Способ определения активности гидролаз

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗО6РЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советски н

Социалистических

Респубиии (iii 873121 (61) Дополнительное к авт. саид-ву (22) Заявлено 20,08.79 (21) 2816457/23-04 с присоединением заявки М— (23) Приоритет— (81)М. Кл.

G 01 и 31/14

С 12 и 9/16

С 12 и 9/24

С 12 01/42 (53) УДК 543.87:

: 577.152 (088.8) 9кударетеанвй квинтет

СССР

IIo делам нэебретеннй н открытей

Опубликовано 15 10.81 Бюллетень М 38

Дата опубликования описания 15.10.81 (72) Авторы изобретения

Ю. Ю. Кулис, В. И. Разумас и А. А. Малинаус (71) Заявитель

Институт биохимии АН Литовской CCP (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ

ГИДРОЛА3

Изобретение относится к определению активности гидролиэирующих ферментов (гидролаз), и может быть применено в биохимии и в медицине для определения активности этих ферментов.

Известен спектрофотометрический или флуоросцентный способ определения активности гидролизирующих ферментов, заключающийся в регистрации скорости образования хромофорных или флуорофорных продуктов (1).

Однако этот способ не применим для непро- т0 зрачных сред, кроме того, требует дорогостоящей аппаратуры.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности гидролаэы, в частности, щелочной фосфатазы, заключающийся во взаимодействии в буферном растворе фермента с субстратом, представляющим собой органический эфир фосфорной кислоты, и определении количества высвобождающегося в ходе реакции свободного фосфата спектрофотомет. рическим путем в присутствии специфических реагентов. По полученным спектрофотометрическим данным — величине оптической плотности — судят об активности ферментаРЗ.

Недостатком данного способа является невозможность определения активности в непрозрач. ных и окрашенных средах, а также то, что он включает дополнительную процедуру спектрофотометрического определения продукта реакции в присутствии дополнительных реагентов.

Данный способ не поддается автоматизации. .Целью:изобретения является упрощение процесса и обеспечение возможности определения активности в непрозрачных и окрашенных средах.

Поставленная цель достигается способом определения активности гидролаз, заключающимся во взаимодействии фермента с субстратом, представляющим собой органический эфир, образующим в результате реакции пирокатехинион или п-аминофенолят-ион, и определении количества последних в присутствии электрохимического преобразователя при потенциале анода

0,18 — 0,3 В путем измерения тока. По скорости нарастания тока судят об активности фермента.

873121

Обычно в качестве гидролаз используют щелочную фосфатазу или Р-глюкозидазу, в первом случае в качестве субстрата обычно используют моноортофосфат пирокатехина или моноортофосфат и-амийофенола 018 — 2 мм, а в качестве буферного раствора -- 0,1 — 0,2 М трис-НСт, буфер, содержащий 0,01 — 0,02 М MgSO4, во втором случае в качестве субстрата обычно используют P-D-глюкозид и-аминофенола 0,18 — 3 мМ, а в качестве буферного раствора — 0,1 — 0,2 М ацетатный буфер.

В качестве щелочной фосфатазы обычно используют также ферментативные системы интактных клеток Е coli (т.е. щелочную фосфатазу, содержащуюся непосредственно в упомянутых клетках), при этом в качестве субстрата используют моноортофосфат пирокатехина в количестве 0,18 — 3 мМ, а в качестве буферного раствора — 0,1 —. 0,2 М трис-HCI буфер, содержащий 0,01 — 0,02 М MgSO4.

Существенными отличиями способа являются: использование в качестве субстрата эфира, образующего в результате реакции пирокатехинион или п-аминофенолят-ион, определение количества последних в присутствии электрохимического преобразователя при потенциале анода

0,18 — 0,3 В путем измерения тока, а также то, что об активности фермента судят по скорости нарастания тока.

На чертеже изображен электрохимический . преобразователь.

Для осуществления способа применяют электрохимический преобразователь, состоящий из платинового анода, электрода сравнения и вспомогательного электрода (см..чертеж), Потенциал анода подбирают в интервале 0,18 — 0,3 В, 35 в зависимости от конкретной системы.

Способ включает следующие операции: растворение субстрата в буферном растворе, погру. жение в упомянутый раствор электрохимического преобразователя, введение в раствор определяемой гидролазы, наложение напряжения, измерение тока.

Пример 1. Для определения активности щелочной фосфатазы берут 0,1 М трис-НСЕ, 0,01 М MgSO4 буфер, который содержит 2 мМ 45 моноортофосфат пирокатехина или 1 мМ моноортофосфат п-аминофенола, рН вЂ” 8,0,25 С.

В раствор погружают электрохимический преобразователь и вводят пробу щелочной фосфатазы.

Если в качестве субстрата применяют моноор- 5О тофоефат пирокатехина, потенциал анода yci.анавливают 0,3 В относительно Ag/ÀgCÐ электрода, если в качестве субстрата применяют моноортофосфат — n-аминофенола, потенциал анода устанавливают 0,18 В относительно Ag/AgCÑ электрода. Регистрируют увеличение тока во времени. Скорость увеличения тока прямо пропорциональна гидролазной активности. Измерение занимает 1 — 3 мин (см, табл. 1 и 2).

Измерение активности щелочной фосфатазы в присутствии в качестве субстрата моноортофосфата пирокатехина приведено в табл. 1.

Измерение активности щелочной фосфатазы в присутствии в качестве субстрата моноортофосфата и-аминофенола приведено в табл. 2.

Пример 2. Для определения активности

Р-глюкозидазы берут 0,1 М ацетатный буфер, который содержит 1,5 мМ P-D-глюкозид и-аминофенола рН вЂ” 4,7, температура 25 С. В раствор погружают электрохимический преобразователь и вводят пробу определяемой Р-гликозидазы. Потенциал анода устанавливают 0,3 В. относительно Ag/AgCE электрода. Регистрируют увеличение тока во времени. Скорость увеличения тока прямо пропорциональна гидролазной активности. Измерение занимает 1 — 3 мин.

Измерение количества Р-глюкозидазы приведено в табл. 3.

Регрессионный анализ результатов определения показывает хорошие совпадения результатов предлагаемого способа с известными спектрофотометрическими способами, коэффициенты кор- реляции для пример6в, приведенных в табл. 1, 2 и 3, равны соответственно 0,9998, 0,9989, 0,9999.

Пример 3. Для определения активности щелочной фосфатазы непосредственно в интактных клетках Е.соб берут 0,1 М трис-HCC

0,01 М MgSO4 буфер, содержащий 2 мМ моноортофосфат пирокатехина, рН вЂ” 8,0, при 25 С.

В раствор погружают электрохимический преобразователь и вводят пробу определяемой гидролазы. Потенциал анода устанавливают 0,3 В относительно Ag/AgCB электрода. Регистрируют увеличение тока во времени. Скорость увеличения тока прямо пропорциональна гидролазной активности. Измерение занимает 1 — 3 мин. Определение активности щелочной фосфатазы непосредственно в интактных клетках Е. со5 приведено в табл. 4.

Из табл. 4 видно, что.наблюдается строго линейная зависимость между количеством клеток и определяемой ферментативной активностью, Пример 4. Зависимость скорости увеличения тока преобразователя от концентрации ферментов описывается Михаэлисовской зависимостью. Зависимость скорости увеличения тока от концентрации субстратов устанавливают при концентрации щелочной фосфатазы по обоим субстратам 0,026 ед/мл, рН 8,0, в 0,1 М трис-НСт„0,01 М MgSO4,25 С. Потенциал анода для моноортофосфата и-аминофеиола 0,18 В относительно Ag/AgCÂ электрода. Концентрации Р-глюкозидазы по Р- Р- глюкозиду и- а миноф енола

0,018 ед/мл, рН = 4,7, в 0,1 М ацетатном буСкорость изменения тока

I преобразователя, нА/мин

Количество щелочной фосфатазы, 10", ед/мл

3,66

2,6

5,0

5,2

6,71

7,8

8,0

10,4! 1,6

13,0

15,6

13,0

12,66

19,33

23,4

Скорость изменения тока преобразователя, нА/мин

Количество щелочной фосфатазы, 10 ед/мл

2,6 .2,3

7,8

20,7

13,0

39,3

23,4

Количество р-глюкозидазы, 10 ед/мл

Скорость изменения тока преобразователя, нА/мин

3,7

0,73

7,4

1,53

14,5

2,6

22,3

3,4

37,0

6,5

5 873121 6 фере, при 25 С. Потенциал анода 0,3 В относи- ти увеличения тока от концентрации субстрата тельно Ag!AgCg электрода, Зависимость скор.:с- в присутствии гидролаз приведена в табл. 5.

Таблица 1

873121

Таблица 4

Количество клеток в см

Скорость изменения тока преобразователя, нА/мин

4,6 ° 10

9,2 10

13,8 10

18,4 10

23 10

1,47

2,87

4,5

595

7,3

Таблица 5

Щелочная фосфатаза р- Глюкозидаза р- D- Глюкоэид аминофенола

Моноортофосфат и-аминофенола

I нА/мин С, мМ нА/мин С, мМ нА/мин С, MM

38 0,17

44,7 0,2

46 025

52 033

62,3 0,5

63,7 1

0,2

14,33

0,25

15,6

0,33

21,53

0,5

29,33

2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве гидролазы используют щелочную фосфатазу, в качестве субстрата используют моноортофосфат пирокатехина или моноортофосфат и-аминофенола 0,18 — 3 мМ, а в качестве буферного раствора — 0,1-0,2 М трис-НСь буфер, содержащий 0,01 — 0,02 М MgSO4

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что в качестве гидролазы используют

Р-глюкозидазу, в качестве субстрата используют P-D-глюкозид и-аминофенола в количестве

0,18 — 3 мМ, а в качестве буферного раствора

0,1 — 0,2 М ацетатный буфер.

4. Способ по и. 2, отличающийся тем, что используют щелочную фосфатазу, содержащуюся непосредственно в интактных клетках Е. со!!,при этом в качестве субстрата используют моноортофосфат пирокатехина 0,18 —

1. Способ определения активности гидролаз, 4 включающий взаимодействие фермента с субстратом, представляющим собой органический эфир„ в буферном растворе и определение количества образующихся в ходе реакции продуктов, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса и обеспечения возможности определения активности в непрозрачных и окрашенных средах, s качестве субстрата используют эфиры, образующие в результате реакции пирокатехин-ион или п-аминофенолят-ион, количественное определение последних осуществляют в

-присутствии злектрохимического преобразовате ля при потенциале анода 0,18 — 0,3 В путем из мерения тока и по скорости нарастания тока судят об активности фермента, Моноортофосфат пирокатехина

Формула изобретения

1,16 0,29

1,78 „0,29

2,33 0,17

2,6 2,33

2,8 4,66

21 93

8 312

Составитель О, Скородумова

Техред, А.Савка Корректор С Шекмар

Редактор П. Коссей

Заказ 9023/69 Тираж 910 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 мМ, а в качестве буферного раствора—

0,1-0,2 М трис-НСе буфер, содержащий 0,01—

002 М Мц$04 °

Источники информации, принятые во внимание при эксцертизе

1 Н И. Р:".".-теуе;. ".5lethods of Епзугпабс

Analisis /= .:.: —;:к;; —:-:i;; Press, И вЂ” Y, London, i965, 783.

2. Eibl H,. Ф!!Пагп Е. M. Lands, "A new

Sensitike Determination of Phosphate", Anal.

В ос ;ег. ЗЙ",;.; ". Г I 5? (прототип).