Способ получения @ -лизина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ЛИЗИНА путем глубинного культивирования его продуцентов в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источ}1ики углерода, азота, необходимые минеральные соли, ажнокислоть и витамины при периодическом добавлении свежей питательной среды с по ( следующим выделением лизина, о т.личающийся тем, что, с целью увеличения выхода лизина, в процессе культивирования, начиная с 16-18 ч, в клетках продуцента определяют активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты или соответствующие им концентрации L-лизина и при достижении критического для данной культуры уровня активности декарбоксилазы диаминопи елиновой кислоты, равной 12-9.10 моль лизина/с-мг белка , вводят свежую питательную среду до снижения уровня активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты до 8-6, лизина/с-мг белка, после чего продолжают, процесс культи (Л вирования и, начиная с 30-36 ч с начала процесса культивирования, при достижении активности 5.10 -. 4.10 моль лизина/с-мг белка вводят источник углерода и витамины до снижения активности до 2,5. 10 2.10 моль-лизина/с-мг белка.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

4(5 ) С 12 P 13/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСИОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA (21) 2696186/28-13 (22) 1? .12.78 (46) 2302.85. Бюл. Р 7 (72) A.Ê.Саксе, M.П. Руклиша, С.Э.Селга, У.Э.Виестур, /

М.П.Лейте, С.Ю.,Клявиня, Ю.Э.Швинка и М.Е.Бекер (71) Институт микробиологии им. Августа Кирхснп тейна АН Латв ССР (53) 668.394(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР по заявке У 2429702/13, кл. С 12 D 13/06, !976

2. Авторское свидетельство СССР

Ф 498940, кл. А ?3 К 1/00, 1973. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Е-ЛИЗИНА путем глубинного культивирования его продуцентов в аэробных условиях на питательной среде, содержащей исто инки углерода, азота, необходимые минеральные соли, аминокислоты и витамины при периодическом добавлении свежей питательной среды с по„„SU„„7782 A следующим выделением лизина, о т.л ич а ю шийся тем, что, с целью увеличения выхода лизина, в процессе культивирования, начиная с 16-18 ч, в клетках продуцент а определяют, активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты или соответствующие им концентрации L-лизина и при достижении критического для данной культуры уровня активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты, л равной 12 — 9. 10 моль лизина/с мг белка, вводят свежую питательную среду до снижения уровня активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты до 8-6.10 моль лизина/с мг белка, после чего продолжают. процесс культивирования и, начиная с 30-36 ч с начала процесса культивирования, -11 при достижении активности 5.10

4.10 моль лизина/с мг белка вводят источник углерода и витамины до снижения активности до 2,5. 10"

-11

2.10 моль лизина/с мг белка.

778256

Однако при многократном периодическом добавлении мелассы в среде растет концентрация треонина, который. содержит меласса. Треонин совместно с лизичом вызывают мультивалентное ингибирование активности -аспартаткиназы, что в свою очередь резко уменьшает лизиноинтезирующую активность культуры и снижает выход . целевого продукта. Мультивалентное ингибирование активности g>-аспартки назы наступает при определенных пределах активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты.

Эффект особенно выражен .при переработке концентрированных питательI

Изобретение относится к микробио""oãè÷åñêîé промышленности, а имен" но к способу получения одной из незаменииых аминокислот L-лизина.

В процессе ферментации в результате изменения состава питательной среды уменьшается темп роста клеток, а также изменяется их морфология.

Биомасса стареет, в ней идут процессы автолиза и физиолого-биохимичес- 1О кая активйость клеток падает. Это приводит к снижению выхода L-лизина, Известен способ получения 1.-лизина, согласно которому для повышения выхода целевого продукта в процессе 15 ферментации, начиная с 16 до 30 ч определяют концентрацию молочной кислоты или активность лактатдегидрогеназы, либо определяют активность изоцитратдегидрогеназы в клетках 20 продуцента и с учетом этого ведут весь процесс культивирования f11.

Известен также способ получейия !

L-лизина путем глубинного культивирования его продуцентов в аэробных 2S условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, необходимые минеральные соли, амино1 кислоты и витамины при периодическом

I добавлении свежей питательной среды с последующим выделением лизина (2) .

Выращивание продуцента проводят при периодическом добавлении стерильного раствора одного из компонентов питательной среды мелассы, обеспечивающей поддержание редуцирующих веществ в культуральной жидкости в пределах 2,5-3%. Этот способ позволяет повысить выхоц Е-лизина до 30 г/л, а экономический коэффици- 0 ент выхода L-лизина до 40,2Х. ных сред; концентрация редуцирующих веществ 12-157.

Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта.

Цель достигается тем, что в процессе культивирования, начиная с 16-18 ч, в клетках продуцента определяют активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты или соответствующие им концентрации L-лизина и при достижении критического для данной культуры уровня активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты, равной 12-9.1 0 моль лизина/с мг белка вводят свежую питательную среду до снижения уровня активности декарбоксилазы диаминопимелиновой кислоты до 8-6.10 моль лизина /с тамг белка, после чего продолжа-. ют процесс культивирования и, начиная с 30 — 36 ч с начала процесса культивирования при дост1рении активности 5.10 " — 4.10 моль лизина/с мг белка, вводят источник углерода и витамины до снижения активности до 2,5.10 " . — 2.10 1 моль ли зина/с мг белка.

В процессе культивирования определяют концентрацию L-лизина и по ней судят об активности декарбоксилазы диаминополимелиновой кислоты.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве продуцента L-лизина используют микроорганизмы рода Brevibacterium или Micrococcus.

После выращивания культуры в посевном ферментаторе дальнейшее куль- тивирование проводят в производственных ферментаторах на углеводной питательной среде, например мелас- сной. При ферментации во время роста продуцента pC: поддерживают на уровне 20-257. от насыщения.. В состав питательной среды входят, кроме источников углерода,. дефицитные для продуцента аминокислоты и витамины, а также источники азота и фосфора.

Начиная с 16-18 ч, определяют активность декарбоксилазы диаминополимелиновой кислоты (ДАП-ДК), уровень аэрации снижают до 10-122 насыщения, сохраняя интенсивность перемешивания системы. При достижении ур6вня активности ДАП-ДК преимущественно 1 2-10 — 10 " моль лизина/

/с мг белка в ферментатор добавляют свежую стерильную питательную среду

50

3 7782 до достижения критической для даннои

-и культуры активности ДАП-ДК 8 10

6.1;) моль лизина/с мг белка. Питательную среду вводят непрерывно нли отдельными порциями с интервалами 5 в 1-2 ч. При достижении уровня ДАПДК 8 10 — 6.10 моль лизина/

/сек мг белка ввод питательйай среды прекращают. Ва время культивирования температуру поддерживают на уровне 10

31 1 С, рН среды 7,4-7,8. При достижении уровня активности ДАП-ДК

5.10 " — 4.10 " моль лизина/сек тамг белка, что происходит на 30-36-м часу культивирования, начинают вводить 15 источники углерода и витамины да снижения активности ДАП-ДК до, -11 -и

2,5 10 — 2,10 моль лизина/с.йг бел-: . ка. В качестве источников углерода используют глюкозу, сахарозу, фрук- 20 тазу. После последней подпитки при активности ДАЛ-ДК равной 2.10 моль

-Ц лизина/с ° мг белка процесс ведут еще несколько часов да концентрации редуцирующих веществ равной 1-1,2%. 25

После окончания культивирования из культуральнай жидкости выделяют

L ëèçèH одним из известных методов, или получают кормовой концентрат лизина.

Активность ДАП-ДК определяют манаметрически па количеству образующегося углекислого газа при использовании в качестве субстрата диаминаполимелиновой кислоты.

Активность ДАП-ДК также определяют по концентрации лизина в культуральной жидкости.

На чертеже представлена зависимость для культуры Brevibacterium

flavum 221Л активности ДАП-ДК от концентрации 1.-лизина, где па аси абсцисс отложена концентрация L-лизина в г/л, а по оси ординат — активмоль 10 лизина 45 ность ДАП-ДК в с мг белка

Такая калибровочная кривая строится для каждой культуры.

Ниже приведены примеры осуществления способа. !

Пример 1. В качестве продуцента используют культуру Brevibacterium flavum 22 LD. Исходную культуру размножают вначале на агаровых косяках, затем в колбах на качалке, 55 а затем в посевном ферментаторе емкостью 400 л на мелассной питательной среде. Культивирование прадол56 4 жают 14 ч прн температуре 3!+1 С, аэрации 60 мг О /л мин, рН среды поддерживают в пределах 7,4-7,8. Посевной материал передавливают в ферментер емкостью 3000 л со средой следующего состава

Меласса 470 кг (при содержании сахара 46 мас. %)

Кукурузный экстракт 50 кг (МН ) 804 37 кг (МН )г НРОа 0,75 кг

КН Р04 0,75 кг

Подсолнечное масло 3 л

Вода До 1300 л

Начальная концентрация РВ=14%, содержание L-лизина 2,8 г/л после добавления посевного материала.

Во время роста продуцента р04 поддерживают на уровне 20-25% насыщения, на 8-10- м часу рН увеличивают.;-до 7,47,8 и поддерживают на этом уровне.

На 18-м часу культивирования актив4/ ность ДАП-ДК составляет 9.10 моль лизина/с Ml белка, содержание L-лизина 18 г/л, концентрация PB 8,8%.

В ферментатор непрерывно вводят в течение 2 ч стерильную свежую среду. со скоростью 1% РВ в 2 ч до снижения активности ДАП-ДК до 6,8"10 моль лизина/с мг белка, содержание лизина.

19 г/л. В дальнейшем активность ДАПДК определяют каждые 2-3 ч.

После подпитки уровень аэрации уменьшают.до 10% насыщения.. На

37-м часу культивирования активность ДАП-ДК составляет 5.10 Я моль лизина/с мг белка, в среду вводят источники углерода и витамины.

В качестве источника углерода вводят сахарозу двумя порциями с периодом в 2 ч до снижения активности ДАП-ДК до 3,4.10 моль лизина/с мг белка, концентрация лизина на 48-м часу после подпитки составляет 48 г/л.

Затем продолжают культивирование, а на 52-м часу вновь вводят сахарозу и витамины: биотин и тиамин до снижения активности ДАП-ДК вЂ” 2,2.

10 " моль лизина/с мг белка, концентрация лизина при этом составляет 58 г/л. После чего продолжают культивирование до концентрации редуцирующих веществ 1,4%. На 63-м часу ферментации культуральная жидкость содержит 65 г/л лизина, биомассы продуцента 24 г/л. Культуральную жидкость обрабатывают одним из известных способов, например, с по778256

И вжав 46/3 Tùèù 525 По ущснк е

Фьтиал ш Петект, г.Ужгород, ул.нроектиая, 4 мощью ионообменных смол для выделения Ь"лизина или получают кормовой концентрат лизина.

Выхэд лизина из использованных

РВ составляет 43,3%. 5

Пример 2. В качестве продуцента используют культуру Brevibacterium flavum RC-I15. Посевной материал готовят по примеру 1. Затем ферментацию продолжают в пилотном 10 ферментаторе на среде следующего сосФ тава

Иеласса 1,65 кг (при содержании сахаров 46%)

Кукурузный экстракт 15 (при содержании сухих веществ 50Х) 0,52 кг (ИН,), 804 150 г

КНР0,-» 2,5 r

К,ЙР04

25 г 20

1 г

СаС05 25 г

Подсолнечное масло 30 г

Вода До 4,6 л

Количество посевного материала 8%.25

Во время роста продуцента рО поддерживайт на уровне 20-25% насьпцения, Интенсивность неремешивания 600 об/

/мин. На 8-10-м часу ферментации рН увеличиваются до величины 7,6-7,8 30 и поддерживают на этом уровне.

На 14-м часу культивирования при активности ДАП-ДК 12.10 фермента-! цйи рН увеличиваются до величины

7,6-7,5 и поддерживают на этом уров- 35 не. /

На 14-м часу культивирования при активности ДАП вЂ” ДК 12.10 моль лизина/с мг белка в среду вводят с периодом в два часа свежую питательную 40 среду из расчета использования РВ-1% в 2 ч. При этом между каждой подпиткой измеряют активность ДАП вЂ” ДК. Подпитку ведут до снижения активности

ДАП-ДК до 7,5.10 моль лизина/с мг 45 белка. Эта активность достигнута на

22-,м часу культивирования, концентрация лизина при этом составляет

26 г/л. На 24-м часу уровень аэрации снижают до 12% насьпцения. На 30 — м 50 часу культивирования активность

ДАП-ДК составляет 5.10 " моль лизина/с мг белка. Концентрация лизина

35 г/л, в среду непрерывйо вводят сахарозу и смесь витаминов В, и био- 55 тина. При содержании лизина 60 г/л и активности ДАП-ДК 2,1.10 моль лизина/с мг белка подпитку прекращают.

К 52-му часу ферментации содержание лизина 80,5 г/л, биомассы продуцента 24 г/л, остаточные РВ-1,4%.

Выход лизина от использования РВ составляет 43,5%.

Пример 3. В качестве продуцента L — ëèçèíà используют культуру

Micrococcus glutamicus Т.-3.

Культивирование ведут на среде, аналогичной примеру 1. В качестве источника стим;ляторов роста используют гидролизат белково-витаминного концентрата.

На 22-м часу ферментации активность ДАП-ДК составляет 9,2.10 1 моль

/лизина/с1мг белка, концентрация лизина 17 г/л. В среду непрерывно вводят свежую питательную среду до

-н активности ДАП-ДК 6,6.10 моль лизина/с мг белка. Такая активность достигается к 32-му часу культивирования, концентрация лизина в культу— ральной жидкости 28 г/л. Затем умень(паю-: уровень аэрации с начального

15-20Х-кого насьпцения до 10 — 12% насьпцения. На 48-м часу культивирования активность ДАП-ДК составляет

-u

4.10 моль лизина/с мг белка, в среду порциями вводят глюкозу и витамины до снижения ДАП-ДК до уровня

2,5.10 " моль лизина/с.мг белка.

Затем продолжают ферментацию до концентрации РВ 1,4Х. На 65-м часу ферментации культуральная жидкость содержит L- ëèçèíà 48,5 г/л, биомассы продуцента — 23 г/л. Выход 1.-лизина от РВ составляет 43,1%.

В указанных примерах реализации рН среды поддерживают изменением аэрации в зависимости от активности лактатдегидрогеназы и изоцитратдегид-рогейазы. В конце процесса рН регулируют добавлением аммиачной воды.

Таким образом, за счет устранейия эффекта мультивалентного ингибирования активности Р -аспартаткиназы увеличен выход целевого продукта до 80,5 г/л и соответственно увеличен выход лизина от введенных редуцирующих веществ до 43,5%.