Патент ссср 826243

 

Союз Советских

Соцналистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ро826243 (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (51) М. )(Л.З (22) Заявлено: 120979 (21) 2813928/28-13 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 3004я1 Бюллетень М 16

G 01 И 33/54

Государственный комитет

СССР

flo делам изобретений и открытий (53) УДК 663.14.039. . 37 (088.8) Дата опубликования описания 30.04.81

Н.А. Константинова, B.Â. Лаврентьев, Л.В. Ковальчук и Р.В. Петров

i !

1

Второй Московский ордена Ленина государственн медицинский институт им. Н.И. Пирогова (72) Авторы изобретения,» л, !

i и (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОМПЛЕМЕНТА В КРОВИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии.

Известен способ определения комплемента в крови путем помещения терморезистора в среду, содержащуюантисыворотку с последующим пропусканием через него электрического .тока добавления исследуемой пробы, инкубации и измерения температуры реакционной среды (1).

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности.

Цель изобретения — повышение точности способа.

Эта цель достигается тем, что способ определения комплемента в крови осуществляется путем помещения терморезистора в среду, содержащую антисыворотку с последующим пропусканием через него электрического тока, добавления исследуемой пробы, инкубации и измерения темпе= ратуры реакционной среды, при этом пропускают электрический ток силой

0,5-0,01 мА и инкубацию ведут в течение 10 мин, а через 10 мин после измерения температуры среды через терморезнстор повторно пропускают электрический ток силой 10-0,1 мА затем через 10-15 мин измеряют температуру среды и по соотношению полученных показателей теплопровЬдности определяют наличие комплемента в крови.

Пример 1 ° Определение скорости связывания комплемента свежей сыворотки морской свинки с агрегированными иммуноглобулинами класса IgG.

В термостатируемую кювету заливают 1 мл раствора, предварительно агрегированной антисыворотки класса

IgG в разведении 1г4000, помещают терморезистор и включают рабочий

15 ток 0,5Ф0,01 мА.

Агрегирование антител стандартной моноспецифической антисыворотки класса IgG проводят по классической методике при 63 С в течение 30 мин

20 в ультротермостате. Раствор агрегированных антител разливают по пробиркам Видаля и с помощью физиологического раствора приготавливают нужные разведения (в данном случае разведе25 ние постоянно и равно 1:4000, что соответствует концентрации антител

0,2 ° 10 мг/мл) . Для данной марки стандартных антисывороток возможно одноразовое проведение агрегации, 30 что позволяет провести до 4000 опы82б243 тов. Неиспользуемую агрегированную антисыворотку хранят в холодильнике .при +5 С до 1 г.

Через 1-2 мин по достижении стационарного режима работы термореэистора, который характеризуется постоянным значением сопротивления равным Вр 205б Ом (контрольное значение) добавляют 0,04 мл раствора комплемента в разведении 1:100 и. фиксируют на ленте самописца изменение сопротивления терморезистора со временем. Установившийся режим работы достигается. спустя 2-3 мин с момента добавления комплемента и характеризуется определенной скоростью изменения сопротивления термо- 15 резистора R no времени

Скорость изменения сопротивления термореэистора по времени характеризует интенсивность реакции связывания комплемента с агрегированными gQ иммуноглобулинами.

Увеличивают ток до 10+0,1 мА и спустя 2-3 мин регистрируют кривую изменения R от t. Через 10-15 мин получают установившееся значение 25

R = 1420 Ом. Строят зависимость

R/В,„ от времени t для полного цикла работы терморезистора (режим термометра и прямого подогрева) . Чем больше изменение R/R по времени t, определяемое гангеноом угла наклона Пд с = тем активнее комплемент. В нашем случае tgQ = 0,47.

Пример 2. Реакция связывания комплемента данной агрегированной антисыворотки с инактированной сывороткой морской свинки.

Опыт проводят аналогично примЕру

1, но только вместо активированной сыворотки добавляют инактивирован- 40 ную сыворотку морской свинки. Для полной инактивации комплемента часть комплементарной сыворотки проо гревают в термостате при 55 С.в течение 20 мин по стандартной методике. 45

B случае добавления к агрегированной антисыворотке инактивированного комПлемента при заданных концентрациях реагента, значения сопротивления не меняется tg o(= О, что указывает на отсутствие реакции.

Пример 3. Сравнение комплементарной активности свежих сыво роток крови морской свинки, кроличьей"и человека со стандартизованной лиофилиэированной сывороткой морской свинки.

Для каждого типа сыворотки опыт проводят аналогично примеру 1. Во всех случаях разведение агрегированной антисыворотки 1:4000, разве- Я) дение комплементарных сывороток 1:100, рабочий объем кюветы 1 мл.

В таблице приведены значения скорости изменения сопротивления терморезисторз по времени Э(К/Р,)/3t=tgg при взаимодействии агрегированных иммуноглобулинов с различными по комплементарной активности сыворотками крови, Тип сыворотки Ч с

Лиофилизированная сыворотка морской с,винки

О, 2 1

Свежая сыворотка морской свинки

0,47

Свежая сыворотка кролика

0,17

Сыворотка крови. человека

0,24

Из таблицы следует, что комплементактивной сывороткой является свежая сыворотка крови морской свинки, далее сыворотка крови человека, лифилизированная сыворотка морской свинки и кроличья. Время проведения опыта не превышает 20 мин °

Пример 4. Определение комплементарной активности сыворотки крови по титрованию.

Комплементарную активность сыворотки крови животных и человека оценивают по максимальному титру, при котором еще наблюдается реакция связывания комплементарной сыворотки и агрегированных иммуноглобулинов антисыворотки класса IgG. Опыт проводят аналогично примеру 1 для растворов лиофилизированной и свежей сывороток морской свинки, свежей сыворотки крови человека и кролика.

При этом разведение антисыворотки меняют от 1:10 до 1:10, а разведение исследуемых сывороток одинаково и равно 1:50. Реакции наблюдаются еще при разведениях: для раствора лиофилизированной сыворотки крови морской свинки — 5:10 ; для свежей сыворотки морской свинки — 1:10 ; для свежей сыворотки крови человека — 1:10 ; для свежей кроличьей сыворотки — 7:10 у. Отсюда следует,,.что -по комплементарной активности исследуемые сыворотки располагаются в той же последовательности, что и в примере 3.

ПреДлагаемый способ позволя-. ет просто с чувствительностью до 1 10 8мг/мл и временем одного опыта не более 30 мин количественно охарактеризовать комплементарную активность исследуемых сыворотоке

Предлагаемый способ может быть использован в клинических лабораториях как экспресс-метод оценки врожденных и приобретенных форм дефицита комплемента.

826243

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Е. Дичинская Техред Н.Майорош Корректор М. Коста

Заказ 2368/33 Тираж 907 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

11 3035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

Способ определения комплемента в крови путем помещения терморезистора в среду, содержащую.антисыворотку с последующим пропусканием через него электрического тока, добавления исследуемой пробы, инкубации и измерения температуры реакционной среды, отличающийся тем, что, с целью. повышения точности способа, пропускают электрический ток силой 0,5-0,01 мА и инкубацию ведут в течение 10 мин, а через. 10 мин после измерения температуры среды через терморезистор повторно пропускают электрический ток силой 10-0,1 мА, затем через 10-15 мин измеряют температуру среды и по соотношению полученных показателей теплопроводности определяют наличие комплемента в крови.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

Р 376443, кл, С 12 К 1/00, 05.04 ° 73 ° е