Способ иммобилизации транскортина

 

»i 810815

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

I -. л1 (61) Дополнительное к авт. свпд-ву— (22) Заявлено 26.09.78 (21) 2668123;28-13 с присоединением заявки ¹ —— (23) Приоритет— (43) Опубликовано 07.03.81. Бюллетень ¹" 9 (45) Дата опубликования описания 07.03.81 (51) Ч К. з

С 12 N 11/00

Государственный комитет по делам изобретений и открытий (53) УДК 615.361.018. .51/.55 (088.8) 1

А. Стрельченок и

l !

АН Белорусской

А. А. Ахрем, О. В. Свиридов, О

Л. И. Сурвило (72) Авторы изобретения

Институт биоорганической химии

ССР (71) Заявитель (54) СПОСОБ ИММОБИЛИЗАЦИИ

ТРАНСКОРТИ НА

Изобретение относится к способам иммобилизации белков, а именно к способу получения стер оидсвязывающего белка транскортина, иммобилизованного на нерастворимой матрице.

l3

Иммобилизованный транскортин может применяться в клинической практике для целей конкурентного белковосвязывающего анализа стероидных гормонов в физиологических жидкостях, а также в научно- 10 исследовательских целях для изучения механизма связывания стероидов специфическим белком.

Известен способ иммобилизации транскортина (1), который заключается в сле- 15 дующем. Транскортин, очищенный хроматографией последовательно на ДЕЛЕ-цел;полозе и гидроксиапатите, растворяют в бикарбонатном буфере и смешивают с а«тивированной бромцианом агарозой. Полу- 2о ченную суспензию перемешивают гри 4 С в течение 24 ч. Нековалентно связанный с агарозой транскортин удаляют путем последовательных промывок транскортинагарозы 0,5 М бикарбонатным буфером, 25 цитратным буфером рН 1,1, фосфатным буфером рН 6,0.

Очистка хроматографией на ДЕЛЕ-целлюлозе и гидроксиапатите не позволяет получить гомогенный транскортин. Приме- З0

2 си других белков, иммобилизованных вместе с транскортином, снижают удельную стероидсвязывающую активность транскортина и обуславливают высокий уровень неспецифического связывания стероидов. Последнее исключает применение иммобилизованного по известному способу транскортина для анализа некоторых стероидных гормонов, например, прогестерона и

17-окси-прогестерона. Кроме того, условия иммобилизации — применение буфера с рН 1,1 приводят к существенной инактивации белка.

В известном способе нс предусмотрены операции по стабилизации этого лабильного белка, а использован общепринятый унифицированный метод иммобилизации белков.

Цель изобретения — получение стаоильного гомогенного препарата и повышение его связующей емкости.

Для достижения этой цели согласно предлагаемому способу, включающему растворение транскортина, добавление в раствор активированной нерастворимой агарозы. инкубацию полученной смеси и промывку образовавшегося иммобилизированного транскортина, в раствор транскортина перед добавлением агарозы вводят

810815

3 стероид, агарозу и транскортин берут в соотношении 1:0,002 — 1:0,03, инкубируюч смесь в течение 3 — 24 ч при 4 — 23 С, а иммобилизированный транскортин промывают фосфатным буфером при рН 6 — 8, содержащим стероид в концентрации, равной сго содержанию при иммобилизации транскортина.

В качестве стероида используют кортизол в мольном соотношении с транскортином 1:0,5 †-1:3 или кортиокостерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5—

1:2, или прогестерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5 — 1:1.

Способ заключается в следующем.

Гомогенный транскортин, выделенный из плазмы ретроплацентарной крови человека аффинной «ромотографией, растворяют в фосфатном буфере рН 8,0. Для предотвращения инактивации транскортпна в процессе иммобилизации его связывают со стероидом, имсюгцим высокое сродство к этому белку. Полученный комплекс смешивают с активированной бромциаиом агарозой. Процесс иммобилизации проводят при непрерывном перемешивании ь теченис 3 — 24 ч при 4- — 23 С. Нековалентно связанный с агарозой трапскортин удаляют путем последовательных промывок транскортин-агарозы фосфатным буфером, содержащим 0,5 М ХаС1, трис-НСI буфером рН 8,0 (для блокирования остаточных активных групп агарозы) и фосфатным буфером рН 8,0. Все промывающие буфе. ры содержат растворенный стероид для предотвращения диссоциации обратимого комплекса транскортин — - стероид, иммобилизованного на агарозе. В результате получают стабильную трехкомпонентную систему агароза-транскортин-стероид. Ковалентная связь между первыми двумя компонентами устойчива к физическим воз действиям, а стероид легко переходит в раствор при повышении температуры до

35 — 40 С. При необходимости удаляют определенную часть стероида, варьируя тем самым в широких пределах (от 10 до 90 /о) стерондосвязывающую емкость пммобилизованного транскортина.

Пример 1. Иммобилизация транскортина при охлаждении.

10 мг (2,10- моль) транскортина растворяют в 5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,5 М NaCI и охлажденного до 4 — 6 C. В полученный раствор добавляют 144 мкг (4 10: моль) кортизола в 0,2 мл абсолютного этанола.

1 г агарозы, активированной бромцианом, промывают на пористом стеклянном фильт ре последовательно 200 мл 0,001 М НС1.

50 мл воды, 10 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 8,0, содержащего 0,5 М

NaCI. Все растворы имеют температуру

4 — 6 С. К гелю промытой активированной агарозы приливают полученный, как опи5

20 5

Зо

4 сано выше, раствор комплекса транскортин-стероид. Суспензию перемешивают на магнитной мешалке при 4 — 6 С в течение

24 ч. Гель переносят в стеклянную колонку, снабженную пористым стеклянным фильтром, и промывают последовательно

40 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, содержащего 0,5 М NaCI, 40 мл 0,01 М трисНСI буфера рН 8,0 и 20 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера р1-1 8,0. Все промывающие буферы имеют температуру 4 — б С содержат кортизол в концентрации

29 мкг/мл. Химический анализ и определе нис стероидсвязывающсй способности (см. пример 6) показывают, что в препарате иммобилизованного транскортина 1 г агарозы ковалентно связан с 9,2 мг белка и стероидсвязывающая способность составляет 85О/, от стероидсвязывающсй способности того же колнчсства нативного (неиммобилизованного) транскортина.

Пример 2. Иммобилизация транскортина при комнатной температуре.

Используют всс тс реагенты и реактивы, что и в примере 1, в тех же количествах. Проделывают все те операции, что и в примере I, в той же последовательности, но при температуре 20 — 23 С. Время персмешивания суспензии 3 ч. Провсденный анализ показывает, что 1 г агарозы ковалентно связан с 9,0 мг транскортина, а стероидсвязывающая способность сохраняется на 81о/о

Пример 3. Влияние исходного соотношения транскортина и агарозы на количсство иммобилизованного белка и его стероидсвязывающую способность.

В целях подбора оптимального соотношсния количеств белка и активированной агарозы к шести пробам активированной агарозы (no 0,1 г) добавляют различные количества транскортина, растворенного в

0,5 мл 0,1 М натрийфосфатного буфера, содержащего 0,5 М NaCI. Каждая проба раствора транскортина, как и в примере 1, содержит двойное количество кортизола в мольном отношении к количеству белка.

Процесс для каждой пробы проводят, как описано в примере 1, но объемы промывающих буферов уменьшают в 10 раз. Результаты анализа полученных препаратов транскортин-ага розы представлены в табл, 1.

Как видно из данных табл. 1, наиболее эффективно иммобилизация транскортина проходит при таком соотношении количеств активированной агарозы и белка, когда на 0,1 г матрицы взято 1,0 мг транскортина. При указанном соотношении реагентов сохраняется иммобилизованным транскортином высокая стероидсвязывающая активность.

Пример 4. Стабилизирующее влияние различных количеств стероида на активность иммобилизованного транскортина.

810815

Таблица 1

Стероидсвязывающая способность, %

Белок, кова лентно связанный с

0,1 г агарозы, мм

Белок, добавленный к 0,1г .актнвнрованной агарозы, кг

Эффективность иммобилизации, %

79

83

81

68

95 ,94

92

0,2

0,5

)1,0

1,5

2,0

3,0

0,19

0,47

0,92

1,20

1,40

1,50

Таблица 3

Стероидсвязывающая способность, %

Количество белка в

0,1 r агарозы, мг

1» фер р11

Глицин-NaOH

X а-ф осф атный

Ха-ацстатный

Глицнн-НС1

О1 и. НС1

4о

14

0,88

0,92

0,94

0,90

0,93

10,0

8,0

4,0

24

1,0

Таблица 2

Количество кортизола, добавленного и 1.0 мг (20 нмоль) транскортина, мкг; (нмоль|

Стероидсвязываюи;ая способность, %

39

66

78

0; (О)

3,6; (10>

7,2; (201

14,4; (40)

21,6; (60) Стеропдсвязывающая способность иммобилнзованного траискортина приведена в процентах от связывающей способности нативного белка (то ясс в соотнстств)чощик графах табз. 2 и 3).

Для подбора оптимального мольного соотношения транскортина и стабилизирующего стероида к пяти пробам по 1,0 мг белка, растворенного в 0,5 мд 0,1 М натрийфосфатного буфера рН 8,0 и содержаи1его 0,5 М NBCI, добавляют различныс количества стероида. Процссс для каждой пробы проводят. как описано в примере 1, используя 0,1 г активированной агарозы и уменьшая объемы промывающих буферов в 10 раз. 1(аждый промывающий буфер содержит стероид в той жс концентрации, какая была создана в данной пробе транс кортина. Результаты анализа полученных препаратов транскортин-агарозы представлены в табл. 2.

Из данных табл. 2 следует, чго наибольшее стабилизирующее влияние оказывает стероид в мольном отношении к белку) 2:1 () 14,4 мкг кортизола на

1,0 мг транскортина). Другие стероиды, имеющие средство к транскортину одного порядка с кортизолом — кортикостерон и прогестерон — также стабилизируют транскортин в процессе его иммобилизации. Используют мольные соотношения кортикостерон:транскортин 2:1 и прогестерон:транскортин 1:1. Стабилизирующее влия" èå оооих стероидов равно влиянию эквивалентного количества кортизола.

Пример 5. Влияние рН промывающего буфера на стероидсвязыва|ощую способ35

G ность иммобилизованного транскортина и на количество белка, связанного активированной агарозой.

От значения рН промывающсго буфера зависят, во-первых, полное удаление нековалснтно связанного с матрицей транскортина и, во-вторых, сохранение при этом высокой стероидсвязывающсй способности белка. С этой цель1о проводят иммобилизацию пяти проб по 1 мг транскортина на пяти пробах по 0,1 г активированной агарозы в соответствии с примером 1. Г1о окончании реакции данную пробу промывают буфером с исследуемым значением рН. Затем промывку ведут, как в примере 1, уменьшая объемы в 10 раз. Результаты анализа полученных препаратов транскортин-агарозы приведены в табл. 3.

Из данных табл. 3 видно, что промывка транскортин-агарозы буферами с низким значением рН (4,0) существенно инактивирует белок. Химический анализ полученных препаратов показывает, что все пробы содержат одинаковое количество белка (в пределах ошибки эксперимента).

Следовательно, нст необходимости понижать рН для увеличения десорбпрующей силы промывающего буфера (как рекомендует унифицированная методика иммобплицации белков).

Пример 6. Химический анализ пммоби лизации белков).

Суспензию транскортин-агарозы в воде лиофильно высушивают и определяют сухой вес препарата. Пробу 0,02 r сухого препарата подвергают полному кислотному гидролизу в б н. HCI при 110 С в течение 48 ч. В контрольном опыте 0,02 r неактивированной агарозы и известное количество транскортина гидролизуют в идентичных условиях. Состав гидролизата OIIределяют на аминокислотном анализаторе в стандартных условиях. Количество иммобилизованного транскортина определяют сопоставлением количеств глутаминовой кислоты, аспарагпновой кислоты, глицина и аланина, высвободившихся при гидролизе в опытной и контрольной пробах.

Определение стероидсвязывающсй способности иммобилизованного транскортина

810815

Формула изобретения

Составитель М. Андреева

Редактор Л. Волкова Техред А. Камышникова Корректоры: В. Нам и О. Силуянова

1!одписное

Изд. Ха 234 Тираж 530

ВН11ИПИ Государственного комитета СССР ио делам изобретений и открытий

113035, Москва, ji(-35, Раушская наб., д. 4/5

Зак,аз 2146

Загорская типография Упрполпграфпздата Мособлисполкомз

7 проводят по предлагаемому способу. Стероидсвязывающую способность нативного транскортина измеряют по общепринятой методике с применением твердофазной адсорбции для разделения свободной и связанной транскортином форм стероида.

Предлагаемый способ обеспечивает высокую эффективность (92--95% ) иммобилизации транскортина на нерастворимо матрице и позволяет сохранить высокую стероидсвязывающую активность белка (81 — 85о/о). Такое сочетание названных параметров необычно да кс для достаточно стабильных белков.

В получаемом по предлагаемому способу препарате иммобилизованного транскортина отсутствуют примесные белки, конкурирующие с транскортином за стсроид.

Это обусловливает более высокое специфическое сродство транскортина к стерои. дам и большую удельную стероидсвязываюшую способность по сравнению с целевым продуктом, полученным по известному способу. Иммобилизованный гомо! енный транскортин мо кст храниться при 4 — б С по меньшей мере в течение 8 месяцев без изменения стероидсвязывающей способности. При получении препарата проводят на всех стадиях процссса иммобилизации операции по стабилизапии белка.

Применение в прсдлагаемом способе фосфатного буфера с рН б — 8 для растворения гомогенного транскортина, для промывки транскортин-агарозы и для последующего хранения препарата основано, во-первых, на известном факте стабильности гомогенного транскортина в этом буферс и, во-вторых, на том, что этот буфер используют при очистке транскортина до гомогенного состояния. Связывание со стероидом обеспечивает высокую стабильность белка в процессе иммобилизации, а диссоциация лиганда предотвращается введением стеронда в промывающие буферы.

Использование равных концентраций сте. роида в растворе транскортина и промывающих буфсрах обеспечивает ту же концентрацию (известную) стероида в полу5 ченном препарате. Это облегчает количественные расчеты при работе с иммобилнзованным гомогенным транскортнном.

1. Способ иммобилизации транскортина путем его растворения с последующим добавлением. в раствор активированной нерастворимой агарозы, инкубацией получен15 ной смеси и промывкой образовавшегося иммобилизованного транскортина, о т л ич а ющи и с я тем, что, с целью получения стабильного гомогенного препарата и повышения его связующей емкости, в раствор

20 транскортина перец добавлснисм и!арозы вводят стероид, агарозу и транскортин берут в соотношении 1:0,002 †:0,03, инкубацию смеси ведут в течение 3 — 24 ч при

4 — 23 С, а иммобилизованный транскортин

25 промывают фосфатным буфером при рН

6 — 8, содержащим стероид в концентрации, равной его содержанию при иммобилизации транскортина.

2. Способ по и. 1, отл и ч à Icùи йсь

В0 тем, что в качестве стероида используют кортизол в мольном соотношении с транс кортином 1:0,5 — 1:3.

3. Способ по и. 1, отл и ча ю1цийся тем, что в качествс стероида используют

:35 кортикостерон в мольном соотношении с транскортином 1:0,5 — 1:2.

4. Способ по п. 1, отличаю щийся тем, что в качестве стероида используют !!1эогесте1эон В мо;!Ьноа! соотно!1!енин с

40 транскортином 1:0,5 — 1:1.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Заявка Великобритании Ко 1348935, кл. С 07 G 7/00, 1974.