Водорастворимые декстраны, содержащиеаминоалкильные производные тиофосфорнойкислоты для регулирования обратимойоксигенации внеэритроцитного гемогло-бина, и способ получения водорастворимыхдекстранов, содержащих аминоалкильныепроизводные тиофосфорной кислоты

 

Союз Севетских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<>833985 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 130679 (21). 2782309/23.-05 (51)М. Кл.з

С 08 В 37/02 с присоединением заявки М

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (23) Приоритет

Опубликовано 300581. Бюллетень М 20 (53) УДК 547.458 ° 5 (088.8) Дата опубликования описания 3005,81

Г.Н. Бондарев, Л.С. Исаева-Иванова, С

Г.Н. Кольцова и М.М. Ушакова

1, (. 3

Ленинградский институт ядерной физик им. Б.П. Константинова (72) Авторы изобретения.Н. Кривенкова. (71) Заявитель (54) ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ДЕКСТРАНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ АМИНОАЛКИЛЬНЫЕ

ПРОИЗВОДНЫЕ ТИОФОСФОРНОЙ КИСЛОТЫ, ДЛЯ РЕГУЛИРОВАНИЯ

ОБРАТИМОЙ ОКСИГЕНАЦИИ ВНЕЭРИТРОЦИТНОГО ГЕМОГЛОБИНА, И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ДЕКСТРАНОВ, СОДЕРЖАЩИХ АМИНОАЛКИЛЬНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ ТИОФОСФОРНОЙ

КИСЛОТЫ

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений декстрана, содержащих аминоалкильные производные тиофосфорной кислоты, представляющих собой новую группу водорастворимых декстранов, которые могут быть использованы в качестве веществ, регулирующих обратимую оксигенацию внеэритроцитного гемоглобина. 10

Наиболее близким к предлагаемым являются известные водорастворимые аминоалкильные производные декстрас

Н В

ОН г

Н ОН И R > растворимых декстранов, содержащих аминоалкильные производные тиофос25. форной кислоты обработкой диальдегнддекстрана аминоалкилсодержащими реагентами, в качестве аминоалкилсодержащих реагентов используют аминоалкильные производные тнофосфорной

З0 кислотй общей формулы НН2 †(СН )к где R — N (СНт )„NH (СНй) ЯРО НС t

m = 107-358; п = 2-25;

k = 0,2,3,5, для регулирования обратимой оксигенации внеэритроцитного гемоглобина.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения водонов, которые получают взаимодействием диальдегиддекстрана с аминоалкилсодержащими реагентами (1).

Указанные соединения растворимы в воде, но не содержат фосфатных групп необходимых для обесПечения биологической активности. цель изобретения — получение водорастворимых декстранов содержащих аминоалкильные производные тиофосфорной кислоты общей формулы

833985

Таблица2

1,00

1 61 .1,61

1,62

1, 56

1,27

1,00

1,62

1,65

1, б 7

1,68

1,80

15

25 . 15

60

1,65

1,63

1,60

0,50

1,10

1,30

1,62

1i 21

2О Оптимальный температурный интер- вал 15-30оС.

В табл. 3 приведено влияние молярности морфолинового буфера на время реакции и время диализа.

1,65

7,5

1 20

Оптимальным вариантом условия. протекания реакции является такой, при котором гидролиз S-Р-связи практически заторможен (рНьЗ), а скорость реакции .аминбгрупцы с альдегидной 3Q достаточно высокая, т.е. процентные содержания фосфора и серы максимальны и равны (так как их атомные веса близки) .

Из табл. 1 следует, что. этому З5 условию удовлетворяет рН 7,5-8. При рН(7,5 уменьшается содержание фосфора по сравнению с серой, что ука зывает на протекание побочной реакции гидролиза S-Р-связи.

При увеличении рН78, хотя содержание серы и фосфора одинаково (гидролиза нет), процент присоединенного продукта ниже, в конечном счете увеличивается время проведения реакции.

B табл. 2 показано влияние темпе- 45 ратуры на содержание в конечном продукте серы и фосфора, что также указывает на количество присоединенного аминоалкилтиофосфата.

ТаблицаЗ

0,1

0,05

0,02

3,5

36

4,5

12

0,01

Т а б,л и ц а 4

0 356 7

2 358 б

60000

2,2

2,0

2,0

2,0

1,9 3 358 б

5 . 358 6

l,7

1,9

1,9 — NH(CHg) SPO>H>, где к=0,2,3,5, и обработку проводят в 0,02 M морфолиновом буфере при рН 7,5-8 и 15300С с последующими диализом и лиофильной .сушкой целевого продукта.

В табл.. 1-3 приведены данные о влиянии рН среща, температуры и мольности буферного раствора на примере присоединения гаммафоса В=. (N — (3-амннопропил) 2-аминоэтил) тиофосфорной кислоты к диальдегиддекстрану (м,в. 20000, степень окисления 12).

Т а б л и ц а 1

Рассуждения, приведенные для данных табл. 1, справедливы и для данных табл. 2.

Из данных табл. 3 видно, что суммарное время проведения реакции и диализа наименьшие при использовании 0,02 И морфолинового буфера..

При молярности менее 0,01 М трудно поддерживать рН 7,5-8 из-эа низкой буферной емкости.

Коэффициенты m и и округляют при расчете до целых чисел.

Коэффициенты m,n,k и содержание серы и фосфора для конкретных синтезированных веществ приведены в табл. 4.

833985

Продолжение табл. 4

Образец

Молекулярный вес декстрана

Степень окисления декстрана фор ра

О 336

2 336

5,5

5,4

5,5

5,3

8 О

5,5

5,5

5,5

60000

17

336

5,6

336

322

8,1

60000

8,2

8,0

7,8

2,0

1 8

8,0

7,8

322

24

7,6

1,8

239

4ОООО

239

2,0

239

1,9

liS

5,4

5,3

239

40000

223

О.

225

225

5,3

5,3

8,2

213

О

6 40000

8,2

213

8,5

213

8,2

215

1620000

1,9

121

2,1

121

2,0

1,9

121

121

5,5

5,7

5,4

5,2

20000

5,5

5,1

113

5,3

8,0

8,1

7,8

7,9

5,3

8,0

8,4

8 i 0

8,0

113

20000

107

8

107

107

107

Условия получения образцов, указанных в табл. 4, аналогичны условиям, описанным в примерах. Граничные значения m, n, k приведены, исходя из практически синтезированных производных водорастворимых декстранов. Как видно иэ данных табл. 4, количество пришиваемого аминоалкилтиофосфата к диальдегиддекстрану определяется только количеством альличество > г-моль

-ф

r вещества

2,0

1,8

5,8

5,4

5 6

5,6

8,4

8,3

8,5

8,2

2,0

2 i 0

2,2

2,9 дегидных групп (пришивка практически одинакова для всех образцов с одной степенью окисления) и не зависит от молекулярного веса декстрана. СледоЩ вательно, способ получения аминоалкилтиофосфатдекстранов справедлив и для всех промежуточных значений m, п, Пример 1. 5 r диальдегидде65 кстрана, полученного из полиглюкина, 833985

Ы ОН

16 ф ф

Ъ Ъ

Н ОН

Ъ с м.в. 60000 и степенью окисления 4, растворяют в 60 мп 0,02 М морфолинового буФера (pH 7,5) при 20 С.

К этому раствору добавляют 0„7 r

Ю гаммафоса. (S-(И-,(3-аминопропил) 2-аминоэтил) тиофосфорной кислоты3 ..

Реакционную смесь при постоянном перемешивании выдерживают в течение

5 ч при 20 С. Затем реакционную смесь

Анализ Sg = 1, 38 10 . г-экв

-4

r вещества ®

РО = 1,38 10 г-экв

r- вещества.

Процент пришивки гаммафОса к альдегидным группам диальдегиддекстрана

81. 3S

Пример 2. 5 г диальдегиддекстрана, полученного иэ декстрана

Анализ SH = 5,40 10 r-экв

-4 г вещества °

РΠ— 5,12 ° 10 r-экв 60 вещества °

Процент пришивки цистафоса к альдегидным группам 83.

Влияние высокомолекулярных аминоалкилтиофосфатных производных дек- 65 переливают в диализный мешок объемом на 150 мл и погружают в сосуд диализатора объемом 10 л, заполиенный дистиллированной водой. Диализ осуществляют в течение 15 ч. После диализа реакционную смесь замораживают и сушат лиофильно. Получают

4,1 r диальдегиддекстрангаммафоса общей формулы

У я

CO (

I (Я Я с м. в. 20000 и степенью окисления

12, растворяют в 80 мл 0,02 М морфолинового буфера (рН 7,5) при.20 С.

К этому раствору добавляют 1,1 г цистафоса (S -(2-аминоэтил) тиофосфорной кислоты мононатриевой соли). ,Цалее, аналогично примеру 1 получают 4,3 г диальдегиддекстранцистафоса общей формулы о

Q страна на процесс обратимой оксигенации гемоглобина показано в табл. 5.

В графе 5 приведены значения парциального давления кислорода при

50%-ном насыщении им гемоглобина при разных соотношениях исследуемо10

833985

Таблица 5

50 2 в присутствии пиридоксальфосфата, мм рт.ст.

5О в присутствии аминоалкилтиофосфатдекстранов, мм рт.ст. рН

4,6.

4, 7,2

6,5

5,0

7,2

322 34

7,2

5,3

6 5

7,2

6 5

7,2.13

6,5

6,1

7Р3

7 2

6 5

8 4

7,2

6,1

7,2

6,5

6,5

7,2

336 17 0

6 5

7,2

Формула изобретения

О го образца и гемоглобина. Парциальное давление кислорода определяется спектрофотометрически на спектрофотометре Perkin-Elmer — 402 (измерения проводятся в кюветах-тоно322 24 3 10

322 24 3 30

322 24 3 200

322 24 3 200

322 24 3 200

336 17 3 40

358 6 3 30

358 6 3 25

225 11 3 30

111 6 3 30

Иэ данных графы 5 (табл. 5) видно, что при отношении количеств фосфатных групп исследуемых аминоалкилтиофосфатдекстранов и гемоглобина более 30 наблюдается увеличение величины Р о О, что характеризует уменьшение сродства гемоглобина к кислороду, т.е. исследуемые аминоалкилтиофосфатдекстраны обладают свойством регулировать обратимую оксигенацию гемоглобина. Для сравнения в графе 6 приведено парциальное давление кислорода при 50%-ном насыщении гемоглобина в присутствии известного низкомолекулярного регулятора обратимой оксигенации гемоглобина — пиридоксальфосфата. Результаты свидетельствуют, что полисахаридные производные аминоалкилтиофосфатдекстранов обладают сравнимыми регуляторными свойствами с пиридоксальфосфатом: Но пиридоксальфосфат выполняет функцию регулятора окисигенации внезритроцитарного гемоглобина только в очень узком интервале кислотности (рН 7,2), что усложняет его применение. В растворах, содержащих производное декстрана и гемоглобин, при уменьметрах в области 500-800 нм, длина оптического пути 0,5-1 см) и газохроматографически на хроматографе Perkin Elmer-900, снабженном интегратором Sip-l. шении рН с 7,2 до 6,1 (графы 7,5) значительно увеличивается величина

Р5р 01, т.е. наблюдается эффект Бора. Это очень важно с физиологической точки зрения.

Данные табл. 5 показывают, что парциальное давление кислорода в присутствии аминоалкилтиофосфатдек- страна практически не зависит от значений m, n, k.

Следовательно, можно сделать вывод, что свойством регулировать обратимую оксигенацию гемоглобина обладает вся группа водорастворимых декстранов, содержащих ковалентно

45 присоединенный аминоалкилтиофосфат.

Практически синтеэированы аминоалкилтиофосфатдекстраны с m=107-358, n = 2 — 25, k = 0,2,3,.5.

Предлагаемым способом можно по50 лучить любое высокомолекулярное производное водорастворимого декстрана с возможным сочетанием.

1. Водорастворимые декстраны, содержащие аминоалкильные производные тиофосфорной кислоты общей формулы

833985

Составитель Т. Мартинская

Техред И Асталош Корректор С. Шекмар

Редактор В. Петраш

Заказ,3996/40

Тираж 530 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4 где R — N (СН )„NH (СН ) ЯРО, Н

m = 107-358;

n = 2-25

k = 0,2,3,5, дйя регулирования обратимой оксигенации внеэритроцитного гемоглобина,.

2. Способ получения.водораство.римых декстранов, содержащих аминоалкильные производные тиофосфорной кислоты, обработкой диальдегиддекстрана аминоалкилсодержащими реагентами, отличающийся тем, что, с целью получения декстранов, содержащих аминоалкильные производные тиофосфорной кислоты, для регулирования обратимой оксигенации внеэритроцитного гемоглобина, в качестве аминоалкилсодержащих реагентов используют аминоалкильные производные тиофосфорной,кислоты общей формулы NH -(СН )„ -МН(СНд) —

-БРОШЕН,,,где 1 = 0,2,3,5, и обработку проводят в 0,02 М морфолиновом буфере при рН 7,5-8 и 15-30 С с с последующими диализом и лиофильной сушкой целевого продукта.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

Р 437774, кл. С 08 В 37/02, 1972 (прототип) .