Способ получения лейкоцитарногоинтерферона

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик ои839547

Ж

ФК АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (63) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 0604,79 (21) 2750539/28-13 с присоединением заявки ¹ 2750538/28-13 (23} Приоритет

Опубликовано 230681 Бюллетень Но 23 рц „З

А 61 К 45/02

Государственный комитет

СССР ио делам изобретений и открытий (5 j У@К 615.3 (088.8) Дата опубликования описания 230681 (72) Авторы изобретения

В.Д. Соловьев, В.И. Огарков, В..И. Иарчен

Л.A Монастырева,. A.Â. Киктенко, В.В. Парфе

И.И. Бухарова и Н.К. Преображенская

Всесоюзный научно-исследовательский инст биологического приборостроения (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТАРНОГО

ИНТЕРФЕРОНЪ

Изобретение относится к медицине, а именно к получениго лекарственнопрофилактических препаратов.

Известен способ получения лейкоцитарного интерферона заражением лейкоцитов человека вирусом-индуктором с последующей инкубацией и выделением целевого продукта .(11 .

Цель изобретения — расширение сырьевой базы.

Эта цель достигается тем, что для заражения используют. лейкоциты крови свиней и инкубируют в среде, содержащей амниотическую жидкость.

Способ осуществляется в несколько этапов.

Пример, На I этапе получают свиные лейкоциты. Для этого кровь свиней используют не позднее 3-4 ч после ее взятия от животных. Для предотвращения свертывания крови используют гепарин. Для лизиса эритроцитов кровь смешивают с четырехкратным объемом 0,83В-ного раствора хлористого аммония, 10 мин. выдерживают в холодильнике при

+40 С, затем центрифугируют при

1000 об/мин в течение 10 мин для отделения лейкоцитов от продуктов гемолиза и плазмы. Процедуру повторяют, затем осадок лейкоцитов суспензируют в среде 199 с 10% амниотической жидкости коров (МИ) до концентрации 10 млн. клеток в 1 мл.

Эти процедуры, как и все последующие операции, проводят с соблюдением правил стерильной работы.

На !I этапе осуществляют биосинтез интерферона. Для этого в суспензию лейкоцитов вносят индуктор интерферона — вирус болезни

Ньюкастла (ВБН) .вакцинный штамм

"Н" в дозе 10-100 ЦПД5 на клетку и инкубируют 18-20 ч при 37 С. Затем центрифугируют для отделения клеток от культуральной жидкости и инактивируют вирус-индуктор доведением рН жидкости с помощью 25%-ного раствора НС1 до 2,2-2,4, выдержи20 вают ее при этом рН в холодильнике при +4 С в течение 4 суток.

После инактивации рН восстанавливают до 7,2-7,4 с помощью 20%- ного раствора NaOH и сохраняют в условиях холодильника до момента определения титра интерферона.

Если в процессе биосинтеза интерферона используют прайминг-метод, то период внесением вируса-ин30 дуктора в суспензию лейкоцитов вно839547 при условии наступления полной дегенерации клеток в контрольных про.бирках с культурой ткани, не о6работанной интерференом, но инфицированной вирусом, определяют последнее разведение интерферона, защитившее клетки от вирусной деструкции. Это разведение принимают за титр интерферона и выражают его в единицах международного стандарта Б 69/19.

Средний титр свиного лейкоцитарного интерферона в культуре диплоидных клеток человека 400N.åä/ìë в том случае, если интерферон получают без применения прайминг-ме15 тода, а при использовании его10000 N.ед/мл.

В таблице представлена сравнительная характеристика свиного и человеческого лейкоцитарного интерферо20 нов.

Среда 199 с 103 АМЖ

Среда 199 с 10% сы. воротки

Лейкоциты крови

Титр Количество активности, белка, N.ед/мл мг/мл

Количество белка, мг/мл

Титр активности, М.ед/мл

7,43+0, 62 2676+298 О, 50+0, 12

Человека (трупные) 2304+404

1536+362

3328+721 0,49+0,1 3

Пуаовинные

6,52+0, 6

8,1+0,58 4835+814 0,70+0,12

1333+420

Свиньи

Предлагаемый способ позволяет получить интерферон, активный у человека, повысить качество интерферона за счет снижения содержания балластных белков и расширить сырьевую базу.

Формула изобретения

Способ получения лейкоцитарного интерферона,путем заражения лейСоставитель С. Малютина

Редактор О. Черниченко Техред С.Мигунова Корректор Ю. Макаренко

Эаказ 4584/5 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35,.Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4 сят свиной лейкоцитарный интерферон в количестве 100 ед. на 1 мл суспензии. Смесь инкубируют 2 ч при 370С, затем центрифугируют для отделения клеток от среды, клетки вновь суспензируют в свежей среде 199 с 10%-ной ANE, после чего в суспензию вносят вирус-ин:дуктор. Титр ВБН определяют предварительно в культуре куриных фибробластов. ! на f11 этапе определяют антивирусную активность. Двухкратные разведения интерфероносодержащей жидкости вносят в пробирки с трехдневной культурой диплоидных клеток человека и через 18-20 ч инкубации при 37бС в те же пробирки вносят вирус-индикатор (вирус веэикулярного стоматика ВВС, штамм "Индиана) в дозе 100 ЦПД > на пробирку.

Через 48 ч инкубирования при 37эС, коци ов крови вирусом-индуктором с оследующей инкубацией и выделеницелевого продукта, о т л и ч аю щ и и сятем,,что, с целью расширения сырьевой базы,для заражения используют лейкоциты крови свиней и инкубируют в среде, содержащей амниотическую жидкость.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

Р 297296, кл. С 12 К 5/00, 1970.