Способ регенерации растений клевера in viтrо

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

<>888861 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (51)м. к .з (22) Заявлено 230580 (21) 2929693/30-15

A 01 G 7/00 с присоединением заявки ¹(23) ПриоритетГосударственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий

Опубликовано 15.1281. Бюллетень Н9 4б

Дата опубликования описания 15.12.81 (53) УДК 581.143. .б (088.8) — -. - f fggp f g

t. . т а

«д (72) Авторы изобретения

A.B. Мезенцев и Л.A. Любавина

".з

Всесоюзный ордена Трудового Красного Знамени научно- "--.. / исследовательский институт кормов им. В.P. Вильяма (71) Заявитель (54) СПОСОБ РЕГЕНЕРАЦИИ РАСТЕНИЙ КЛЕВЕРА

iN ViTRO

Изобретение относится к сельскому хозяйству и может быть использовано в селекции и семеноводстве растений, в частности в селекции на клеточном уровне и для ускоренного размножения и оздоровления селекционного материала, в исследованиях по фитопатологии, физиологии и генетике растений.

Известны способы регенерации растений из клеток суспензионных культур клевера белого (Тг1йобхшп repens

Ь.) и люцерны .(наиболее близкого к клеверу рода семейства бобовых).

В соответствии с этими способами 15 регенерацию растений осуществляют посредством получения каллусов из проростков клевера белого и листьев люцерны на агаризованных питательных средах с последующей дезинтеграцией 20 каллусной ткани на клетки и клеточные агрегаты в жидких питательных средах, размножения образовавшихся клеточных популяций и формирования дифференцированных структур (почки, эмбриоиды), а затем растений-регенерантов (1) и

- (2).

Однако эти способы оказались неприемлемыми для клевера лугового (Trifafium pratense (. ), что связано 30 со специфическими требованиями каждого вида растений к условиям, способствующим регенерации. Кроме того, получение каллусов из проростков приводит к потере исходных форм и затрудняет оценку селекционного материала.

Известен также способ регенерации; растений клевера лугового из каллусной ткани, полученной из листовых эксплантатов, на агаризованных питательных средах (3) °

Однако этот способ неприменим для клеточной селекции и не позволяет получать большое число регенерантов в расчете на 1 эксплантат (в среднем получают 25 растений).

Целью изобретения является увеличение выхода регенерантов.

Поставленная цель достигается тем, что каллусы получают из листьев посредством культивирования эксплантатов на модифицированной агаризованной среде В, в которую дополнительно вводят итаконовую кислоту. каллусную .ткань помещают в жидкую среду В5 с кинетином и повышенной концентрацией тиамина — HC8 а образовавшиеся клеточные суспензии кульлюминесцентном освещении 8-10 тыс.лк и при фотопериоде 16 ч/сут темпео I ратуре 22 1 С и относительной влажности воздуха 80+10Ъ до образования растений с 6-7 листьями. Часть тройчатых листьев используют для получения каллусов, а растения с оставшимися 2-3 листьями высаживают в почву.

На листочках, предназначенных

fQ для получения каллусов, делают ряд надрезов вдоль жилок, помещают на питательную среду В, в которую дополнительно вводят 6000-8000 мг/л агар — агара или бактоагара, 200300 мг/л нитрата аммония и 2-4 мг/л итаконовой. кислоты, содержание сахарозы увеличивают до 25000

30000 мг/л, железа (II) сернокислого (FeS04 7 Н О} до 70-100 мг/л, трилона Б (Иа ЭДТА) zo 90-130 мг/z и вносят следующие фитогормоны:

2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д) 5-6 мг/л, кинетин 6-10 мг/л и 4-нафтилуксусную кислоту (НУК)

0,1-0,5 мг/л, рН среди доводят до

25 .5,8-6,0.

Состав среды В (Gamborg et аЕ., 1968) при РН 5,5 представлен в табл. 1.

Т а б л и ц а 1

Витамины, мг/л

Сахароза, мг-/л

Микроэлементы, мг/л

Микроэлементы, мг/л

2500 МпБО Н О

20000.10

KNO

Тиамин — HC8

150 Н RO

НаН РО -Н О (NH ) SO

NgS0g- 7Н20

CaC(, - 2Н О

FeSO 7Н 0

Na ЭДТЛ

Трилон Б

134 Na МоО ; ZH>0 0,35

100

0,025 Миоинозит

0,025

250 СиБ04 5НХО

150 СоС 2 . бН20

28 KI

37.1-ивируют в жидкой среде В без горЯ монов, сформировавшиеся в суспензий проэмбриоиды культивируют на агаризованной среде В без гормонов до .образования эмбриогенной ткани, проростков и растений-регенерантов.

Причем итаконовую кислоту вводят в агаризованную модифицированную среду Гамборга В в количестве

2-4 мг/л, Содержание тиамина — НСВ в жидкой среде Гамборга В составляет 2025 мг/л.

Количество кинетина в жидкой среде Гамборга В составляет 0,20,8 мг/л.

Способ осуществляется следующим образом.

Семена культивируемых сортов и гибридов клевера лугового обрабатывают 30 мин в концентрированной серной кислоте (скарификация и стерилизация), затем промывают стерильной дистиллированной водой до нейтральной реакции и выдерживают в течение

20-28 ч в темноте при 22+1 C. Наклюнувшиеся семена помещают íà агаризованную среду В с уменьшенной вдвое концентрацией всех входящих в нее .компонентов (1/2 В ) и инкубируют в закрытых прозрачйых сосудах при

Материал инкубируют 12-14 дней при непрерывном освещении люминесцентными лампами (освещенность 8,010,0 тыс ° лк), температуре 22+1 С и относительной влажности воздуха

95:г.5Ъ .

В случае появления на листочках бактериальной или грибной инфекции их удаляют с частью прилегающей к ним питательной среды.

Образовавшиеся каллусы используют для получения клеточных суспензий, помещая их в жидкую питательную среду Р с 0,2-0,8 мг/л кинетина и

20-25 мг/л тиамина - НС, (на каждый мл среды v«orят 15-25 мг каллусНикотиновая кислота 1

Пиридоксин — HCe 1 ной ткани). Материал инкубируют на встряхивающих аппаратах с числом колебаний 100-125 мин при освещенности 3-4 тыс. лк и температуре

24+2 С. Через 8-10 суток суспензии субкультивируют путем добавления к 3-5 объемам свежей среды без гормонов 1-го объема суспензии. Через

2-3 недели в суспензии образуются проэмбриоиды (незрелые соматические зародыши), которые пересаживают на агаризованную среду 1/2 В> без .гормонов. Через 8-10 суток из проэмбриоидов образуется эмбриогенная ткань, которуа пассируют на свежую среду того же состава. После 12-14 дней культивирования масса переса.кенной

888861 ткани увеличивается в 14-16 раз, и в ней развиваются проростки, которые через 2-3 недели образуют растениярегенеранты. Разросшуюся эмбриогенную ткань субкультивируют с 10-12дневным интервалом с целью получения новых проростков. В конце каждого цикла выращивания образовавшиеся проростки переносят на агаризованную среду 1/2 В без гормонов. Через

2-3 недели из проростков формируются растения-регенеранты с 4-5 листьями и корнями. Регенеранты пересаживают в почву и выращивают 14-16 дней под прозрачной синтетической пленкой (для предотвращения десикации), а затем в обычных условиях. 15

Пример. Проводили регенерацию растений из клеток суспензион-Т а б л и ц. а 2

Отношение средних масс каллус/эксплантат

Процент эксплан татов, образовавших каллусы

Исходный материал

Средняя масса

Одного эксплантата (листочка) одного каллуса

Без ита- С итаконоконовой вой кисло кислоты той (3 мг/л) Без итако- С итаконовой кис- новой лоты кислотой (3 мг/л) 80

Листья растений

53 0 б, 45+0, 14 342 24, 4 530+10, 0

82,2

Листья регенерантов (листья взяты с регенерантов перед высадкой в почву) 91,7

3t60+0i17 180+17юб 330+18с7

50,0

98 эмбриогенную ткань. В этой ткани через 2 недели сформировались проростки, а затем растения-регенеранты. Разросшуюся эмбриогенную ткань пересаживают с 10 дневным интервалом на свежую среду 1/2 В . В конце каждого цикла выращивания в ткани формируются новые проростки (по 150 шт на 500 мг пересаженной ткани), которые переносят на среду того же состава. Через 2 недели проростки образуют растения-регенеранты с

4-5 листьями и корнями. Последние высаживают в почву и выращивают 2

55 недели под полиэтиленовой пленкой, а затем в обычных условиях. Полученные растения-регенеранты свободны от фитопатогенной инфекции, нор мально ростут и развиваются, цветут и завязывают семена. Весь процесс регенерации от получения каллусов до высадки растений-регенерантог в почву занимает в среднеи три месяца. Выход регенерантов в расчете на 1 эксплантат (листочек) составРазность между вариантами с итаконовой кислотой и контролем без итаконовой кислоты достоверна при

P < 0,01.

Полученные каллусы помещают в жидкую питательную среду с 0,5 мг/л кинетина и 20 мг/л тиамина из расчета 20 мг ткани на 1 мл среды и инкубируют на аппарате АВУ-1 (аппарат универсальный для встряхивания жидкости в колбах и пробирках) при 100-125 колебаниях в минуту и амплитуде колебаний 20-30 мм. В течение 8-10 дней из каллусов образуются суспензии, содержащие в среднем 300 тыс. клеток/мл.

Для получения проэмбриоидов из клеток суспензионных культур к 4 объемам свежей среды без гормонов добавляли 1 объем суспензии. Через

2 недели в суспензии сформировались зеленые проэмбриоиды (10 штук в каждом мл среды), которые после пересад. ки на среду без гормонов образовали ных культур клевера лугового сорта

ВИК-7. При этом получены следующие результаты: 80% листовых эксппантатов на среде с тремя фитогормонами:

5 мг/л 2,4-Д + 8 мг/л кинетина

+ 0,5 мг/л НУК и итаконовой кислотой (3 мг/л) через 2 недели образуют каллусы со средней массой 530+10 мг.

Итаконовая кислота (ненасыщенная двухосновная карбоновая кислота

НООС-CH -С-СООН является продуктом

2 1

CHg обмена веществ некоторых плесневых грибов, например AspergiNUJ tacon|cus, в культуре тканей используется впервые) стимулирует интенсивное развитие каллусов у растений сорта

ВИК-7 и у полученных из этого сорта регенерантов (табл. 2).

888861

Формула изобретения

Составитель Г. Бростюк

Редактор Л. Плисак Техред А.Ач Корректор Г. Orap

Заказ 10789/2

Тираж 703 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал IIIIII Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ляет: без субкультивирования эмбриогенной ткани - 7 тыс. растений, а при 2-кратном субкультивировании—

1 млн.

Использование изобретения позволяет быстро размножать и оздоравливать селекционный материал, обра батывать мутагенами многочисленные клеточные популяции и проводить эффективный отбор ценных генотипов методами клеточной селекции, получая из отобраннЫх форм растения-регенеранты.

1. Способ регенерации растений клевера in vitro включающий получение каллусов на агаризованной питательной среде с последующей пересадкой их в жидкую питательную среду для выращивания клеточных суспен-зий с последующим получением из них дифференцированных структур и расте ний †. регенерантов, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения выхода регенерантов, в качест ве агаризованной питательной среды используют модифицированную среду

Гамборга В с итаконовой кислотой, образовавшйеся каллусы переносят в жидкую среду Гамборга В с повышенной концентрацией тиамина - НС8, в которую в качестве фитогормона вводят кинетин, полученные клеточные суспензин пересаживают в жидкую среду

Гамборга В без гормонов, а образовавшиеся из клеток лроэмбриоиды выращивают на агаризованной среде

Гамборга В без гормонов с регулярным субкультивированнем образовавшейся нз них амбриогенной ткани и пере4 садкой сформировавшихся в этой ткани проростков на среду Гамборга В- без гормонов.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что итаконовую кислоту вводят в агаризованную модифицированную среду Гамборга В в количестве 2-4 мг/л.

15 3. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что содержание тиамина-НС8 в жидкой среде Гамборга В составляет 20-25 мг/л.

4. Способ по п. 1, о т л и ч а юЩ шийся тем, что количество кинетина в жидкой среде Гамборга В составляет 0,2-0,8 мг/л.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Т.Н. Овха И et ag. Caee us апй

p8ant0et regeneration from ceM сиИагез of 5 adino сВочег and soyЬеап - Physio . Plant, p. 39, 129 134, 1977.

2. Авторское свидетельство СССР

9 721036, кл. A 01 H 3/00, 1978.

3 ° Авторское свидетельство СССР

Р 721035, кл. A 01 Н 3/00, 1978 °