Способ разделения липидов рыбьегожира ha фракции

 

Союз Советских

Социалистических

Республнк

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВКДНИЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 05.04.78 (23) 2600196/28-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет (щ824054 5> > „з

G N 33/92

Государственный комнтет

СССР по делам изобретемня я открыта»

Опубликовано 23,04,81. Бюллетень N9 15 (53) УДК 615.397 (088.8) Дата опубликования описания 23 . 04 . 81

P2) Авторы изобретения

A.È. Демченко, Г.A Заварзина и Г.В. Стариков (71) Заявитель

Иркутский государственный медицинс :- 4 / (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ РЫБЬЕГО ЖИРА

HA ФРАКЦИИ

Изобретение относится к медицине ч биологии, а именно к биохимическому анализу для контрольно-аналитических и научно-исследовательских ,работ. г

Известен способ разделения липидов рыбьего жира на фракции путем нанесения его на силикагель с последующим элюированием фракций липидов оргайическими растворителями (1) .

Недостатком известного способа является низкая точность способа,что не обеспечивает полного и четкого перехода от одной фракции к другой и получаемый элюат содержит два и !5 более компонентов,.

Цель изобретения — обеспечение воэможности повышения точности способа.

Укаэанная цель достигается тем, 26 что при осуществлении способа раз» деления липидов рыбьего жира на фракции путем нанесения его на силикагель с последующим элюированием фракций липидов органическими раствори- 25 телями, силикагель предварительно обрабатывают раствором щелочи, из нанесенного .образца последовательно вначале этиловым эфиром, затем метанолом элюируют смесь нейтральных 39 липидов и фосфолипидов, после чего

2% раствором муравьиной кислоты в эфире элюируют.неэстерифицированные жирные кислоты, далее смесь элюатов нейтральных лнпидов и фосфолипидов концентрируют, помещают на силикагель, смесью гексана с диэтиловым эфиром, взятых в соотношении 98:2, элюируют фракцию эфиров стеринов, после этого теми же элюэнтами в соотношении 80:20 элюируют холестерин и дмглнцериды, из оставшегося на силикагеле адсорбата вначале диэтиловым эфиром вымывают моноглицериды, а затем смесью хлороформа и метанола в соотношении 20г80. элюируют фракцию фосфолип щов.

Способ осуществляют следующим образом.

Предварительно обрабатывают раствором щелочк снликагель, что обеспечивает высокую активность адсорбента и неэстернфнцированным жирным кислотам и необходима для отделения неэстерифицированных жирных кислот от нейтральных липндов и фосфолипидов, так как происходит связывание неэстерифицированных жирных кислот и их адсорбцня на колонке в виде .солей. Использование для промывания

824054 колонки этилового эфира и метанола позволяет элюировать нейтральные ли« пиды и фосфолипиды. Для элюирования неэстерифицированных жирных кислот, адсорбированных на силикагеле,применяют 2% раствор муравьиной кислоты в эфире. Это позволяет получить хро(матографически чистую фракцию неэсте" рифицированных жирных кислот.

Применение для элюирования фракции нейтральных липидов и фосфолипидов на второй хроматографической ко-.лонке в качестве растворителей смеси гексан-диэтиловый эфир в определенных соотношениях с возрастающей долей полярного компонента (за счет последовательного увеличения количества диэтилового эфира) позволяет получать фракции липидов со все возрастающей полярностью. Предлагаемые соотношения растворителей обеспечивают четкое разделение компонентов анализируемой смеси. Так, смесь растворителей гек-. сан-диэтиловый эфир, взятые в соотношении 98:2, позволяет выделить наименее полярную фракцию — эфиры стеринов. Промывание колонки этой же смесью растворителей, но взятой в соотношении 90:10, где увеличена доля полярного компонента (диэтилового эфира), позволяет выделить более полярную, по сравнению с предыдущей фракцией, фракцию триглицеридов. Использование же вышеуказанной системы растворителей в соотношении

80:20 еще более увеличивает полярность смеси и позволяет выделить близкие по полярности фракции холестерина и диглицеридов. Промывание хроматической колонки только,циэтиловым эфиром в количестве 100-120 мл

:позволяет элюировать моноглицериды— наиболее полярную фракцию. В последнюю очередь хроматографическую колонку промывают системой растворителей хлороформ-метанол (в соотношении 20:80), что обеспечивает выделение полярных липидов (фосфолипидов).

Пример. В качестве объекта исследования берут навеску липидов медицинского рыбьего жира в количестве 80 мг, растворяют в 2 мл хлороформа и наносят на колонку 1. Предварительно выполняют подготовку Ко лонки 1, а именно: хроматографическую стеклянную колонку диаметром 1,2 см, высотой 30 см заполняют силикагелем, предварительно обработанным следующим образом: силикагель для колоночной хроматографии обрабатывают 0,5 н. раствором едкого натра путем настаивания в течение 12 ч. Затем промывают водой до нейтральной реакции (по фенолфталеину), высушивают на воздухе и активируют при температуре

110 С в течение 12 ч. Навеску обработанного щелочью силикагеля в количестве 5 г суспендируют в 20 мл гексана и переносят в хроматографическую колонку. Для стабилизации колонки пропускают 100 мл гексана под давлением. 2 мл раствора липидов в хлороформе наносят на подготовленную щелочную хроматографическую ко:лонку и после поглощения раствора верхним слоем сорбента начинают разз )деление липидов на фракции. Вначале отделяют неэстерифицированные жирные кислоты от нейтральных липидов и фосфолипидов, пропуская через хрома тографическую колонку этиловый эфир в количестве 200 мл, который элюирует нейтральные липиды и часть фосфолипидов. Затем через колонку пропускают метанол в количестве 100 мл, который освобождает неэстерифицированные жирные кислоты от фосфолипидов.

Скорость элюирования составляет

2-3 мл в мин под давлением. Полученные элюаты, содержащие нейтральные и полярные .(Фосфолипиды) липиды, объ20 единяют и растворители отгоняют под вакуумом. Остаток липидов перерастворяют в 2 мл гексана и подвергают дальнейшему разделению на второй хроматографической колонке.

25 Неэстерифицированные жирные кислоты, адсорбировавшиеся на щелочном силикагеле в виде солей, извлекают с первой хроматографической колонки путем промывания ее 120 мл 2Ъ раст (),вора муравьиной кислоты в эфире.Затем растворитель отгоняют под вакуумом, остаток перерастворяют в минимальном количестве хлороформа (0,5 мл) и используют для дальнейшего анализа. Смесь нейтральных липидов и фосфолипидов, освобожденную от неэстерифицированных жирных кислот, подвергают дальнейшему фракционированию на второй хроматографической колонке. Подготовку второй хроматографической колонки осуществляют следующим образом: 5 r силикагеля для колоночной хроматографии активируют при 100ОC в течение 12 ч, . суспендируют в 20 мл гексана и

45 взвесь переносят в стеклянную хроматографическую колонку диаметром

1,2 см, высотой 30 см. Хроматографическую колонку кондиционируют путем пропускания 100 мл гексана.

$Q Смесь нейтральных липидов и фосфолипидов, растворенную в 2 мл гексана, полученную с первой хроматографической колонки, наносят на вторую хроматографическую колонку.

После поглощения раствора липидов верхним слоем сорбента приступают к элюированию фракций.

Вначале колонку промывают 100 мл .смеси гексан-диэтиловый эфир (98:2) под давлением так, чтобы скорость элюирования составляла 2-3 мл/мин, собирая первую фракцию на выходе из колонки. Вторую фракцию получают путем пропускания через хроматографическую колонку 120 мл смеси гексан65 диэтиловый эфир (90:10). Промывая

824054

Формула изобретения

Составитель Ю. Алмазов

Техрсд Н.Майорош Корректор М. Коста

Редактор A. Шандор

Заказ 2099/64 Тираж 907 (Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная,4 колонку 120 мл смеси гексан-диэтиловый эфир, взятых в соотношении 80г20, получают третью фракцию. Затем через хроматографическую колонку пропус кают 120 мл диэтилового эфира, собирая четвертую фракцию. В последнюю очередь колонку промывают 100 мл сме си хлороформ-метанол (20:80) и получают пятую. фракцию.

Все полученные элюаты поочередно концентрируют путем стгонки раствори теля под вакуумом и используют в дальнейшем анализе.

Для идентификации полученных фракций, их чистоты и качества разделения используют метод тонкослойной хроматографии на закрепленном 1$ слое силикагеля, испопьзуя стеклянные пластинки размером 9х12 см.

Предлагаемый способ обеспечивает .возможность повышения точности разделения липидов рыбьего жира на фрак- Щ ции, что улучшает качество и чистоту получаемых фракций.

Способ разделения липидов рыбьего жира на фракции путем нанесения его на силикагель с последующим элюированием фракций липидов органическими растворителями о т л и ч а ю щ H йс я тем, что, с целью повышения точности способа, силикагель предварительно обрабатывают раствором щелочи, из нанесенного образца последовательно вначале этиловым эфиром, затем метанолом элюируют смесь нейтральных липидов и фосфолипидов, после чего

2% раствором муравьиной кислоты в эфире элюируют неэстерифицированные жирные кислоты, далее смесь элюатов нейтральных липидов и фосфблипидов концентрируют, помещают на силикагель смесью гексана с диэтиловым эфиром, взятых в соотношении 98:2, элюируют фракцию эфиров стеринов,после-чего теми же элюэнтами в соотношении 80s20 элюируют холестерин и диглицериды, из оставшегося на силикагеле-адсорбата вначале диэтиловым эфиром вымывают моноглицериды, а затем смесью

1. хлороформа и метанола в соотношении

20:80 элюируют фракцию фосфолипидов.

Источники информацию, принятые во внимание при экспертизе

1..Кейтс М. Техника липидологии.

М., 1975, с. 121-135.