Способ определения активности l-глутаматдекарбоксилазы в биологической пробе

 

Союз Советских

Социалистических

Респубини

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22)Заявлено 09.07. 79 (21) 2818417/28-13 с ярисоединеииен заявки М (23) Прнорнтет—

Опубликовано 15. 02. 82 Бюллетень М 6

Дата опубликования описания 17.02. 82 (51) М. Кл.

С 12 и 9/14 (аеудвретваивый кенитет

СССР аа делен изабретеиий и открытий (53) УЙК 6И.015.. 1(088. 8 ) (72) Авторы изобретения

В. К. Поздеев и А. П, Ильин

Ордена Трудового Красного Знамени науч оисследовательский институт экспериментальной медицины ЛНН СССР (7l) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ 6 -ГЛУТАМАТДЕКАРБОКСИЛАЗЫ

В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОБЕ

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для диагностики и контроля за рез.-льтатами лечения заболеваний нервной системы.

Известен способ определения активности в -глутаматдекарбоксилазы в биологической пробе путем гомогенизации ее в фосфатном буфере с последующим внесением в гомогенат пиридоксальфосфата и глутаминовой кислоты,инкубации его, о обработки кислотой, отделения образовавшегося осадка и добавления нингидрина (1 .

Однако известный способ не обеспечивает высокой точности и чувствитель15 ности способа.

Цель изобретения — повышение точности и чувствительности способа.

Эта цель достигается тем, что в способе определения активности E-глу10 таматдекарбоксилазы в биологической пробе путем гомогенизации ее в фосфатном буфере с последующим внесением в гомогенат. пиридоксальфосфата и глутаминовой кислоты, инкубации его, обработки кислотой, отделения обра зова вше гося, осадка и аобая п ния нингидрина, гомогенат после инкубации обрабатывают хлорной кислотой, далее смесь нейтрализуют, после отделения осадка супернатат хроматографируют на катионообменнике, имеющем В о сшивки, о затем последовательно элюируют цитратным буфером с концентрациями 0,2 и

0,35 н.и после добавления в элюат нингидрина его колориметрируют.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

100 мг ткани мозга гомогенизируют в Na-фосфатном буфере рН 6,4, содержащем тритон Х- 100 и меркаптоэтанол.

Затем часть гомогената термостатируют с пиридоксальфосфатом, далее добавляют к; глутаминовую кислоту и повторно термостатируют. Остановку энзи- матической реакции и одновременно депротеинизацию смеси осуществляют добавлением хлорной кислоты. Центри3 90 фугированием отделяют денатурированные белки, снижают кислотность су" пернатата до рН 2,2 гидратом окиси калия„Выпавшие перхлораты калия удаляют центрифугированием,а супернатат загружают на аналитическую колонку с катионитом в Мй -форме. Затем элюируют, вначале цитратным буфером рН 4,25 для снятия с ионообменника кислых и нейтральных аминокислот, а затем цитратным буфером рН 5,28 для выделения пика ГАИК на 1 7- 18 мл. Гаммааминомасляная кислота ГАМК определяется нингидриновым методом. Количество ГАМК, образовавшееся в процессе энзиматической реакции, определяют путеM Bblчит ания ГАМК, находящейся в гомогенате ткани до энзиматической реакции.

П р и и е р 1. 100 мг ткани головного мозга, полученной во время операций у людей или после декапитации животных, по возможности мгновенно помещают в алюминиевой фольге или стеклянной кювете на холод (B сухой лед );

Выделенные для исследования кусочки ткани в замороженном состоянии быстро взвешиваю и затем гомогенизируат в стеклянном микрогомогенизаторе на ледяной бане при 0 С в

0,025 н. фосфатном буфере рН 6,4,содержащем 1ь три она X-100 и 1,5 мМ меркаптоэтанола. На 100 мг ткани берут для гомогенизации 1 мл буфера.

Затем берут две порции гомогената по 0,107 мл (этот объем содержит

10 мг ткани ) в две пробирки. Одна пробирка предназначена для определения фонового содержания ГЛМК в 100 мг ткани, другая — для проведения энзиматической реакции. В каждую пробирку приливают по 1,9 мл 0,025 н. фосфатного буфера рН 6,4, содержащего

li тритона Х-!00, 1,5 мМ меркаптоэтанола и 0,42 мМ пиридоксальфосфата.

Затем пробирки термостатируют при

37 С в течение 20 мин при постоянном встряхивании. S этот период происходит насыщение глутаматдекарбоксилазы кофактором.

Далее в фоновую пробивку приливают 0;15 мл 8 н.НС10,1, и 0,5 мл 1 М фосфатного буфера рН 6,4, содержащего 80 дФ/мл глутаминовой кислоты, встряхивают и оставляют при комнатной емпературе.

В другую пробирку приливают только 0,5 мл 1 М фосфатного буфера

1Î !

35 ло

45 рН 6,4, содержащего 80 H/èë глутаминовой кислоты, встряхивают и инкубируют повторно при 37 С в течение

30 мин для проведения энзиматической реакции. Энзиматическую реакцию останавливают добавлением 0,15 мл 8 н

НС1С!Ф. После этого обе пробирки центрифугируют 20 мин при l0000 g для осаждения денатурированных белков. Надосадочную жидкость количественно переносят в чистые пробирки и рН смесей доводится до 2,2 с помощью 0,1 мл

10 н КОН и 0,3 мл 1 и КОН под контролем рН-метра. Выпавшие в осадок перхлораты центрифугируют при OоС и

10000 g 10 мин.

Надосадочную жидкость осторожно собирают и помещают в аналитическую колонку с Аминекс f15-S в Na -форме, уравновешенную 0,2 н цитратным буфером рН 4,25 (объем ионообменника

О,бх8 см). Хроматографию осуществляют при 50 С. После полного всасывания надосадочной жидкости начинают элюцию 15 мл 0,2 н цитратного буфера рН 4,25 под давлением 1-2 атм (скорость элюции 60 мл/ч). Эта элюция снимает кислые и нейтральные аминокислоты, но ГАМК остается на ионообменнике. Этот элюат выбрасывают. Затем на колонку помещают 0,35 н цитратный буфер рН 5,28, Этот элюат собирают фракционно по 1 мл, пик fAMK выходит на l7-l8-ом мл элюции (т.е. на 23-ем мл второй элюции).

После этого в каждую пробирку, содержащую по 1 мл элюата, приливают по 0,5 мл нингидринового реагента, накрывают алюминиевым колпачком и

20 мин нагревают на кипящей водяной бане После охлаждения пробир к до комнатнои температуры в них добавляют по 2 мл 50ã.-ного раст вора этилового спирта и колориметрируют при

540 нм (на фотоколориметре устанавливают зеленый фильтр).

Активность глутаматдекарбоксилазы рассчитывают по количеству ГАМК,образовавшейся в результате энзиматической реакции в лМ/г ткани за 0,5 ч.

Калибровочные опыты выполняют следующим образом.

B 1 мл 0,2 н. цитратного буфера рН 2,2 на колонку помещают 0,3,иИ

ГАМК и по вышеописанной схеме выполняют хроматографию. Колебания величин экстинкций в разных калибровочных опытах в пределах 11.

5 905283

А кт и вност ь ГДК в,и, М/ г т кани ГАМК, образовавшейся за 0,5 ч энзиматической реакции равна:

E . 001

Активность

ГДК,,саМ/г ткани ГАМК за 0,5 ч

Экстинкция

После энзиматической реакции

Структура мозга онового опыта

Варольев мост

0,04 О, 145

3,56

0,088

0,19

3,46

Средний мозг

Мозжечок

0,07

0,19

4,07

0,038

0,047

0,042

О, 185

5,0

Передний мозг

Продолговатый мозг

Гипоталамус

0,2

5,2

0,21

5,7

0,06

0,24

6,1

Стриопаллидарная система

0,08

0,62

18,3

0,062

Целый мозг

0,26

6,7 где Г - экстинкция пика ГАМК, полученная после энзиматической реакции; экстинкция пика ГАИК в фоновом опыте;

Гиппокам, миндалина и височная доля структуры объединены) В отличие от известного предлагаемый способ при той же чувствительности более специфичен, не требует специального помещения, оборудова45 ния и меченых реактивов, которые не только дороги и требуют осторожности в работе, но и потому, что биохимические реакции с их использованием идут йначе, нежели в естественных условиях.

Предлагаемый способ не зависит от колебаний температуры и давления, по сравнению со способами определения активности ГДК по выделению газообразного СОт, объем которого находится в прямой зависимости от этих величин.

О, 3 — количество )АМ ГАИК, помещаеиое на колонку в калибровочных опытах; б» - средняя экстинкция пика

ГАМК, получаемая в калибровочных опытах;

0,0 1 - количество ткани в г, взятое для энзиматической реакции.

Данные предлагаемого способа ак- . тивности глутаматдекарбоксилазы в различных о"ластях головного мозга белых крыс f K» - 0,88) представлены в таблице.

Предлагаемый способ позволяет определять не только активность

ГДК, но и то количество ГАИК (продукта этой реакции), которое присутствует в ткани в свободном гостоянии. Это позволяет делать черезвычайно важные выводы об интенсивности функционирования ГАМК- ер ги чес кой медиаторной системы.

Предлагаемый способ недорог, относительно прост, доступен, безвреден, использует широко распространенные отечественные реактивы и оборудование, не требует специального помещения и дополнительной подготовки персонала, потому может быть внедрен как в экспериментальную биологию, так и s практическое здравоохранение.

9052

Формула изобретения

Способ определения активности (- глутаматдекарбоксилазы в биологической пробе путем гомогенизации ее в фосфатном буфере с последующим внесением в гомогенат пиридоксаль- 1О

Фосфата и глутаминоеой кислоты, инкубации его, обработки кислотой, отделения образовавшегося осадка и добавления нингидрина, о т л и ч а lo шийся тем, что, с целью повыше,ния точности и чувствительности спо83 8 соба, гомогенат после инкубации обрабатывают хлорной кислотой, далее смесь нейтрализуют, после отделения .осадка супернатат хроматографируют на катионообменнике, имеющем 83 сшивки, затем последовательно элюируют цитратным буфером с концентрациями

0,2 и 0,35 н, и после добавления в элеат нингидрина его колориметрируют

Источники информации, принятые во внимание при зксперТ.изе

1. Ьоие 1.Р. Pobins Е Egerman G.S.

"Thy fiuorimetric measerment of plu-

tamic decarboxylase and its distri-

bition in brain" 3, of Neurochem, 1958, т. 3,N 1, с. 8-18.

Составитель С, Иалютина

Редактор Н. Кишт линец Техред С..Мигунова

М. Коста

Подписное

Заказ 292/38 Тираж 504

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

)ДОЯ Москва, Н-Я Раушская наб. д. 4/g

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4