Способ получения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы

 

(19)SU(11)873686(13)A1(51)  МПК ⁵    _{C12N9/02C12N9/02, C12R1:26}(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк авторскому свидетельствуСтатус: по данным на 17.12.2012 - прекратил действиеПошлина:

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способам получения очищенных ферментов, в частности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы. Известен способ получения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, предусматривающий культивирование бактерий на питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол в качестве источника углерода, дезинтеграцию клеток с получением бесклеточного экстракта, хроматографическую очистку и концентрирование ферментного препарата. В качестве продуцента в известном способе используют бактерии рода Pseudomonas, бесклеточный экстракт перед хроматографической очисткой обрабатывают сульфатом стрептомицина, сульфатом аммония, а хроматографическую очистку ведут на сефадексе G-150 и ДЕАЕ-агарозе. Недостатками способа являются невысокая удельная активность полученного препарата глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, составляющая 160-170 ед/мг белка, а также многостадийность процесса очистки. Цель изобретения - повышение активности конечного продукта и упрощение процесса. Указанная цель достигается тем, что по способу получения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, предусматривающему культивирование бактерий на питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол в качестве источника углерода, дезинтеграцию клеток с получением бесклеточного экстракта, хроматографическую очистку и концентрирование ферментного препарата, культивируют штамм Methylomonas sp. 79, a хроматографической очистке подвергают непосредственно бесклеточный экстракт, при этом проводят аффинную хроматографию на Blue sepharose CL-6B. Способ осуществляют следующим образом. Штамм Methylomonas sp. 79 выращивают на питательной среде, содержащей метанол в качестве источника углерода и минеральные соли. Штамм Methylomonas sp. 79 (коллекционный номер института ВНИИгенетика ЦМПМ-В-1985) выделен из активного или целлюлозно-бумажного производства и имеет следующую характеристику. Грамотрицательные бесцветные подвижные палочки с одним полярным жгутиком. Средний размер клеток 0,5х2,0 мкм. Колонии на минеральной агаризованной среде с метанолом в качестве источника углерода и энергии - округлые, выпуклые, бесцветные, гладкие, до 1 мм в диаметре, край ровный, структура однородная, консистенция вязкая. Спор и капсул не образует, не имеет сложных внутриплазматических мембранных структур. Облигатный метилотроф, использует метанол в качестве источника углерода и энергии, не способен к росту на средах с полиуглеродными и другими одноуглеродными субстратами, не нуждается в витаминах. Источниками азота служат соли аммония или нитраты. В присутствии 0,5%-ного метанола в среде гидролизует крахмал, клетчатку не разрушает, сероводород и индол не образует, желатину не разжижает, дает отрицательные реакции на тесты метиловый красный и Фогес-Проскауэра, Каталазо-, уреазо-, оксидазоположителен. Облигатный аэроб, нитраты восстанавливает до нитратов. Оптимальная температура для роста 35^оС, оптимальное значение рН среды 7,0. Использует метанол гексулозофосфатным путем (вариант Энтнера-Дудорова). После культивирования клетки отделяют от среды центрифугированием, разрушают с помощью ультразвукового дезинтегратора, из дезинтегратора белки экстрагируют буферным раствором. После центрифугирования белковый бесклеточный экстракт хроматографируют на Blue Sepharose CL-6B. Применение этого сорбента позволяет исключить предварительную обработку бесклеточного экстракта, сократить время очистки, повысить выход целевого продукта и его удельную активность. После хроматографии препарат концентрируют обычными методами. Выход глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы по отношению к бесклеточному экстракту 60-70%, удельная активность препарата более 300 ед/мг белка. П р и м е р. Methylomonas sp. 79 выращивают в ферментере с рабочим объемом 60 л на среде следующего состава, г на 1 л среды: KH₂PO₄ 2,0; NaCl 0,5; (NH₄)₂SO₄ 2,0; MgSO₄ 0,025; FeSO₄ 0,01; метанол 5,0. рН среды доводят до 7,0 10%-ным раствором NaOН. Температура выращивания 35^оС, скорость перемешивания 300 об/мин, аэрация 0,5 объема воздуха в минуту на 1 объем среды. После культивирования клетки собирают на сепараторе АСГ-3М. Все дальнейшие операции проводят при +4^оС. В качестве буферного раствора используют 0,05 М трис- HCl-буфер, рН 7,0, содержащий 10^-4 М дитиоэритритола (буфер А). Клетки (100 г) разрушают на ультразвуковом дезинтеграторе MSE (20 кГц, 3х1 мин), белки экстрагируют буфером А и гомогенат-дезинтеграт центрифугируют (20000,40 мин). Бесклеточный экстракт наносят на колонку с Blue Sepharose CL-6B (30 мл) и элюируют градиентом концентрации хлористого натрия (0-0,5 М) в буфере А. Далее глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу осаждают, добавляют сульфат аммония до 70% -ного насыщения. Осадок растворяют в буфере А, обессоливают и к полученному препарату для стабилизации фермента добавляют глицерин до 50%. Выход глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 70%, удельная активность 325 ед/мг белка. Описанный способ позволяет упростить процесс очистки и получить активный препарат глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы с высоким выходом (60-70%), используют в качестве источника углерода и энергии для выращивания продуцента дешевое непищевое сырье - метанол.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ, предусматривающий культивирование бактерий на питательной среде, содержащей источники азота, фосфора, минеральные соли и метанол в качестве источника углерода, дезинтеграцию клеток с последующим получением бесклеточного экстракта, хроматографическую очистку и концентрирование ферментного препарата, отличающийся тем, что, с целью повышения активности конечного продукта и упрощения процесса, культивируют штамм Methylomonas. sp. 79, а хроматографической очистке подвергают непосредственно бесклеточный экстракт, при этом проводят аффинную хроматографию на Blue Sepharose CL=6В.