до

15 об.7 со скоростью 0,8-1,5 об.7.

Пример 1 . Групповое разделение смеси метиловых эфиров метил-Ы-Ъ

-маннопиранозида.

Силикагель Л с размером частиц

40 - 100 мкм (ЛаХема, ЧССР) суспендируют в хлороформе и дегазируют. Полученной суспензией заполняют стеклянную колонку с внутренним диаметром

3 см и высотой рабочей части 60 см, промывают силикагель несколькими колоночными объемами хлороформа.

Примерно 3 г синтетической смеси содержавшей тетра-, три-, ди-, и монометиловые эфиры .метилманнопиранозида растворяют в минимальном объеме смеси хлороформа с метанолом (9:1, по объему ) и наносят на силикагель. Элюцию осуществляют самотеком со скоростью протока через колонку около

150 мл/час. Пропускают через колонку

500 мл хлороформа и элюат отбрасывают. Затем элюцию продолжают при повышении концентрации метанола, в элюенте со скоростью 1,8-2 об.% в час. (Градиент концентрации метанола задавали широко распространенным способом с помощью двух сообщающихся сосудов) .

Отбрасывают еще 300 мл элюата, а затем начинают собирать его с помощью коллектора фракций. Время сбора фракции - 2 мин, что соответствует объему около 5 мл.

6527 8 4

Выход (в расчете на 1 г смеси) тетраметилового эфира составил 190 мг, суммарной фракции триметиловых эфиров - 270 мг, суммарной фракции диметиловых. эфиров - 320 мг и суммарной фракции монометиловых эфиров — 200 мг (итого 980 мг). Таким образом, потери веществ на колонке пренебрежимо малы.

l0 После удаления растворителя длительным высушиванием на ротационном испарителе полученный тетраметиловый эфир представляет собой бесцветную густую сиропообразную жидкость и Ilo цанным

15 аналитической ГЖХ в различных усло- виях примесей не содержит. Суммарная фракция монометиловых эфиров содержит примерно равные количества всех четы.рех изомеров и не содержит каких либо

20 посторонних примесей.

Пример 2. Выделение индивидуальных триметиловых эфиров метил-at- ) -маннопиранозида.

Примерно 0,5 r смеси триметиловых

25 эфиров растворяют в смеси хлороформа с метанолом (9:1, по объему) и наносят на колонку (диаметр 1,5 см, высота 90 см) с силикагелем. Тип силикагеля, размер частиц, процедуры напол50 нения и промывки колонки аналогичны описанным в примере 1. Скорость протока через колонку составляет

90 мл/час.

После нанесения образца пропускают з5 через колонку 250 мл хлороформа и элюат отбрасывают. Затем создают повышение концентрации метанола в элюенте от 0 до 7,5% со скоростью 0,91,1 об, в час. Отбрасывают еще 400 мл

40 элюата, затем начинают сбор фракций.

Время сбора фракции - 2 мин, что соответствует объему 3 мл. Анализ фракций проводят как в примере 1. Кривая деления приведена на фиг. 2, жирными линия45 ми под осью абсцисс показано объединение фракций для рехроматографии. фракции 4-10 и 26-30 содержат чистые компоненты. Фракции 11 - 13, 14 - 16;

1 7 - 22 и 23 - 25 подвергают рехроматографии в условиях, описанных выше (фиг. 3 и 4).

Полученные гомогенные триметиловые эфиры после удаления растворителя представляют собой бесцветные густые сиропообразные жидкости и по данным ГЖХ в различных условиях не содержат примесей. Идентификацию полученных веществ гроводят методом масс-спектрометрии.

5 76

В табл. 1 приведены выходы триметиловых эфиров метил-<К9 -маннопира- нозида (в расчете на 1 г их смеси).

Табл ица 1

2,4,6

3,4,6

2,3,4

2,3,6

130

5278 6 тетра, три- и диметиловых эфиров метил-Ф-Ъ-галактопиранозида.

Разделение проводят в условиях, описанных в примере 1. В расчете на 1 г синтетической смеси получено 140 мг тетраметилового эфира (чистый по данным аналитической ГЖХ), 480 мг смеси триметиловык эфиров и 300 мг смеси диметиловых эфиров (без посторонник

10 примесей) - итого 920 мг.

Пример 5. Выделение индивидуальных TpHMGTBIIoBblK эфиров метил- о(- Ъ -галактопиранозида.

Условия разделения аналогичны onut 5 санным в приме ре 2.

Таблица 2

3,4

100

2,4

390

2,6

170

3,6

240

4,6

20

945

Итого

Пример 4. Первичное фракциоHHp0BBHNB (групповое разделение) смеси

Пример 3. Выделение индивидуальных диметиловых эфиров метил-О(-Ъ-MaHHotINpaHOGHg&.

Условия разделения диметиловых эфиров аналогичны описанным в примере 2, за исключением того, что элюцию веществ осуществляют при увеличении концентрации метанола от 5 до 10% со скоростью 0,8-0,9 об.% в час. Ход разделения иллюстрируется фиг. 5-7 (на фиг. 5- первичное разделение смеси диметиловых эфиров метил -К-Ъ -маннопиранозида; на фиг. 6 - рехроматография диметиловых эфиров метил-о(-ц -маннопиранозида; а - фракции 9-1 1, б - фракции 1 8-20, в - фракции 35-38; на фиг. 7 - рехраматография диметиловых эфиров метил0t. -Ъ -маннопиранозида: a - фракции

21-27, б - повторная рехроматография фракции 23-26).

Отнесение пиков и выходы диметиловых эфиров метил-o(-9 -маннопиранозида (в расчете на 1 r их смеси) приведены в табл. 2.

Данные о природе полученных триметиловых эфиров метил-Ы - 0 -галактопиранозида (в расчете на 1 г их смеси) и их выходах приведены в табл. 3. Все соединения были гомогенны по данным

ГЖХ в различных условиях.

Таблица 3

30 236

2,3,4

2,4,6

3,4,6

110

100

185

925

Итого:

40 Формула изобретения

Способ хроматографического разделения смесей метиловых эфиров метилгликопиранозидов, отличающийся

45 тем, что, с целью упрощения процесса, используют метод колоночной жидкостноадсорбционной хроматографии HB силикагеле с градиентным элюированием систе» мой метанол-хлороформ со скоростью

1,8-2,0 об.% в час при увеличении концентрации метанола от 0 go 4-6 об.% для тетраметиловых эфиров, от 5-6 до

7-8 об % для суммарной фракции триметиловык эфиров, от 7-8 до 10-12 об.% для суммарной фракции диметиловых эфиров, от 10-12 до 13-15 об. % цля суммарной фракции монометиловых эфиров с последующим разделением суммарных фракций на индивидуальные компоненты. 6 N йамвра данцига

4Ма/

7 765 путем 2 3 кратной рехроматографии на силикагвле при увеличении концентрации метанола от О до 15 об.% co скоростью

0,8-1,5 об.% в час.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе!

5 ь

1f а t2 ч 3

6

5, Ъ

278 8 1.3.Ущ гмв . и др . Аналитическая и препаративная газо-жидкостная хрома. тография ди-. три- и тетраметилового эфира â(-метил-Ъ -маннозида. Lot СЪЕШЬ

)ъс1 ©gr mph 75, 29 37, 1973 (прото тип).

765278

2

82 Р

Номера уранций

Фиг. 7

Составитель Л. Никулина

Редактор В. Галышкина Техред M. Рейвес Корректор С. Шекмар л

Заказ 6445/25 Тираж 495 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва Ж-35, Раушская наб., д. 4/5.