Штамм brevibacterium sp. е 531-продуцент @ -лизина

 

<ю Я2 <1о

Wl ггггцгг

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУВЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

К ЛВТОРСКОМУ СВИДЕткЛЬСТВУ (2f) 2930851/13 (22) 23.05.80 (46) 15.12.93 Бюл. Na 45-46 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов; Ливанский опытный биохимический завод

P2) Удровский ГА; Шкагале Л.Б; Далка P.Á„Æäàнова Н.И.. Гусятинер М.М„Кара-Мурза CH (Я) ШТАММ BREVIBACTERIUM Я,Е

531-ПРОДУЦЕНТ 1;ЛИЗИНА (57) 869332

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, продуцирующего

L-лизин, используемый в качестве кормовой. добавки.

Известен штамм Brevlbacterlum flavum

RC-115-продуцент (= лизина, Штамм RC-115 характеризуется потребность в аминокислотах (треонине и метио- "0 нине) .и высоким уровнем образования лизина в лабораторнык условиях. При фермеитации в колбах штамм продуцирует 2034 г/л L-лизина, в лабораторных ферментерах на мелассной среде с дробной добавкой сахарозы — 45-60 г/л =лизин. Однако в производственных условиях в ферментерах емкостью

30 и 50 м средний уровень образования лизина у штамма не превышает 25 г/л.

Помимо этого недостатком штамма RC115 является высокая зависимость образования лизина от колебаний количества . треонина и питательной среде, где источниками треонина является основное сырье — 25 меласса, а также кукурузный экстракт или заменяющие его различные гидролизаты белковых веществ. Треонин является необходимым ростовым фактором для продуцента, но его избыток в среде ингибирует 30 процесс лиэинообраэования.

Цель изобретения — получение штаммапрбдуцента L-лизина, у которого высокая способность к сверхсинтезу лизина.сохра-„ няется в производственных условиях неза- а висимо от объема ферментационных аппаратов,1л применяемого в производстве сырья, Предлагаемый штамм Brevlbacterium 40

sp. Е 531 получен путем многоступенчатой селекции иэ штамма Brivlbacterium sp. 22 Л с применением двух мутагенных факторов: раствора нитрозогуанидина (НГ) и паров диэтилсульфата(ДЭС). Селекция проведена по 45 следующей схеме: отбор на среде

НГ НГ НГ с аналогом ДЭС

22Л С 132 P Е 193 CC28 бз10

Начиная со второго этапа селекции, от6ор продуктивных штаммов вели на среде повышенным до 13% по сахару содержанием мелассы, подавляющим синтез лизина у

55 исходного штамма 22Л. На предпоследнем этапе селекции был проведен отбор мутантов, устойчивых к ингибированию аналогом лизина S-(2-аминоэтил)-(-цистеином (АЭЦ) в сочетании с треонином. B результате был получен новый штамм Brevlbacterium sp. Е

531.

Основные отличия штамма Е 531 от штамма прототипа RC-115 заключаются в более высоком уровне лиэинообразования в различных условиях ферментации и в устойчивости к аналогу лизина, что обеспечивает штамму меньшую зависимость синтеза лизина от содержания в среде треонина. Ниже приведены результаты изучения влияния аналога лизина (АЭ Ц) и треонина на рост штаммов Е 531, RC-115 и 22Л. В табл.

1 представлены данные, показывающие оптическую плотность суспензии клеток трех штаммов после 15 ч роста в минимальной среде с гомосерином (0,1 мг/мл), в которую добавлены АЭЦ и треонин в соотношении

1:1.

Как видно из табл. 1, рост штамма Е531 в меньшей степени ингибируется аналогом анализа в сочетании с треонином по сравнению с исходным штаммом прототипом RC.1 15. Из таблицы также видно, то рост нового штамма в первые 15 и значительно опережает рост двух других штаммов.

У известных аналогореэистентных штаммов продуцент лизина устойчивость роста клеток к ингибированию аналога лизина(АЭЦ) обусловлена мутационным изменением ключевого фермента синтеза лизина Р-аспартокиназы, которое заключается в том; что указанный фермент становится менее чувствительным к подавлению . его активности смесью лизина и треонина.

Определение уровня активности аспартокиназы и чувствительности фермента к ингибированию лизином и треонином проведено у нового штамма Е531 и его исходного штамма 22Л (табл. 2), Как видно из представленных в табл. 2 данных, удельная активность аспартокиназы нового штамма Е531 в 1,5 раза выше активности исходного штамма 22Л. Лизин и треонин, взятые B отдельности, не оказывают существенного влияния на активность фермента обоих штаммов, тогда как эквимолярная смесь этих аминокислот на 90% подавляет активность фермента у штамма

22Л, но только íà 55% у штамма Е531. Таким образом, ключевой фермент биосинтеза лизина у штамма Е531 характеризуется более высоким уровнем удельной активности и меньшей чувствительностью к ингибированию смесью лизина и треонина.

Эти свойства гспартокиназы являются„ очевидно, причиной более высокого уровня лизинообразования у штамма Е531 по сравнению с родительским штаммом и штаммом-прототипом RС-1 l5 ири 1>ерл ентации на среда»: с повышенным сол тпжгтнием тре869332 6 онина, В табл. 3 представлены данные, показывающие влияние добавки треонина к ферментационной среде, содержащей мелассу и кукурузный экстракт, на выход лизина после 65 ч ферментации. . Как видно из данных табл. 3, увеличение содержания треонина в среде приводит к резкому снижению продуктивности роди.тельского штамма и штамма-прототипа, У. штамма Е531 синтез лизина в меньшей степени. подвержен отрицательному влиянию треонина.

Кроме уменьшения зависимости от отрицательного действия треонина. снижение чувствительности аспартокиназы к ингибированию смесью лизина и треонина обусловливает и другое полезное свойство. нового штамма, а именно более высокую стабильность способности продуцировать лизин . Так, реверсия к дикому типу у штамма 22Л одновременно с утратой ауксотрофных свойств (потребность в гомосерине или треонине и метионине) приводит к полной утрате способности выделять лизин. В то же время прототрофнь е ревертанты штамма

Е531 сохраняют способность продуцировать в среднем 40-50 лизина от уровня . родительского штамма.

Приобретение в процессе многоэтапной селекции свойства штамма ES31 обеспечивают ему более высокий уровень продуктивности по сравнению со штаммами 22Л и RC-115. В табл. 4 приведены данные, . характеризующие уровень образования лизина у трех штаммов в лабораторных условиях на средах разного состава. Как свидетельствуют эти данные, новый штамм Е531 на всех использованных вари. антах ферментационных сред обладает более высокой способностью к лизинообразованию по сравнению с исходным штаммом 22Л, а также штаммом прототипом. Следует отметить, что повышение в среде концентрации мелассы и, соответственно, сахара не приводит к снижению уровня образования лизина у нового штамма, как это имеет место.у штамма 22Л и на вариантах сред 1 и 3- у штамма прототипа.

Стабильно высокь и уровень образования лизина характеризует штамм E531Úå только в лабораторных условиях, но и в производственных условиях при ферментации в ферментах большей емкости (50 и 100 мз).

Штамм Brevlbacterium sp. E531 депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИГенетика," и имеет регистрационный номер ЦМПМ

В-1959.

Культурально-морфологическая характеристика штамма 8 геч1bacterlum sp. E531.

Морфология клеток: клетки овальные, размером 0,5-2,0 х 0,3-1,0 мк, спор не о0разуют, неподвижные, грамположительные.

Рост на мясо-пептонном агаре. Через 7 суток роста образует округлые колонии диа-. . метром 4-4,5 мм, матовые; желтовато-кремовые; пигмент в среду не выделяют, поверхность гладкая, форма выпуклая, край

15 равный, структура однородная, консистенция тестообразная, дает равномерную суспензию в воде. При посеве штрихом через 2 сут рост умеренный, край гладкий, поверхность матовая, полная, цвет желтовато- кре20 мовый. При посеве уколом рост в глубйне агара слабый, на поверхности умеренный, Рост на минеральной среде Гловера с глюкозой, биотином; тиамином и гомосерином. На вторые сутки образует округлые ко25 лонии диаметром 1,5-2,0 мм; светло-кремовые, пигмент в среду не выде . ляет, поверхность слегка бугристая, профиль выпуклый, с несколькими

30 концентричными складками, край ровный, . структура колонии однородная, консистенция тестоабраэная, дает равномерную суспензию в воде. Рост штриха на вторые сутки умеренный, плотный, цвет светло-кремо35

Отношение к источникам углерода.

Сбраживает с образованием кислот глюкозу, сахароэу, мальтозу, фруктозу, инозит. Не образует кислот на лактозе, галактозе, ара40 бинозе, рамнозе, ксилозе,этаноле, метаноле, манните, сорбите, глицерине, дульците.

Ассимилирует, глюкозу, сахарозу, мальтозу, фруктозу, манноэу, инозитксилозу, рамнозу, этанол, укСусную кислоту, глицерин, дильцит, янтарную кислоту, сорбит.

Таким образом, новый штамм.

SrevIbacterlum sp. Е531 характеризуется высоким и стабильным уровнем образования лизи50 на в различных условиях ферментации и обладает пониженной чувствительностью к колебаниям состава питательной среды, что при промышленном применении штамма должно

-способствовать. повышению стабильности

55 производственного процес а и увеличить объ-. ем продукта с существующих производственных мощностей на заводах отрасли, производящих 1=лизин.

Использование штамма Brevlbacterium са FR. t1 ппхееаип на i лолнмъ» их nnuMc max

869332

Пример 1. Культуру штамма дующего состава, ; меласса — 12,0; гидроВгеч!Ьассег!оа sp. Е351, выращенную при лизат БВК вЂ” 8.0, мел — 2,0; гидрофосфат

30 С в течение 1 сут на мясо-пептонном аммония — 0,1; рН среды 6,8-7,2. Колбы.по-, агаре, петлей засевают в колбы емкостью мещают на круговую качалку и выращивают

750 мл, содержащие по ЗЬ Мл посевной сре- 5 посевной материал в течение 21 с при ЗООС. ды,следующего состааа, $: меласса — 8,0; . Приготовленным посевным материалом объегидролизат белково-витаминного концент- мом 1 л засевают 2,5 м стерильной посевной з .рата (БКВ) - 11,0: рН среды — 7.0. Колбы средытогожесостава,помещеннуювферменпомещают. на круговую качалку и выращива- „теремкостью5м . Ферментероборудован бар. ют посевной материал в течение 21 ч при ботером для распределения воздуха и

30ОС.. рубашкой для охлаждения. Выращивание кульГотовымпосевнымьгатериалом(по2мл) туры в ферментере проводят при 3032 С в засевают колбы емкостью 750 мл. содержа-;течение 21 ч с непрерывной азрацией.(2-3 м з щие по 20 мл ферментационной среды сле- 15: воздуха в мин). дующего состава.. $: меласса 24.0; Выращенной культурой объемом 2,5 мз гидролизат БВК -. 6,0. хлоридаммония — 2,5 засевают 30 .м ферментационной среды, гидрофосфат калия -0,2: мел - 1;0; рН сре- .. приготовленной в ферментере емкостью 50 ды 7,0. Фермейтационная среда, разлитая в м .. Ферментер оборудован барботажным колбы, перед посевом стерилизуется.авто- 20 воздухораспределением. Ферментационная: клавированием. После посева колбы уста- среда имеет следующий состав, : меласса— н вели ва ют на к pyro вую качал ку и:: 26,0; гидролизат БВК-4.5;.хлорид аммония— инкубируют при 30ОС; Через 66 ч после на- 1,2, мел -О,?; гидрофосфат аммония -0,1," рН чала ферментаЦии в культурной жидкости .. среды 6.8-7,2устанавливаютамиачной водой; накапливается L-лйзин rr. концентрации 47,1 25 Ферментацию проводят при 30-32 С с непрег/л (по монохлоргидрату), В этих условиях рывной азрацией (28-36.i воздуха в 1 мин). при йспользовании штамма RC-115 накап- . Через 22 ч после начала ферментации к фер-. ливается 3 .6 г/л L-лизмина. .. " - . ментационной среде добавляют 2 т стерилиП р и м е.р 2, Культуру Штамма 30 зованной мелассы. После 8, ч ферментации

:Brevlbacterlum sp, Е531 выращивают, как пОка- . концентрация L-лизина в культурной жидкоэано в примере 1, в посевной:среде, имеющей сти составляет 49 г/л. состав, ф меласса.-8,0;,кукурузный экстракт- Пример 5. Посевной материал штам6,0; хлорид аммония — 1,0; рН среды 7,0., ма Brevlbacterium sp. Е531 готовят по приГотовый посевной материал (по 2 мл)ф5 мер,у 4. Ферментацию . проводят в используют для посева ферментационной 1:. ферментере емкостью 50 м оборудованным среды, отовленнбй по примеру 1, н0 аэратом типа диффузор. После 60 ч ферменсодержащеи Ъместо гидролиэата BBK,куку- тации концентрация L-лизина в культурной рузный экстракт в концентрации 4 :. Услло- . жидкости составляет 42 г/л. вия ферментации те же, что и описанные а 40 Пример 6. Посевной материал штампримере1.Черезббчпосленачалафермен- . ма Brevfbacterium sp, Е531 объемом 5 м тации в культурной жидкости накапливае1- готовят по примеру4. Ферментацзию провося L-лизин в. койцентрации 46,0 г/л.: В этих дят в ферментере емкостью 100 м с контакусловиях при использовании штамма ИС- тным устройством массопередачи тина

115 накапливается 38,4 г/л (: лизина.. перфорированных тарелок, В ферментер

Пример 3; Приготовление посевного помещают 60 м ферментационной среды, .мвтериаЛа штамма Brevibacterlum sp. Е531 и имеющей состав, как указано в примере 4, условия ферментации те же, что в примере 2, но концентрация мелассы составляет 28 . но в составе ферментации среды вместо куку- 50 . Ферментацию проводят. при 30-32 С с неруэного экстракта содержится гидролизат прерывной азрацией (55-66 м .воздуха в 1 хлопкового шрама в концентрации 8,0, Через, мин). После 40 ч ферментации концентра65 ч после начала ферментации. в культурной ция К-лизина составляет 45 г/л. жидкости образуется L-лизин в концентрации Штамм Brevlrracterlum sp. Е531 в отли38,9 г/л. В этих условиях при использовании. 55 чии от известных характеризуется устойчиштамма RC-115 образуется 18,1 г/л L-лизина. востью к $-(2-аминозтил)-цистенну и

fl.р -и м е р 4. Культуру штамма + высоким уровнем образования лизина, до

Brevlbacteiiurrr sp. E531, выращенную при 49 г/л а производственных. условиях. фер3pоС в течение суток на мясо-пептонном ментерахбольшей емкости. агаре, петлей засевают в колбы емкостью 759 (56) Авторское свидетельство СССР мл, содержащие по 70 мл посевной среды сле- . N. 671384, кл, С 12 0 13/О6 1nV

° Ь

869332

Таблица 1

Таблица 2 х) Активность фермента выражена в к активности в отсутствие аминокислот.

Таблица 3,5

Влияние добавки,треонина на уровень образования лизина

Таблица 4

Сравнительная характеристика способности к образованию лизина у нового штамма Е531 и штаммов 22Л и RC-115 в лабораторных условиях (колбы емк. 750 мл, объем среды 20 мл, продолжительность ферментации: вар. 1,2-68 ч, вар. 3,4-90ч}

869332

Продолжение табл.

*) Гидролизат хлопкового шрота.

**) Гидрализат БВК.

Составитель М.Ларина

Техред М.Моргентал Корректор С. Лисина

Редактор О,Колосова

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3349

Производственно-издагельский комбинат "Патент", г. Ужгород. Ул.(ага(.и з. 101

Формула изобретения

Штамм Brevibacterlum sp. Е 531 (депонирован в Центральном музее промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов г.Москвы, регистрационный номер ЦМПМ В-1959)-продуцент !=лизина.