Способ получения иммобилизованных ферментов

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ путем совместной полимеризации акрильных мономеров в растворе фермента в присутствии глутарового альдегида и инициаторов полимеризации,о т л и ч а ющ и и с я тем,что, с целью повышения активности и стаби;"1ьности целевых продуктов, в полимеризационную смесь добавляют диизоцианат винной кислоты в количестве 0,25-0,5%, гексвметилендиамин в количестве 0,25-0,4% и сахарозу в количестве 20-30% от веса полимеризационной смеси и процесс ведут-при 5-10°С.2.Способ по П.1, отличающийся, тем, что используют глутаровый альдегид в количестве 0,5-1% от веса полимеризационной смеси.3.Способ по П.1, отличающий с я тем, что в качестве инициаторов полимеризации используютN, N, .N', N-тетраметилэтилендиамин и надсернокислый аммоний.(О(Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) )(51) C 12 N 11/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНЯТИЙ (21) 2624302/23-04 (22) 22.06.78 (46) 30.01.84. Бюл. 9 4 (72) А.И. Кестнер, Л.В. Гаевая, С.Н. Загребельный и Т.А. Беляева (71) Таллинский политехнический институт и Специальное конструкторско-технологическое бюро биологически активных веществ (53) 577.15.07 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР по заявке Р 2429389/28-04, кл. С 07 G/02, 1976 н/п (прототип). (54) (57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАНН61Х ФЕРМЕНТОВ путем совместной полимеризации акрильных мономеров в растворе фермента в присутствии глутарового альдегида и инициаторов полимеризации,о т л и ч а юшийся тем,что, с целью повышения активности и стабильности целевых продуктов, в полимеризационную смесь добавляют диизоцианат винной кислоты в количестве 0,25-0,5Ъ, гексаметилендиамин в количестве 0,25-0,4% и сахарозу в количестве 20-30Ъ от веса полимеризационной смеси и процесс ведут при 5-10 С.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся, тем, что используют глутаровый альдегид в количестве

0,5-1% от веса полимеризационной смеси.

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве ини- Я циаторов полимеризации используют

N,iV,Õ,Ê-тетраметилэтилендиамин и надсернокислый аммоний.

10

2О

ЗО

)5

ri0

:«П

6О

Изобретение относится к микробиологической к химической промышленности, в частности к способам получения иммобилиэованных ферментов, которые могут найти применение при получении биохимических реактивов, используемых в молекулярной биологии и генной инженерии.

Известен способ получения иммобилизованных ферментов, заключающийся в полимеризации акрильных мономеров в растворе фермента в присутствии глутарового альдегида и инициаторов полимериэации, причем в реакционную смесь добавляют порошкообразный поликарбамид в количестве 5-10Ъ с содержанием аминогрупп

0,3-0,7 миллиэквивалентов на грамм вещества и процесс ведут при комнатной температуре Г1.г.

Однако указанный способ не обеспечивает достаточно высокой абсолютной и относительной активности и стабильности получаемого продукта (ь частности иммобклизованную транс-N-дезоксирибозиллазу получают с абсолютной активностью не более

30 ед/г и коэффициентом сохранения активности не более 0,1, а после

5 дней хранения активность иммобилизовайггого фермента не превышает 20%) .

Целью изобрет-ния является повышение активности к стабильности иммобилизованного фермента.

Указанная цель достигается тем, что в известном способе в полимеризационную смесь добавляют диизоцианат винной кислоты в количестве

0,25-0,5Ъ, гексаг"етилендиамин в количестве 0 25-0,4% и сахарозу в кол. честье 20-30% от веса полимеркзациОИИОй смеси и процесс пОли .Рриза" ггии Ведут птрк 5 "" 0 С .

При осуществлении способа глутаpoBI:Ivi альдРгид испОльзуют B количе— стве 0,5 -1% от вес=- гголимеризацконной смеси, а г, качестве инициаторов

) / полимеризации — N, N г4. N-тетра";етгглЭтИЛЕНдиаМИН И НадСЕрВОКИСЛЫй 2Мг.г-ний.

Пример 1. Для полу=-ения препарата ижгобилизованной транс-N-дезоксирибозилазы (КФ 2,.4,3,8) приготовляют следующие растворы,"

1Ъ-ный раствор фермента в дистилли-рованной воде с активностью

8,000 ед.аст./IIII (за единицу ;:.;-.Ивности принимается количество фе; — .мента,.катализирующее превра:..EBHEI

1 нмоль субстрата за 1;гии прг

37 С); 50:--ный раствор мономеров в дистиллированной воде, в котором содержится 19 вес.ч. акрила,к>-=а и 1 вес.ч. N N -метиленбис"акриламида 50%-ный раствор сахарозы в дистиллированной воде; 50%-ный раствор мономеров в 50%-ной сахароэе с содержанием 19 вес.ч. акриламида

У и 1 вес.ч. N N-метиленбис-экриламида 10%-ный раствор гексаметилендиамина (ГММА) в дистиллированной воде; 10%-ный раствор диизоцианата винной кислоты (ДИЦВК) в дистиллированной воде; 10%-ный раствор надсернокислого аммония (НСА) в дистиллированной воде; 10%-ный раствор N,N,N,N -тетраметилэтилендиамина (ТЕМЕД) в дистиллированной воде.

B охлаждаемом сосуде смешивают

0,3 мл раствора фермента, 0,3 мл

50Ъ-ного раствора сахарозы 1,5 мл раствора мономеров в 50%-ной сахарозе, 0,12 мл 10%-ного раствора

ГМДА, 0,08 мл 25%-ного раствора глутарового альдегида (ГА) (фирма

"Мерк", ear), 0,13 мл 13%-ного раствора ДИЦВК, 0,23 10%-ного раствора ТЕМЕД, 0,23 мл 10%-ного раствора НСА. Конечные концентрации реагентов в полимеризационной смеси следующие,-.: мономеры 25, сахароза 30, ГМДА 0,4, ГА 0,7, ДИЦВК 0,4, НСА 0,75, ТЕМЕД 0,75, фермент 0,1. Температура полимеризационной смеси íе должна превышать +5-10 С.

Полученную смесь тщательно перешивают и выдерживают в течение

30-60 сек до образования геля.06разовавшийся блок геля измельчают до размера гранул 0,3-0,5 мл и

Оггределяют его активность по общепринятой для данного фермента методике. Получают 4 г препарата с активностью ?70 ед.акт./г вл,геля,что составляет 41:. от исходной активности, Полученный гель — фермент выдерживают при 4 С в течение 5 сут в буфере и повторно определяют его активность, которая оказывается равной 210 ед.акт./г вл. геля, что составляет 78% От исходной активности гголученного геля.

Полученные результаты показывают, что данный состав геля Обеспечивает достаточную ак ивность и,стабильВОсть преп2рат2. !::. .2гобилизованной транс †.",-дезоксирггбозилазы.

П р:: м е р 2. Иммобилкзацию ферме -2. проводят так, как зто описано в примере 1, с использованием тех же исходных растворов с изменением количества отдельных реагентов. В табл ° 1 приведены конечные концентрации компонентов полимеризационной смеси и результаты полученные при определения активности .препаратов иммобклизованного фермента.

722197

Таблица 1

Концентрация компонентов полимеризационной смеси (%) Пример

Активность фермента

ГИДА FA

НСА

ДИЦВК

% сохр.

ТЕМЕД моно- сахамеры розы исходного (ед. акт.) иммоб. (ед. акт. ) через

5 дн. (ед. акт ° ) 0,4 0,7 0,4 0,75 0,75 2,700 1,100 41 840 (78%:

0,5 0,25 0,25

1,5 — 0,25 0,25

2,700 0

2,700 362 13,4 272 (75%) 0,5

0,25 0,25 2,700 о

0,5 1,5 — 0,75 0,75 2,700

135 (21%) 0,25 — 0,25 0,75 0,75 1,550 644 43

0,5 0,5 0,75 0,75 2,700 45

1,7

0,25 0,5 0,25 0,75 0,75 2,500 1,000 40

930 (93%) ( 716 (77%) 2,400 9300 39

0,5 1,0 0,5 0,75

0,25 1,5 0,75 0,5

0,75

0,5

2, 200 780 36 523 (67%)

2, 200 780 36 530 (68%) 0,25 1,5 0,25 0,5 0,5 в этих условиях гель не образуется

Фермент вымывания из геля.

Пример 3. Иммобилизованный ферментный препарат, полученный аналогично примеру 1, применяется для получения.дезоксиаденозина из аденина и тимидина. Для этого ферментный препарат добавляют в реакционную смесь, содержащую

1,75 нмоль/мл еденина и 8,5 нмоль/мл тимидина в цитрат-фосфатном буфере

Таблица 2

10 12 16

Номер цикла

Началь ная скорость, нмоль/мин

2,46 2,61 2,36

2,175

2,6

2,415 2,35

2,6

% превращения субстрата за

90 мин

65,3

68,1

66,6

66 59,6 61

59,8

Данные табл.2 убедительно показывают стабильность и реакционноспособность полученных препаратов.

Пример 4. Иммобилизацию фосфодизстеразы проводят аналогично примеру 1, применяя в качестве

1 25 30

2 20

3 20 10

4 20 10

5 20 б 25 20

7 20 10

8 25 20

9 22,5 25

10 25 2О

11 20 30 рН 6,0. Реакцию проводят при постоянном перемешивании при 37 С.

После завершения первого цикла использования геля-фермента, его отделяют от реакционной смеси на фильтре, промывают буфером и используют в следующем цикле.

Результаты 16 последовательных циклов описаны в табл.2.

60 раствора фермента раствор фосфодиэстеразы из змеиного яда с активностью 3000 ед.акт./мл (за.единицу активности принимается такое количество фермента, которое обеспечивает прирост оптической плотности

Техред М.Тенер

Редактор Гохфельд

Корректор A Зимокосов

Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Рау аская наб, ц. 4/5

Заказ 1065/3

Филиал ППП "Патент", г. ужгород„ ул. Проектная,.4 при А 400 нм на 0,1 о.е. при гидролизе Са-бис-пара-нитрофенилфосфата за 30 мин. при 37 С. Исходное количество фермента 2.400 ед.акт. концентрация остальных компонентов полимеризационной смеси,Ъ: мономеры 25, сахароза 20, ГМДА 25, ГА 0,63, ДИЦВК 0,24, HCA 0,75, ТЕМЕД 0,75.

При этом получается ферментный препарат с активностью 220 ед,акт./r влажного геля, суммарная активность — 1,230 ед.акт, что составляет 51% от исходной активности Фермента. При хранении в течение

10 дней при 4 С иммобилиэованный 15

Фермент полностью сохраняет свою активность.

Пример 5. Иммобилизацию нуклеоэидфосфотрансфераэы из моркови проводят по примеру 1, применяя 2р в качестве раствора фермента раствор нуклеоэидфосфотрансферазы иэ моркови с активностью 1 100 ед.акт./мл (эа единицу активности принимается количество фермента, которое обеспечивает образование 1 мкмоль нуклеотида из нуклеозида и паранитрофенилфосфата за 1 ч при 3 С в растворе 0,05 М натрия уксуснокислого в 0,18 М растворе калия фосфорнокислого рН 5,2).Исходное коли-. чество фермента 550 ед.акт., концентрация остальных компонентов полимериэационной смеси,Ъ: мономеры 25, сахароза 20, ГМДА 0,24, ГА 0,63, ДИЦЕК 0,24,НСА 0,75, ТЕМЕД 0,75. При этом получается ферментный препарат с активностью

14,7 ед.акт./г влажного геля,суммарная активность 10 ед.акт, что составляет 20% от исходной активности фермента. При хранении в течение 14 дней при 4 С иммобилизованный фермент полностью сохраняет свою активность.