Способ выявления распределения гуанилатциклазы в тканях
Союз Советскнк
Социалнстнчаских
Республик
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВ ТИЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 08.0280 (21) 2879203/28-13 (51Ж Кл.
С 12 Й 1/42 с присоединением заявки М—
Государственный комитет
СССР ио делам изобретений н открытий (23) Приоритет
Опубликовано 301081. Бюллетень Ио 40
Дата опубликования описания 301081 (53) УДК 612. 017. 13
:591.473(088.8) (22) Авторы изобретения
В.A.Øàõëàìoâ, Т.Г. Бархина и М.Н.Ляпин (21) Заявитель
Научно-исследовательский институт морфологии человека
Академии .медицинских наук СССР (54 ) СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ГУАНИЛАТЦИКйАЗЫ
В ТКАНЯХ
Изобретение относится к медицине, а именно к цитохимии, и может быть использовано для электронно-микроскопического выявления гуанилатциклаэы.
Известен способ выявления распределения гуанилатциклазы в тканях (1) .
Однако такой способ позволяет получить только количественный анализ определения активности фермента и не обеспечивает воэможности локализации и органной специфичности гуанилатциклазы в клетке в норме и патологии.
Цель изобретения — повышение точности способа и упрощение era, укаэанная цель достигается тем, что при осуществлении способа выявления распределения гуанилатциклазы в тканях последние инкубируют при температуре 30-34 С в течение 5055 мин в среде, содержащей &О мМ трисмадеатного буфера,13-14 мМ rmoкозы, 1-2 мМ теофиллина,0,1-0,5 мМ
ГТФ и 4 мМ Ва (МОЗ)1, затем йх обезвоживают, заливают s эпоксидную смолу и проводят электронную микро- скопию, Способ осуществляют следующим образом.
Проводят фиксацию в 1%-ном глютаральдегиде на О, 05 М какодилатном буфере с 4,5%-ной глюкозой 1ч при комнатной температуре,рН фиксатора — 7,4.
Промывают в 0,05 М какодилатном буфере с глюкозой в течение 1 сут.
На следующий день производят отбраковку материала для оптимального инкубирования материала.
Инкубацию осуществляют при + 30
+ 34 С в течение 50- 55 мин (оптимальная прсдолжительность инкубации).
Для оптимизации выявления фермен15 та были испробованы 6 вариантов инкубационной смеси.
В табл. 1 представлены материалы оптимизации температурного режима и время инкубации.
20 С помощью табл.2 установлено, что для определения активности гуанилат циклазы в различных органах необходим определенный вариант.
Инкубационная смесь включает,мМ: трисмалеатный буфер 80 глюкоза 13 теофиллин 1-2
Мпе 1 0,1-0,5
ГТб 0,1-0,5
30 Ва(но% )
876715
Таблица 1
Время инкубации, мин
30 40
Температура
) 50
° 20
Фермент не Фермент не выявляется выявляется
Слабая реакция выявления фермента слабая реакция выявления фермента
Фермент не выявляется
Слабая реакция выявления фермента
Фермент не выявляется
Фермент не выявляется
Слабая реакция выявления фермента
Слабая реакция выявления фермента
Оптимальная реакция выявления фермента
Реакция неравномерная
Слабая реакция выявления фермента
Слабая реакция выявления фермента
Слабая реакция выявления фермента
Гиперреакция
Гиперреакция
Слабая реакция выявления фермента
Слабая реакция выявления фермента
Слабая реакция выявления фермента
Гиперреакция
Гиперреакция
Реакция неравномерная
Реакция неравномерная
Слабая реакция выявления фермента
Реакция неравномерная
Гиперреакция
Гиперреакция
Реакция неравновыявления фермента
Слабая реакция выявления фермента
Кроме предлагаемой инкубационной смеси, применяется инкубационная смесь, в состав которой помимо укаэанных компонентов входит еще Май -азид натрия, который является специфическим активатором гуанилатциклазы. 1Iocле удаления азида натрия иэ инкубационной смеси активность гуанилатциклазы возвращается к норме.
Для оптимизации выявления фермента с помощью активатора гуаннлатциклазы азида натрия были испробованы также 6 вариантов инкубационной смеси, которые приведены в табл.3.
Например, для оптимального выделения фермента в клетках тонкого кишечника, печени и поджелудочной t5 железы млекопитающих необходим 1Ч вариант инкубационной смеси, для оптимального выявления фермента в клетках легких и сердца — IT вариант.
Теофиллин .вводят в инкубационную Щ смесь для ингибации фосфодиэстараэы (ФДЭ что способствует увеличению уровня цГМФ в клетке, необходимого для активации катализа ферментативной реакции ГТФ или гуанилилмидодифос-2g фат — специфический субстрат выявления гуанилатциклаэы. Ва(ЙОЭ) — маркер выявления фермента.
После инкубации производят быструю промывку материала в 0,08 M трисмалеатном буфере.
Дриофиксацию в 1% 0 04 на 0,05 М какодиалатном буфере с глюкозой (рН=7,4) проводят в течение 1 0о
I.
1,5 ч при 4 С, промывку — в 0,05 М какодилатном буфере с глюкозой (pH=7,4) .
Дегидратацию осуществляют в ацетонах возрастающей крепости (30, 50, 70, 96 о, 100 ) и заливают в смесь опона с аралдитом.
Предлагаемый способ .при исследовании кусочков ткани иэ некоторых органов млекопитающих (тонкого кишечника, сердца, легких, печени, поджелудочной железы ) позволяет определить строгую специфичность локализации гуанилатциклазы, а также установить ее видовую и органную специфичность, выявление гуанилатциклазы поможет вскрыть механизмы активации фермента как в физиологических, так и в некоторых патологических состояниях, что является черезвычайно важным моментом в расшифровке проблем молекулярной биологии.
876715
Таблица 2
Вариант смеси
Содержание компонентов, мМ
Sa(NO> ) Реакция выявления фермента
13
0,5 0,1
13
0,5 0,3
0,5 0,5
13
0,1 0,1
13
0,1 0,3
13
Слабая реакция во всех органах
Фермент не выявляется
13
0,1 0,5
Содержание компонентов, мМ
MnCI ГТФ
Вари ант смеси
РЬ (NOq)g NaN g
Трис- Глюко- Теофилмалеат- за лин ный буфер
0,1.0,5
Нет
0,5
8 0
If 80
0,5 0,3
Трисма- Глюкоза леатный буфер
Теофиллин MnCI ГТФ
Фермент не выявляется
Оптимальная реакция для клеток сердца и легких Слабая реакция во всех органах
Оптимальная реакция для клеток тонкого каучука, поджелудочной железы, печени
Таблица 3
Реакция выявления фермента
Оптимальная реак ция для клетой сердца и легких
876715
Продолжение табл. 3.
Содержание компонентов, мМ т
Реакция ,выявления фермента
Вариант смеси
Трис- Глюко- Теофил- Mn 01 ГТФ РЬ(ЙО ) Май малеат- эа лин ный буфер
I!I 80
Слабая реакция во всех
0,5 0,5 органах
80
0,1 0,1
0,3 0,3
Слабая реакция во всех органах 80
0,5 0,5
vI 80 и 4 мМ Ва(ИО Э) затем из обезвоживают, заливают в Эпоксидную смолу и проводят электронную микроскопию.
Источники информации принятые во внимание при экспертизе
1. Schultz G., Ha rdman J.G. et all
А new enzymatic assay for guanosine
3 5-cyciic monophosphate and its ap" р1ication to the ductus refe rens of
the rat. Proc. Nat1. Acad. Sci, 0SA, 1973, т. 70, Р 6, с. 1721-1725.
Формула изобретения
Составитель В.Малютина
Техред H.Añòàëoø, Корректор. Л., Бокшан
Редактор Н.Безродная
Заказ 9515/32 Тираж 531 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/
4/5
Филиал ППП "Патент" г. Ужгород, ул. Проектная, g °
Способ выявления распределения гуанилатциклазы в тканях, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа и упрощения его, ткани инкубируют при темпе- 4р ратуре 30-34 С в течение 50-55 мин в среде, содержащей 80 мМ трисмалеатного буфера, 13-14 мМ клюкозы, 1-2 мМ теофиллина, 0,1-0,5 мМ ГТФ
Оптимальная реакция для клеток пищеварительной системы
