Средство для очистки сыворотки при фотометрических измерениях

 

и:,: т .. -., .. —. :. Р. "". надь

-1лч т нз 14 (-, ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сеюэ Севетскик

Сециалистнческив

Республик пц791267

К ПАТЕНТУ (61) Дополмительмый к патенту (22) Залелемо 13р977 (21) 2532397/28-1 (23) Приоритет (32) 01 ° 06.77 (31) Р 2724757.0 (33) ФРГ (51)М. Кл.з

С 01 N 33/52

Государстаенный комитет

СССР по делам изобретений н открытий (53) УДК 543.8:

:66.0661(088.8) Опубликовамо23.12,80. Бюллетень М 47

Дата опубликования описамия 2312.80

Иностранцы

Ханс-Георг Батц,. Бригитте Дрегер, Лугуст Вильгельм Валефельд, Гюнтер Вайманн и Вольфганг Грубер (ФРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма иБерингер Маннхайм ГмбХ" (ФРГ) (71) Заявитель (54) СРЕДСТВО ДЛЯ ОЧИСТКИ СЫВОРОТКИ

ПРИ ФОТОИЕТРИЧЕСКИХ ИЗМЕРЕНИЯХ

Изобретение относится к биохимии и может Быть использовано в медицине для очистки препаратов.

Известно средство для очистки сы- 5 воротки при фотометрических измерениях, содержащее эмульгатор для примесей и растворитель $1).

Однако при применении известного средства достигается слабое осветле- l0 ние сыворотки.

Цель изобретения — усиление активности средства.

Эта цель достигается тем, что 15 средство содержит в качестве эмульгатора один или несколько моно- или дкэфиров полиэтиленгликоля (от 1 до

8 этиленоксидкых единиц) и лауркновой кислоты, а в качестве раствори- 20 теля содержит вещество, выбранное кз группы: алканол (с 1-3 атомами углерода), гликоль (с 1-7 атомамк углерода), полигликоль (c 1-8 единицами окиси этилена), эфир оккск

25 полиэтилена алканола (с 8-1б атомами С в молекуле, содержащей 8-14 единиц окиси полиэтилена), а компоненты взяты в следующем соотношении, вес ° %: . 30

Моно- или диэфир полиэтиленгликоля и лауриновой кислоты 10-40, Растворитель Остальное

В качестве кислотной части в средстве используют лауриновую кислоту, но можно применять и пеларгоновую кислоту, каприновую, ундециловую, тридециловую или миристиновую.

Особенно предпочтительные результаты достигаются, если доля сложных эфиров составляет 10-40 вес.Ъ н 3-4 единицы окиси этилена в молекуле.

Компонент сложного эфира в средстве не является чисто растворимым и поэтому приводит к возникновению дальнейших помутнений при его добавлении в сыворотку. Однако в зависимости от состава сыворотки при добавлении средства исчезает помутнение в течение нескольких минут и получают совершенно прозрачную сыворотку.

Но в другом случае необходимо дополнительно добавить солютизирующий агент.

В качестве солютизирующих агентов используют низкие алканолы, в частности этанол с 1-3 атомами С, гликоли до 6 атомов С, полигликолк с

791267

8 единицами окиси этилена или поверхностно активные вещества, которые сами не могут осветлять помутнения в сыворотке, как солютизирующие вещества.

В качестве поверхностно-активных веществ используют эфир полизтиленгликоля, особенно полиэтиленгликолевые эфиры алканолов с содержанием

8-16 атомов С в,молекуле, которые содержат 8-14 единиц окиси этилена. для средства очень важно недопущение загрязнений. Средство не должно содержать следы спирта и кислоты.

Поэтому имеющиеся в продаже сложные эфиры полиэтиленгликоля не пригодны без дополнительной очистки. При очистке также отделяют содержащиеся в них полигликоли. Очистку осуществляют с помощью экстракции путем встряхивания водных растворов с галлогенированными углеводородами, например трихлорэтиленом.

Получают средство следующим образом.

Полиэтиленовые гликоли с 3-8 единицами окиси полиэтилена в молекуле подвергают реакции с борной кислотой в молярном соотношении 3:1, полученный продукт нагревают с жирной кислотой от 9-14 атомов С, затем подвергают гндролизу, добавляя воду, экстрагируют органическим смешивающимся с водой растворителем, отделяют органическую фазу, высушивают, .обрабатывают окисью алюминия и затем отделяют окись алюминия и растворитель.

Экстракцию растворителя проводят из насыщенного солью водного раствора.

В качестве экстрагирующего средства используют галлогенированные растворители, например, хлороформ.

Реакцию с борной кислотой проводят при температуре 80-100 С в течение 7 часов в вакууме.

Полученные с помощью сложного эфира борной кислоты, сложные эфиры жирной кислоты — полнэтиленгликоля пригодны для средства, так как они обладают высокой чистотой, однако можно применять и коммерческие сложные эфиры для получения средства. В этом случае добавляют низкомолекулярные сложные эфиры, т.е. эфиры с 3-4 единицами окиси этилена в молекуле, в количестве 5-20 вес.Ъ.

Средство может также содержать буферный раствор и другие инертные вещества к составным частям сыворотки и используемые в системах анализа.

Средство добавляют в таких количествах, чтобы достигнуть необходимого эффекта осветления. Эти количества составляют 0,1-5Ъ в зависимости от состава подлежащей осветлению сыворотки и других добавленных к сыворотке реагентов. Однако можно ис5 !

О !

40 пользовать и меньшее количество средства.

Если требуются большие количества средства, то добавляют низхий алканол с 1-3 атомами С или гликоль с

1-7 атомами С или полигликоль с 8 единицами окиси этилена в молекуле в качестве солютиэирующего агента.

При этом принимают во внимание чувствительность составных частей в растворе к спиртам. Если имеются чувствительные к спиртам энэимы, то применяют в качестве солютиэирующего агента поверхностно активное вещество.

Если, например, определяют глюкозу по способу глюкозооксидаэы, то добавляют 0,4Ъ сложного эфира и

0,1-0,4В солютизирующего агента, если с помощью каталазы и альдегиддегидрогеназы производят определение на мутном образце сыворотки мочевой кислоты, то добавляют средство, соответствующего 3 вес.% сложного эфира.

Если в качестве солютизирующего агента применяют поверхностно-активное вещество, то era добавляют в минимальном количестве.

Средство позволяет устранить даже значительное помутнение в сыворотке °

Во многих случаях добавление средства позволяет осуществлять оптические измерения на сыворотках с неудаленным белком. Поэтому средство пригодно как для субстрата, так и для определений знзимов.

Пример 1. Получения средства.2 моля гликоля полиэтилена. с 3-8 единицами окиси этилена. нагревают с

О,бб моля борной кислоты в течение

2 час до 900С в вакууме, получаемом с помощью водоструйного насоса. Состав затем выцерживают при этой температуре еще б часов.

После охлаждения добавляют 0,2 моля лауриновой кислоты и 2 г р-толуол-сульфоновой кислоты. Затем в течение 2 часов нагревают до 100ОС и еще в течение 2 час выдерживают при этой температуре. Затем для гидролиза добавляют такой же объем воды и в течение 1 часа производят перемешивание. Затем раствор насыщают поваренной солью и три раза экстрагируют встряхиванием с уксусным эфиром.

Соединенные фазы эфира сушат над сульфатом натрия и затем концентрируют примерно до 100 мл, затем раствор встряхивают с 50 r основной окиси алюминия.

Тонкослойной хроматограммой проверяют отсутствие жирных кислот.Если жирными кислоты еще остались, то повторяют обработку окисью алюминия.

Затем окись алюминия отфильтровывают и удаляют растворитель с помощью вакуума, создаваемого масляным насосом.

791267

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор А, Судын Техред М,Голинка Корректор А. Гриценко

Заказ 9123/74 Тираж 1019 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб;, д. 4/5 ул. Проектная,4

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, Выход 60-903 в зависимости от длины цепочки гликоля полиэтилена.

При смешивании 15 вес. ч эфира лауриновой кислоты гликолей полиэтилена с 3,4 или 5 единицами окиси этилена с 20 вес частями эфира с

6-7 единицами окиси этилена и около

5% эфира с 8 единицами окиси этилена получают предлагаемое средство.

Пример 2. Хомерческую окись полиэтилено-эфира лауриновой кислоты с 4В эфира триэтиленгликоля,10% эфира тетраэтиленгликоля, 15Ъ эфира пентаэтиленгликоля и 60% эфира гексагента- и .октаэтиленгликоля экстрагируют из водного раствора с трихлорэтиленом и затем просушивают.

К полученному продукту добавляют

8% полученного согласно примеру 1 эфира триэтиленгликоля.

Пример 3. Определение мочевой киалоты. 0,1 мл значительно мут- 20 ного образца сыворотки смешивают с

1 мл раствора следующего состава .К4Р О 45 мм(рН-8,5), никотинамид-аденин-динуклеотид (НАД) каталаза, альдегидрогеиаза, 5 об.Ъ этанола, 3 об.Ъ средства согласно примеру 2.

После 5-минутного стояния при комнатной температуре образец осветляют °

После добавления сыворотки экстинкуля без добавления предлагаемого средства составляет аЕ „м = 2,239.

При добавлении средства она составляет dE> << = 0,777.

Величина отсутствия показателя реагента b EggyIIn = 0,570. 35

Определение мочевиной кислоты в осветленном образце проводят при добавлении уриказы и измерения экстинкции d Е при .334 нм.

Пример 4. Определение саха- 40 ра в крови без удаления белка.

0,02 мл значительно мутного образца сыворотки смешивают с 2 мл раствора следующего состава: 0,2 м трифосфатного .буферного вещества, рН вЂ” 80, 45 фенол р-аминоантипирин, пероксидаза (ПОД), глюкозооксидаза (ГОД),0,4 об.Ъ эфира полиоксиэтилендодецила с 8 единицами окиси этилена, 0,4 об.Ъ средства согласно примеру 2.

Осветление и проявление красок происходит одновременно.

Пример 5. Определение глютамат-оксалацетат-транс-аминазы (ГОТ). 0,5 мл помутневшего образца

55 сыворотки смешивают с 3,1 мл раствора следующего состава: фосфатное буферное вещество рН 7,4, аспартант, НАДГ, лактатдегидрогеназа (ЛДГ), малактдегидрогеназа (МДГ), 2,85 об.% средства согласно примеру 2.

Исходная экстинкция сыворотки составляет 1,870. После 30 минут стояния образец осветлнвается. Экстинция — 0,820.

Особенно хороших результатов достигают при добавлении средства,состоящего из 60% полиэтиленгликоль °

300 — лаурата и 40% полиэтиленгликоль — 200 — лаурата, полученного согласно примеру 1.

Предлагаемое средство позволяет полностью очистить сыворотку от помутнений, что необходимо при фотометрических измерениях.

При добавлении средства можно отказаться от использования градуировочного измерительного ряда и проводить измерение лишь по отсутствию показателей реагентов.

Средство для очистки сыворотки при фотометрических измерениях, содержащее эмульгатор для примесей и растворитель, о т л и ч а ю щ е е с я тем, что, с целью усиления активности средства, оно содержит в качестве эмульгатора один или несколько моно- или диэфиров полиэтиленгликоля (от 1 до 8 этиленоксидных единиц) н лауриновой кислоты,а в качестве растворителя содержит вещество, выбранное из группы: алканол (с 1-3 атомами углерода), гликоль (с 1-7 атомами углерода); полигликоль (с 1-8 единицами окиси этилена), эфир окиси полиэтилена алканола (с 8-16 атомами С в молекуле, содержащей 8-14 единиц окиси полиэтилена), а компоненты взяты в следующем соотношении (вес.Ъ): монокли — диэфир полиэтиленгликоля н лауриновой кислоты 10-40, растворителя - остальное.

Источники информации, принятые во внимание прн экспертизе

1. Заявка ФРГ М 2327896, 7 августа 1975, подана фирмой Techп1сеп Instruments Corp. Tarrytowr. й.J (V. 5с.А).